專利名稱：雙半胚移植提高牛移植妊娠率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜繁殖學(xué)領(lǐng)域，屬胚胎生物技術(shù)的范疇，作為提高牛繁殖力的輔助技術(shù)。
背景技術(shù)：
近二十年來，通過分割哺乳動(dòng)物的早期胚胎來人工產(chǎn)生遺傳上完全相同的同卵雙胎或多胎動(dòng)物，在綿羊、牛、小鼠、大鼠、馬、兔、豬等哺乳動(dòng)物中已廣為開展。為生產(chǎn)上提供了具有優(yōu)良品種(產(chǎn)肉、產(chǎn)奶量高等)的動(dòng)物，同時(shí)，還給發(fā)育遺傳學(xué)、生理學(xué)等領(lǐng)域提供了進(jìn)行科學(xué)研究的寶貴材料。所謂胚胎分割系指用人工方法將一個(gè)植入前胚胎分割成兩個(gè)或多個(gè)部分，每一部分移植后可發(fā)育成一個(gè)正常個(gè)體。早在1959年，Tarkowski發(fā)現(xiàn)一半卵裂球已被破壞的2-細(xì)胞小鼠胚胎可以發(fā)育成囊胚，并出生了小鼠。其研究結(jié)果表明早期胚胎的每個(gè)卵裂球具有發(fā)育全能性，即能發(fā)育成正常個(gè)體。1980年，Willadsen用瓊脂包埋分割的綿羊2、4、8_細(xì)胞期胚胎，使半胚在中間受體內(nèi)發(fā)育時(shí)受到保護(hù)，并防止其內(nèi)的卵裂球分散，取得了近似正常的妊娠率(66%)。但此方法較復(fù)雜，很難在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。1984年改進(jìn)了方法，分割較晚期的胚胎(桑椹胚或胚泡)，分割后的胚胎立即移植，因而具有很大的實(shí)用價(jià)值。近年來，科學(xué)家們?nèi)栽趯で蟾雍?jiǎn)便、完善的胚胎分割和培養(yǎng)方法，以提高胚胎分割的效率。在哺乳動(dòng)物尤其是大型農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物進(jìn)行良種繁殖時(shí)，可用胚胎分割方式增加胚胎數(shù)目及人造同卵雙胎和多胎數(shù)目，移植后便可獲得更多的良種。目前，在家畜特別是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的牛中，胚胎分割已成為常規(guī)技術(shù)在商業(yè)胚胎移植中應(yīng)用。胚胎分割亦可按需要從一個(gè)胚胎切出一部份用作性別鑒定。胚胎分割的方法歸納為以下幾種
1、酶軟化透明帶后玻璃針分割法用0. 5%的鏈霉蛋白酶軟化胚胎透明帶，若是緊密化胚胎(如桑椹胚)，則需在無鈣、鎂的平衡鹽溶液中處理20分鐘，使胚胎去緊密化，再把玻璃微針固定在一側(cè)的顯微操作臂上，將針置于欲分割的胚胎上面，使其與胚胎呈30度角，對(duì)準(zhǔn)胚胎的正中平分線徐徐下壓，即可將一個(gè)胚胎分割成兩半。 2、直接分割法胚胎透明帶不經(jīng)任何處理，用顯微手術(shù)刀或玻璃針將整個(gè)胚胎分割為二。該方法多用于晚期桑椹胚或胚泡期的胚胎分割。 3、微吸管吹吸法即在顯微鏡下，把胚胎用微吸管吸引固定，用微細(xì)玻璃針在透明帶上割開一個(gè)3/4大的切口，用吸管將卵裂球全部吸出透明帶，再用一根尖端僅允許單卵裂球通過的吸管輕輕吹吸，將卵裂球分離成一半。此方法多用于分割綿羊、大鼠的2、4、8-細(xì)胞期胚胎。 Lewis的研究表明，牛的1級(jí)體內(nèi)受精單整胚的移植妊娠率為70%時(shí)，其單半的移植妊娠率約為50-55%，相當(dāng)于整胚的100-110%，這使胚胎的受孕機(jī)會(huì)增加了 30-40%(Carl Wood,2001)。 單半胚移植雖然能增加胚胎的受孕機(jī)會(huì)，但卻使受體牛的妊娠機(jī)會(huì)降低了15-20%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有單半胚移植會(huì)降低受體牛妊娠機(jī)會(huì)的問題，提出一種雙半胚移植的方法，在增加胚胎受孕機(jī)會(huì)的同時(shí)，也增加受體牛的妊娠機(jī)會(huì)。同時(shí)提出一種快速簡(jiǎn)便胚胎分割方法。 雙半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征在于將胚胎分割成兩半，將一對(duì)半胚移植到一頭受體母牛中，同時(shí)發(fā)育。
所述胚胎為處于緊縮桑葚胚、早期囊胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚的牛1-2級(jí)胚胎。采用所述胚胎的原因?yàn)榕７鞘中g(shù)子宮采胚技術(shù)是在母牛發(fā)情后7-8天進(jìn)行，此階段所采集的可用胚胎均處于上述發(fā)育階段；處于緊縮桑葚胚之前階段的胚胎細(xì)胞數(shù)少，分割后不易成活，而處于擴(kuò)張囊胚之后階段的胚胎已經(jīng)從透明帶中孵化，不宜冷凍保存。
所述分割法為玻璃針分割法、直接分割法、微吸管吹吸法。
所述分割法優(yōu)選為一種快速簡(jiǎn)便直接分割方法，步驟為用雙面刀片線切割成顯微手術(shù)刀，做洗刀平皿清洗消毒，做分割液滴洗胚胎，分割并回收。
冷凍胚胎應(yīng)在解凍后再進(jìn)行分割。 所述母牛為同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛。因?yàn)樗鶝_出的胚胎是在供體母牛發(fā)情后7. 0-8. 0天的胚胎，所以需要移植到處于相同生理階段的受體母牛體內(nèi)。 所述移植是將一對(duì)半胚用4段液法裝入一支0. 25ml細(xì)管的中段，細(xì)管裝入移植槍，將胚胎移植到受體有黃體一側(cè)子宮角的上1/3——1/2處。 本方法將胚胎分割后將一對(duì)半胚移植到一頭受體母牛的子宮中同時(shí)發(fā)育，既能提高整胚的妊娠率，同時(shí)也能提高牛的妊娠率。


圖1為4段液法裝管圖示。左端為棉栓(未顯示)，右端為細(xì)管塞(未顯示)，1-3陰影部分均為冷凍液，4陰影部分為Holding液或冷凍液，空白部分為氣泡。各段長(zhǎng)度為1 :25mm ;2 :15mm ;3 :20mm，裝有胚胎；4 :不定，直到封滿口。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :對(duì)弗拉威赫牛鮮整胚進(jìn)行試驗(yàn) 胚胎選擇處于緊縮桑葚胚、早期囊胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚的弗拉威赫牛鮮整胚進(jìn)行分割。
儀器使用OLUMPUS倒置顯微鏡和一個(gè)顯微操作機(jī)械手。 工具用雙面刀片線切割成寬為1.5mm，長(zhǎng)為7-8mm，尖端角度為40。 _50°之間的顯微手術(shù)刀，顯微手術(shù)刀固定在一直徑2mm，彎成約150 ° ，長(zhǎng)臂長(zhǎng)約48mm，短臂長(zhǎng)約27mm的塑料材質(zhì)的柄上。刀柄短臂與顯微操作機(jī)械手固定。 器皿4孔或6孔培養(yǎng)皿1個(gè)(放置和洗滌胚胎)，C 60mm培養(yǎng)皿1個(gè)(蓋和底均可做分割液滴)，C 35mm培養(yǎng)皿4個(gè)(清洗消毒刀)。 溶液胚胎體外保存液Holding(含血清或血清替代品)，胚胎分割液Splitting(不加任何蛋白源)
分割操作 (1)調(diào)節(jié)顯微手術(shù)刀的方位、角度刀面嚴(yán)格垂直于分割皿底面，刀刃線與分割皿底面幾乎平行，刀尖略低。 (2)做洗刀平皿清洗消毒顯微手術(shù)刀給4個(gè)C 35mm培養(yǎng)皿編號(hào)1#皿加超純水，2#皿加75%乙醇，3#皿加超純水，4#皿加Splitting。 4個(gè)培養(yǎng)皿放在一個(gè)邊長(zhǎng)約120mm的正方皿中，便于移動(dòng)洗刀。每分割l-2個(gè)胚胎按順序清洗刀一遍。 (3)做分割液滴洗胚胎在C 60mm培養(yǎng)皿的蓋或底上做分割液滴，每滴50_70ul，將1-2枚胚胎從Holding液中取出，在Splitting液中洗2-3次后放入分割液滴中，準(zhǔn)備分割。 (4)胚胎分割和回收將顯微手術(shù)刀的尖端部置于欲分割的胚胎上面，以刀尖剛探出胚胎為宜，對(duì)準(zhǔn)胚胎的正中平分線徐徐下壓，即可將一個(gè)胚胎分割成兩半。分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管進(jìn)行回收，一對(duì)半胚放入一個(gè)培養(yǎng)孔中。 雙半胚的移植用同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛做受體進(jìn)行移植。將一對(duì)半胚用4段液法裝入一支0.25ml細(xì)管的中段，細(xì)管裝入移植槍。將胚胎移植到受體有黃體一側(cè)子宮角的上1/3——1/2處。 結(jié)果分割弗拉威赫牛鮮整胚20枚，分割成功率達(dá)100%，雙半胚同側(cè)移植到20頭受體牛，60天妊娠檢查，移植妊娠率達(dá)80% ;對(duì)照組鮮整胚移植妊娠率為61 % 。同時(shí)，同卵雙犢率達(dá)到25%。 實(shí)施例2 :對(duì)弗拉威赫牛冷凍_解凍后整胚進(jìn)行試驗(yàn)
操作及所用試劑器皿同實(shí)施例1 結(jié)果顯示，分割弗拉威赫牛冷凍_解凍后整胚10枚，分割成功率達(dá)100%，雙半胚同側(cè)移植到10頭受體牛，60天妊娠檢查，移植妊娠率達(dá)60% ;同期分割弗拉威赫牛鮮整胚25枚，分割成功率達(dá)100%，雙半胚同側(cè)移植到25頭受體牛，60天妊娠檢查，移植妊娠率達(dá)68% :對(duì)照組鮮整胚移植妊娠率為57%。 以上研究表明，從胚胎的角度講，雙半胚移植可以使整胚的妊娠率提高到約100% ;從受體牛的角度講，雙半胚移植可以使受體牛的移植妊娠率比單整胚提高10-20%。該方法可顯著提高牛胚胎移植技術(shù)的經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
雙半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征在于將胚胎分割成兩半，將一對(duì)半胚移植到一頭受體母牛中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，所述胚胎為緊縮桑葚胚、早期囊胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚的牛l-2級(jí)胚胎。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，所述分割采用的方法為玻璃針分割法、直接分割法、微吸 管吹吸法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，所述分割采用步驟為用雙面刀片線切割成顯微手術(shù)刀，做洗刀平皿清洗消毒，做分割液滴洗胚胎，分割并回收。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，所述洗刀平皿清洗消毒步驟為準(zhǔn)備四個(gè)培養(yǎng)皿，分別加超純水，75%乙醇，超純水，PBS溶液Splitting,每分割1-2個(gè)胚胎按順序清洗刀一遍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，所述分割液滴洗胚胎步驟為在培養(yǎng)皿的蓋或底上做分割液滴，每滴50-70ul，將1-2枚胚胎從Holding液中取出，在Splitting液中洗2-3次后放入分割液滴中，準(zhǔn)備分割。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，所述回收為將分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管進(jìn)行回收， 一對(duì)半胚放入一個(gè)培養(yǎng)孔中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一所述的方法，所述胚胎為冷凍胚胎，所述方法還包括在分割前對(duì)冷凍胚胎進(jìn)行解凍。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，所述受體母牛為同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，所述移植是將一對(duì)半胚用4段液法裝入一支細(xì)管的中段，細(xì)管裝入移植槍，將胚胎移植到受體有黃體一側(cè)子宮角的上1/3——1/2處。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，涉及家畜繁殖學(xué)領(lǐng)域，屬于胚胎生物技術(shù)范疇，作為提高牛繁殖力的輔助技術(shù)。本方法將胚胎分割后，將一對(duì)半胚移植到一頭黃體合格受體母牛中。該方法顯著提升了胚胎和受體牛的妊娠率，可顯著提高牛胚胎移植技術(shù)的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61D19/04GK101785712SQ20101911401
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者余文莉, 李樹靜 申請(qǐng)人:余文莉;李樹靜