專利名稱：一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及南荻ariarrAeaa lutariorqmia L. Z 基于胚性愈傷的組培快 繁技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，它適應(yīng)于以南荻幼穗 為外植體通過愈傷誘導(dǎo)途徑獲得幼苗，以及增值、生根、馴化與移栽。
背景技術(shù)：
國內(nèi)關(guān)于芒屬植物的組培快繁技術(shù)，在20世紀(jì)90年代就有相關(guān)報道，他們分 別采用了幼葉、下胚軸、幼根，幼穗作為外植體進行芒屬植物的快繁技術(shù)，但其出愈率和分 化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但未獲得胚性愈傷。另外，在2005年也有關(guān)于芒 屬植物組培快繁技術(shù)的報道，利用了莖稈扦插技術(shù)得到了幼苗，但是這也是利用的器官發(fā) 生途徑，也沒得到胚性愈傷。而本研究是利用幼穗為外植體得到了胚性愈傷，再繼續(xù)誘導(dǎo)分 化、成苗并移栽。因此，本研究不僅達到了快速高效的繁殖南荻的目的，同時為南荻的轉(zhuǎn)基 因操作提供了可靠的組培體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，方法易 行，操作簡便，且分化出愈率和成苗率很高，本方法胚性愈傷出愈率較高，愈傷再誘導(dǎo)生苗 率較高，組培苗馴化移栽后，成活率高，適用于南荻種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的快速擴繁，也適用于 南荻的轉(zhuǎn)基因操作。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
南HTriarrhena lutariorqmia L. Ζ. Λ/ )是中國特有的和本科植物，原產(chǎn)于中國 長江流域、伴生于蘆葦叢中的高大草本植物，植物學(xué)分類歸屬禾本科、芒屬。南荻種中有多 個變種和變型，主要分布在河流、湖泊、沿海灘涂水陸過度地帶，在洞庭湖醫(yī)自然群落面積 很大，植物群落密度高，形如一片片竹林，適應(yīng)水漲水落生境，具有水土保持、固提防洪，凈 化水體、空氣，維護自然生態(tài)系統(tǒng)等作用。它具有C4植物高光效、生長快速、耐濕耐早的特 性。大面積人工栽培可成為工農(nóng)業(yè)原料生產(chǎn)基地和旅游觀光景點；建立人工生境濕地，在 園林綠地或濕地可作觀賞植物少量種植。另外，南獲莖稈是重要的造紙原料，其莖稈纖維細(xì) 胞含量為43% 65%，平均長度約3m，最長纖維達6. 8 m，長寬比值平均為182. 5，中部為 209.4，產(chǎn)量和質(zhì)量均優(yōu)于蘆葦、麻類、毛竹、楊樹和柳樹，是一種非常優(yōu)質(zhì)的造紙原料。本 發(fā)明基于上述南荻的優(yōu)良特性和巨大的應(yīng)用價值，開發(fā)出一種獲得南荻無菌幼苗的快繁體 系，在此基礎(chǔ)上可以培育出更加優(yōu)良的南荻品種，為改善南荻的品質(zhì)和豐富其種質(zhì)資源打 下基礎(chǔ)。本發(fā)明的內(nèi)容包括以南荻幼穗為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷的初代培養(yǎng)基，生苗繼代培養(yǎng)基，以及幼苗的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，其步驟是
(1)幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗，幼穗內(nèi)種子尚未形成，中軸也比較軟，還沒形成基本的分支。(2)用初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先 用75% (體積比，以下相同)酒精消毒25-35s，然后用0. 1% (質(zhì)量體積比，以下相同)氯化汞 浸泡(3-5)分鐘，再用無菌水沖洗2-4次，將其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(初代誘導(dǎo)培 養(yǎng)基是指為獲得無性繁殖系所采用的接種外植體的培養(yǎng)基)上。經(jīng)過(30-35)天的初代誘 導(dǎo)，獲得胚性愈傷。培養(yǎng)條件為24-28°C，每天光照14-16個小時(采用人工光源照射)，光 強為2000LX。初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以下配方選其一 A =MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-2mg/L，2， 4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl-5mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L或B :MS培養(yǎng)基附加激動素 KTl-4mg/L, 2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl_3mg/L，6 水氯化鎂 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L， PhytagelR 3g/L。采用這兩種培養(yǎng)基中的任何一種培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出狀態(tài)良好的胚性愈傷 組織，生長10天左右在幼穗基部開始出愈，開始愈傷為透明狀白色，隨著培養(yǎng)時間的增長 在愈傷的表面逐漸長出白色或淡黃色愈傷，且有少部分愈傷上面有紫色小點。(3)用生苗培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培 養(yǎng)基上繼代生苗，(30-35)天繼代一次，增殖系數(shù)為2-3。培養(yǎng)條件為24-28°C，每天光照 14-16個小時(采用人工光源照射)，光強為2000LX。所述的生苗培養(yǎng)基配方為以下配方選 其一 A =MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl_3mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L 或 B =MS 培養(yǎng)基附加激動素 KTl_2mg/L，2,4 二氯苯氧乙酸 2，4-D01_2mg/L， 6水氯化鎂MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。將胚型愈傷轉(zhuǎn)到其中任何 一種生苗培養(yǎng)基之后2-4天，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，6-8天開始分化出芽，9-11天即可形成小幼苗。(4)用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)所生幼苗在在生根誘導(dǎo) 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)(25-30)天，生根率達40%以上。培養(yǎng)條件為24-28°C，每天光照 14-16個小時(采用人工光源照射)，光強為2000LX。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以下配方選其一 A 1/2 MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-3mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-DO. 5_2mg/L，蔗糖30g/L, PhytagelR 3g/L 或 B =MS 培養(yǎng)基附加激動素 KTl_3mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-DO. 5_2mg/ L，蔗糖30g/L，活性炭3-8g/L，PhytagelR3g/L。將長到10-15厘米的幼苗轉(zhuǎn)到任意一種生 根培養(yǎng)基上，大概5天左右幼苗就會分化出大量白色或黃色的根，且根系發(fā)達。(5)馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長健壯的、株高在5-6厘米 的組培苗移栽到由沙子組成的馴化苗圃中馴化。每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水， 大約15 - 20d后，視幼苗長勢，即可移栽到苗圃中。溫室條件為15°C _25°C，照明使用鹵光， 光照14-16個小時(采用人工光源照射)個小時，光照強度為2000LX。獲得了大量健壯的南 荻幼苗。本發(fā)明建立基于胚性愈傷的南荻組培快繁體系，增值率比較高(2-3倍)，增值穩(wěn) 定，根系健壯，移栽成活率較高，是適于商業(yè)擴繁南荻的成熟技術(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果
1、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，消毒方法簡單，且效率高，初代污染率幾乎為零。2、本發(fā)明得到的愈傷繁殖率高，約為1000%。3、本發(fā)明一次得到了組培快繁和轉(zhuǎn)基因下游技術(shù)體系，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因工作打下基 石出。


圖1為一種南荻愈傷示意圖。此圖為南荻誘導(dǎo)的愈傷圖，從圖中可以看出，愈傷表面有白色或者淡黃色愈傷，基 部愈傷稍有水漬狀。圖2為一種南荻幼苗示意圖。此圖為南荻胚型愈傷轉(zhuǎn)在分化培養(yǎng)基上長出的幼苗。圖3為一種南荻馴化移栽示意圖。此圖為南荻幼苗的訓(xùn)話移栽到沙土中的圖片。
具體實施例方式實施例1
一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，其步驟是
1、幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗，幼穗內(nèi)種子尚未形成，中軸也比較軟， 還沒形成基本的分支。2、初代誘導(dǎo)(誘導(dǎo)初代培養(yǎng)基)將其剪成2或3厘米小段，先用75%酒精消毒25 或28或30或33或35s，然后用0. 1%氯化汞浸泡5分鐘，再用無菌水沖洗三次，將其接種 在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。經(jīng)過30天的初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷。培養(yǎng)條件為25°C，每 天光照16個小時(采用人工光源照射)，光強為2000LX。誘導(dǎo)初代培養(yǎng)基為A :MS培養(yǎng)基附 加激動素 KTl-2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L。生 長10天左右在幼穗基部開始出愈，開始愈傷為透明狀白色，隨著培養(yǎng)時間的增長在愈傷的 表面逐漸長出白色或淡黃色愈傷，且有少部分愈傷上面有紫色小點。3、生苗繼代培養(yǎng)(生苗培養(yǎng)基)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上 繼代生苗，30天繼代一次，增殖系數(shù)為2-3。培養(yǎng)條件為25°C，每天光照16個小時(采用人 工光源照射)，光強為2000LX。生苗培養(yǎng)基配方為A:MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl-3mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。將長勢良好的胚型愈傷轉(zhuǎn)到 生苗培養(yǎng)基之后3天左右，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，7天左右開始分化出芽，10天左右即可形成5厘 米左右小幼苗，30天左右長至15厘米左右。4、生根誘導(dǎo)(生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基)所生幼苗在在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘 導(dǎo)生根，培養(yǎng)30天，生根率達40%以上。培養(yǎng)條件為25°C，每天光照16個小時(采用人工光 源照射)，光強為2000LX。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為A =IA MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-3mg/L，2， 4 二氯苯氧乙酸2，4-DO. 5-2mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。將長到10-15厘米的幼苗 轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，大概5天左右幼苗就會分化出大量白色或黃色的根，且根系發(fā)達。5、馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長健壯的、株高在5-6厘米的組培苗移栽到由沙子組 成的馴化苗圃中馴化。每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15 d后，視幼苗長勢， 即可移栽到苗圃中。溫室條件為20°C，照明使用鹵光，光照16小時，光照強度為2000LX。本發(fā)明解決技術(shù)問題的方案分以下步驟完成
(1)幼穗選取選取處于花序原基期的幼穗，幼穗內(nèi)種子尚未形成，中軸也比較軟，還沒 形成基本的分支。(2)初代誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先用75%酒精消毒30s，然后用0. 1%氯化汞浸泡5分鐘，再用無菌水沖洗三次，將其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。經(jīng)過30天的 初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷。培養(yǎng)條件為26士2°C，每天光照16個小時，光強為2000LX。(3)生苗繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生苗，30天繼代一次， 增殖系數(shù)為2-3。培養(yǎng)條件為26士2°C，每天光照16個小時，光強為2000LX。(4)生根誘導(dǎo)所生幼苗在在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)30天，生根率達 40%以上。培養(yǎng)條件為26士2°C，每天光照16個小時，光強為2000LX。(5)馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長健壯的、株高在5-6厘米的組培苗移栽到由沙子 組成的馴化苗圃中馴化。每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15 - 20d后，視幼 苗長勢，即可移栽到苗圃中。溫室條件為15°C _25°C，照明使用鹵光，光照16小時，光照強 度為 2000LX。
權(quán)利要求
1. 一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，其步驟是A、幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗；B、用初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)將其剪成2-3厘米小段，先用75%體積比的酒精消毒 25-35s,然后用0. 1%質(zhì)量體積比的氯化汞浸泡3-5分鐘，再用無菌水沖洗2_4次，將其 接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過30-35天的初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷，培養(yǎng)條件 為24-28 °C，每天光照14-16個小時，光強為2000LX，初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為A =MS培養(yǎng)基 附加激動素 KTl-2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/ L或B :MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-4mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl_3mg/L，6水氯化鎂 MgCl2 · 6H20800mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L ；C、用生苗培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生苗，30-35天繼 代一次，增殖系數(shù)為2-3，培養(yǎng)條件為24-28°C，每天光照14-16個小時，光強為2000LX，所述 的生苗培養(yǎng)基配方為A =MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl_3mg/ L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L或B :MS培養(yǎng)基附加激動素KTl_2mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-D01-2mg/L, 6 水氯化鎂 MgCl2 · 6H20800mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L，將胚型愈 傷轉(zhuǎn)到其中一種生苗培養(yǎng)基之后2-4天，愈傷開始轉(zhuǎn)綠，6-8天開始分化出芽，9-11天形成 小幼苗；D、用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)所生幼苗在在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，培 養(yǎng)25-30天，生根率達40%以上，培養(yǎng)條件為24-28°C，每天光照14-16個小時，光強為 2000LX，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為A:l/2 MS培養(yǎng)基附加激動素KTl-3mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-DO. 5-2mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L 或 B =MS 培養(yǎng)基附加激動素 KTl_3mg/L，2,4 二氯苯氧乙酸 2，4-DO. 5-2mg/L，蔗糖 30g/L，活性炭 3_8g/L，PhytagelR3g/L，將長到 10-15 厘米的幼苗轉(zhuǎn)到任意一種生根培養(yǎng)基上，5天幼苗就會分化出白色或黃色的根；E、馴化移栽在溫室內(nèi)，將生長健壯的、株高在5-6厘米的組培苗移栽到由沙子組成的 馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，15 - 20d后，視幼苗長勢，移栽 到苗圃中，溫室條件為15°C _25°C，照明使用鹵光，光照14-16個小時，光照強度為2000LX， 獲得了南荻幼苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芒屬植物南荻體胚組培快速繁殖方法，其步驟是A、幼穗選取選取處于潁花原基形成期的幼穗；B、用初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)剪成小段，用7酒精消毒，然后用氯化汞浸泡，無菌水沖洗，將其接種在幼穗的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，初代誘導(dǎo)，獲得胚性愈傷；C、用生苗培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)所獲得的胚性愈傷在繼代培養(yǎng)基上繼代生苗；D、用生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)所生幼苗在在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；E、馴化移栽在溫室內(nèi)，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，移栽到苗圃中，照明，光照，獲得了的南荻幼苗。方法易行，操作簡便，且分化出愈率和成苗率很高，成活率高，適用于南荻種苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以及為后續(xù)轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK101999319SQ201010590080
公開日2011年4月6日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者刁英, 周發(fā)松, 胡中立, 胡小虎, 胡暉, 趙玲玲 申請人:湖北光芒能源植物有限公司