專利名稱：垃圾堆肥復合菌劑在提高草坪草抗旱性方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術領域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種為原料，配制高效堆肥復合菌劑。更具體的說是復合菌劑在制備提高草坪植物抗旱性方面的應用。
背景技術：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩(wěn)定的腐殖質〔humicsubstance，HS) 轉化的生物化學過程。這一過程也是地球表面生態(tài)過程的一部分，它參與地球表面的物質和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過堆肥化可以將固體廢物中的有機物轉化成為有機肥料一堆肥(compost)，這種有機肥料作為堆肥化的最終產物，不僅性能穩(wěn)定，并且對環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經歷了漫長的歷史，對其產生和發(fā)展的歷史過程進行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術提供理論和實踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過程中，溫度達 45°C和55°C時，對堆肥菌株進行分離，發(fā)現在45°C時曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢菌群。而到55°C時則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過程中，微生物種群處在一個不斷變化的動態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結果有力地促進了對垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對城市垃圾堆肥過程誒生物變化的調查發(fā)現，分解有機物產生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過程中，高溫階段初期和中文階段細菌均占主要地位。馬文漪等也報道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機物的組成來看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對各種物質的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過程中出現的微生物種群和數量上亦截然不同。近期的相關文獻及實際生產表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術水平、提高處理效率、改善產品質量，一直是相關科研人員所重點關注的研究內容；在堆肥物料中針對特定物質有目的的添加一些人工微生物制劑，已經被很多研究所證實是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考慮到在很多研究和生產實踐中，合理配比的復合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來的各種功能菌株結合起來開發(fā)高效堆肥復合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質便成了相關科研人員研究的熱點問題。盡管植物接種微生物的效應研究報道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進可被生物降解的有機物向穩(wěn)定腐殖質轉化的生物化學過程，是由群落結構演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現有機廢棄物資源化、無害化的動態(tài)過程。研究表明，單一的細菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化進程中的作用都比不上復合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復合菌劑對堆肥化過程中微生物的影響，有利于了解堆肥過程的生物化學過程及加入微生物制劑對堆肥的影響。近年來國內外學者對堆肥過程中的微生物現象進行了一系列理論和實踐研究，Vaz-Moreira等人對堆肥中細菌的群落多樣性進行分析，以期深入認識堆肥過程的本質，為堆肥技術和工藝的研究提供理論基礎。但在復合微生物菌劑研究過程中，有關堆肥內部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關系具有模糊性和復雜性，以及將堆肥微生物菌劑應用于正常條件下對植物生長的影響方面，相關研究也鮮為報道。而有關堆肥內部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關系具有模糊性和復雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復合有益微生物菌劑，對草坪植物生長、生理特性的影響方面的研究還未見報道。干旱脅迫是制約干旱半干旱地區(qū)植物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因子。通過接種外源基因和人工合成菌劑來提高植物在干旱環(huán)境中的適應能力，是近年來國內外研究的一個熱點領域。微生物能夠與80%以上的植物建立共生關系，而共生關系的建立往往可以提高植物的抗逆性，促進植物生長；對此，已有學者展開相關研究工作。賀學禮等人研究了水分脅迫條件下AM真菌對檸條錦雞兒生長和抗旱性的影響。宋瑞勇等人利用人工合成微生物菌劑來提高作物抗逆性，證明了干旱脅迫條件下，微生物誘導劑可促進玉米根系的生長發(fā)育，提高根系的干物質積累，從而提高玉米的抗干旱能力。盡管植物接種微生物的效應研究報道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。從城市生活垃圾堆肥中提取和制備微生物菌劑，并應用于植物抗旱性的研究還未見報道。城市生活垃圾堆肥是由群落結構演替非常迅速的多種微生物群體共同作用而實現有機廢棄物資源化、無害化的動態(tài)過程。堆肥中微生物數量及種群分布與堆肥有機物質成分和含量、微生物間的相互作用等多種因素密切相關。顧文杰等人研究接種外源菌劑對堆肥中微生物數量和酶活性變化的影響，為微生物菌劑的應用和堆肥工藝的改進提供依據。Ivone等人對堆肥中細菌的群落多樣性進行分析，以期深入認識堆肥過程的本質，為堆肥技術和工藝研究提供理論基礎。但無論如何，在復合微生物菌劑研究過程中，有關堆肥微生物菌劑對植物生長和生理特性的影響等相關研究還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明以堆肥微生物菌種作為接種劑，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同濃度的復合微生物菌劑接種到草坪建植體系中。試驗在中度干旱脅迫處理下進行，通過研究不同濃度的復合微生物菌劑對黑麥草和高羊茅生理生態(tài)特性的影響，目的是為篩選優(yōu)良抗旱堆肥復合微生物菌劑，提高草坪植物抗旱性，促進干旱環(huán)境草坪植物的建植提供依據。為實現上述目的本發(fā)明提供了如下的技術方案
高效堆肥復合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應用；所述的堆肥復合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。本發(fā)明所述的應用，其中3菌種的菌落數在2.44X 109-2.47X 109/ml之間；草芽孢桿菌的0D_值為0. 567，酵母菌的OD值為0. 5450其中草坪植物抗旱性指的是丙二醛含量，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性。其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。本發(fā)明進一步公開了高效堆肥復合菌劑，其中3菌種的篩選方法如下
(1)富集將采集的堆肥樣品稱取10g置于無菌三角瓶中，加入100 ml無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOml懸浮液于盛有100 ml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在適合的溫度下搖床振蕩培養(yǎng)3天；
(2)初篩將富集后的培養(yǎng)液進行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進行復篩；
(3)復篩將初篩得到的菌株接種到相應搖瓶培養(yǎng)基中，在適合的溫度和搖床速度的條件下培養(yǎng)，以OD值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制菌株的生長曲線；
(4)合微生物菌劑的制備將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應的培養(yǎng)基上，具體步驟為
①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；
②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC、180r/ min培養(yǎng)1 得到種子液， 放線菌和酵母菌在觀220 r / min培養(yǎng)48 h得到種子液；
③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴大培養(yǎng)4 得到發(fā)酵液。按體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1:1:1配制復合微生物菌液。本發(fā)明所述的草坪植物為黑麥草和高羊茅。其中按體積比枯草芽孢桿菌放線菌 酵母菌=1:1:1配制。其中采用的復合菌劑為稀釋200倍的液體。本發(fā)明更加詳細的制備方法如下
特別加以說明的是枯草芽孢桿菌(保藏號CCTCCM207094)、放線菌(保藏號 CPCa60118)、酵母菌(保藏號CGMCCN0. 1147)均由市售，但根據需要也可以采用下述的方法制備得到3個菌株。其得到的3個菌株的生化特性與市售的相同。研制材料與方法菌株的篩選
①富集將采集的城市生活垃圾堆肥樣品稱取IOg置于無菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOmL懸浮液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在，220 r / min下振蕩培養(yǎng)3—5d。②初篩將富集后的培養(yǎng)液進行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進行復篩。③生長曲線的繪制將初篩得到的枯草芽孢桿菌和酵母菌接種到相應搖瓶培養(yǎng)基中，分別在37°〇和觀1，220 r / min的條件下培養(yǎng)，并分別以波長600 nm和560 nm 下的OD值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制菌株的生長曲線。
城市生活垃圾堆肥復合微生物菌劑制備
菌種培養(yǎng)將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應的培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，具體步驟①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC，180r / min培養(yǎng)12 h得到種子液，放線菌和酵母菌在觀220 r / min培養(yǎng)4 得到種子液；③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴大培養(yǎng)4 得到發(fā)酵液，復合微生物菌液按以下處理進行配制。復合微生物菌劑應用
采用單因素隨機區(qū)組實驗設計，受限因素分別為①干旱脅迫，測得土壤田間最大持水量為43. 54%.本試驗采用中度干旱脅迫，脅迫程度為55%—65%田間最大持水量(MFC) ’② 不同濃度的復合微生物菌劑應用，在此干旱脅迫條件下設定處理方式處理1為對照，不接種菌劑(CK)；處理2加入原菌液(CM1)；處理3加入100倍稀釋液的菌劑(CM2)；處理4加入 200倍稀釋液的菌劑(CM3)；處理5加入300倍稀釋液菌劑(CM4)；處理6加入400倍稀釋液菌劑(CM5)
1. 4草坪建植
選用我國北方比較常見的多年生黑麥草Holium perenne L.)和高羊茅ifestuca arundinacea L.)為試驗材料。供試草坪植物種子籽粒飽滿、大小均勻。所用土壤為天津師范大學院內園土，其理化性質為pH 7.44，飽和含水量0. 58mL/g，有機質4. 6896，全氮 0. 21%,有效磷22. 03 mg/kg,全鉀45. 61g/kg。采集后，剔除植物殘根和石礫等雜物，過2mm 篩，在121°C下滅菌30 min，備用。實驗采用盆栽的方法，每培養(yǎng)容器內放置滅菌土壤200g， 將0. 4g草坪種子播種其上。每天統一定量給水，以保持培養(yǎng)基質有較好的水分狀況，經常調換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致。當植株生長高度達到6—7cm時，加入不同濃度的堆肥復合微生物菌劑，接種CM 3d后，再進行干旱脅迫。各處理3次重復，實驗在溫室植物培養(yǎng)臺上進行，溫度為20— 25°C，相對濕度為30%—60%，光照為透入室內的自然光。處理 40d后進行植物各指標的測定。測定指標
采集新鮮的植物葉片，進行以下各指標的測定。脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮比色法；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；SOD 活性測定采用NBT法；CAT活性測定采用紫外分光光度法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍 G-250染色法進行測定。
葉綠索含量 (mgfFW)干旱脅迫處理CKCM1CM2CM3葉綠素aTl T2 T30.742 ±0.001 0,574± 0.002 0,521± 0.0021.572 ±0.021 1.060± 0.003 0.800 ±0.0030.843± 0.003 0.776 ±0,008 0.652 ±0,0020.845 ±0遞2 0.764 ± 0.004 0.633 ±0.002葉綠素bTl Ti T30.848 ±0.004 0.749 ±0.002 0.659 ±0.0011.075 ±0.017 0.953 ±0.006 0.835 ±0.0090J27± 0,013 0.848± 0.011 0729 ±0.0080.914 ±0.004 0.838 ±0.010 0.733 ±0.003葉綠素a/bTl T2 T30.875± 0.003 0.767± 0.004 0.791 ±0.0021.462± 0.00 1.111 ±0.008 0.958 ±0.0080.卯 9±d010 0.916 ±0.023 0.395±0,0120.926 ±0.002 0.913±0.016 0.864 ±0.005
離體葉片持水力的測定如下將準確稱過鮮重的植物葉片，放入25°C—30°C 的干燥器中，在黑暗條件下干燥2—6 h，再稱量失水后葉片的重量，按下式計算失水率 失水率(％)=(鮮重一失水后重)/鮮重X 100%
失水率高，說明葉片干燥后失水較多，即葉片含水量高，則離體葉片持水力高。數據分析
采用Microsoft Excel 2003和SPSS 11. 5軟件進行處理。研制結果分析 2. 1菌種篩選
初篩通過平板分離篩選，得到透明圈/菌落直徑比值較大且生長較快的菌落。將所得的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌分別進行劃線分離、編號并保藏于固體斜面培養(yǎng)基上。復篩通過測定枯草芽孢桿菌和酵母菌的生長曲線(


圖1和圖2)，分析菌種生長活性最高和繁殖能力最好時期為對數期，將此期的菌種提取出來，稀釋成不同濃度，用于草坪植物接種。由表1可以看出，所得微生物菌劑中富含枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母菌，三菌種的菌落數在2. 44 X IO9-2. 47 X IO9之間，枯草芽孢桿菌的0D_值為0. 545，酵母菌的OD56tl 值為0. 567。表1微生物菌劑所富含的菌落數
權利要求
1.城市生活垃圾堆肥復合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應用；所述的堆肥復合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 1 :1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。
2.權利要求1所述的應用，其中3菌種的菌落數在2.44X 109-2· 47Χ 109/ml之間；草芽孢桿菌的OD6tltl值為0. 567，酵母菌的OD56tl值為0. 545 0
3.權利要求1所述的應用，其中草坪植物抗旱性指的是丙二醛含量，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性。
4.權利要求1所述的應用，其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。
全文摘要
本發(fā)明公開了城市生活垃圾堆肥復合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應用；所述的堆肥復合菌劑它是由體積比例為枯草芽孢桿菌∶放線菌∶酵母菌=1∶1∶1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。結果表明，接種稀釋后的城市生活垃圾堆肥復合微生物菌劑，植物能夠通過自身的保護酶活性和滲透調節(jié)物質含量來減輕干旱傷害，維持植物體的正常生理代謝功能，從而有效緩解干旱脅迫對草坪植物的傷害，提高草坪植物的抗旱性，為干旱環(huán)境草坪植物的建植提供依據。
文檔編號C05F17/00GK102174403SQ201110037028
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請人:天津師范大學