采用耐鹽強(qiáng)化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護(hù)酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用耐鹽強(qiáng)化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽 脅迫草坪草保護(hù)酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納米科學(xué)技術(shù)（Nano-ST)是20世紀(jì)80年代末期崛起的一項(xiàng)新科技，它主要研宄 結(jié)構(gòu)尺度在（l〇_7_l〇_9m)范圍內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)及其應(yīng)用。因?yàn)榧{米材料具有界面表面界面 效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等基本特征，所以，出現(xiàn)了許多傳統(tǒng) 材料不具備的奇異特性。納米材料在吸收、催化、磁效應(yīng)和敏感特性方面都表現(xiàn)出不同于傳 統(tǒng)材料的特性，可與多個(gè)領(lǐng)域高度交叉，包括物理、化學(xué)、電子學(xué)、材料科學(xué)和生物學(xué)，在高 科技應(yīng)用上顯示出廣大的潛力，所以，納米材料的應(yīng)用已經(jīng)愈來愈受到科學(xué)家的關(guān)注。我國 政府十分重視納米技術(shù)的研宄，并將納米結(jié)構(gòu)和納米材料視為納米技術(shù)的關(guān)鍵而加以優(yōu)先 支持。2012年，中國工業(yè)和信息化部根據(jù)《國家"十二五"戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》的精 神，發(fā)布《新材料產(chǎn)業(yè)"十二五"發(fā)展規(guī)劃》，將納米材料列為前沿新材料領(lǐng)域，并明確指出： 中國將加大納米技術(shù)研宄，積極地推動(dòng)納米材料在新能源、環(huán)境治理、節(jié)能減排和生物醫(yī)用 等領(lǐng)域的研宄利用。
[0003] 國外對于納米材料的研宄主要集中于對納米材料安全性的研宄，主要研宄的五大 問題是：皮膚對納米材料的吸收及其對皮膚的傷害；飲用含納米顆粒水的后果；納米顆粒 對動(dòng)物肺部的影響；已變成水中沉積物的納米顆粒對周圍環(huán)境的影響2005年5月1日至4 日，歐共體內(nèi)部在德國波恩舉行"歐洲納米生物效應(yīng)會(huì)議"。會(huì)議討論了納米顆粒的形成、釋 放，在環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)和檢測方法，它的急性毒害作用、慢性毒害作用以及細(xì)胞水平和分子水 平的影響，如對血細(xì)胞、肺部細(xì)胞、免疫細(xì)胞、DNA損傷、基因表達(dá)的影響等。國內(nèi)還發(fā)展了 納米材料對植物的影響，納米肥料由中國農(nóng)科院土壤肥料研宄所張夫道研宄員提出，并在 國家"863"項(xiàng)目中立項(xiàng)。納米肥料是納米生物科技的一個(gè)分支，是用納米材料技術(shù)和醫(yī)藥 微膠囊技術(shù)構(gòu)建改性而制成的全新肥料，分為納米材料包膜、膠結(jié)緩釋控釋肥料與納米結(jié) 構(gòu)肥料。眾所周知，濫用肥料導(dǎo)致的地下水污染已越來越嚴(yán)重，如何提高肥料利用率成為解 決問題的重點(diǎn)，納米材料表面原子數(shù)目占完整粒子原子總數(shù)的80%以上，因?yàn)楸砻嬖又?圍缺少相鄰的原子，含有許多懸空鍵，所以具有不飽和性，很容易與其他原子相結(jié)合而穩(wěn)定 下來，從而表現(xiàn)出非常高的化學(xué)活性。與肥料結(jié)合能明顯提高肥料的利用率，一方面是由于 納米材料的磁效應(yīng)，能夠促進(jìn)養(yǎng)分被植物吸收，刺激植物生長發(fā)育，并且還能提高植物體內(nèi) 多種酶的活性。另一方面，是因?yàn)槠浔砻嫘?yīng)，使納米肥料表面能和表面結(jié)合能增大，幫助 其在土壤環(huán)境中被植物根系吸收，肥料使用的效果得到提高。有研宄表明，添加納米碳肥料 增效劑能有效減緩?fù)寥烙行юB(yǎng)分的下降，提高水稻產(chǎn)量，增產(chǎn)幅度在1. 9% -3. 5%之問。納 米碳對水稻產(chǎn)量與氮肥利用率的影響，也證明了施用納米碳粉可顯著提高水稻產(chǎn)量，同時(shí)， 在適宜施氮量條件下，加施納米碳粉有助于水稻氮肥利用率的提高。納米材料膠結(jié)包膜型 緩/控釋肥料對作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，納米材料膠結(jié)包膜型緩/控釋肥料均有 助于小麥和玉米子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高。目前研宄的納米肥料多數(shù)為納米材料增效 肥或納米材料包膜肥，而將肥料本身加工到納米粒徑應(yīng)用于草坪植物逆境脅迫的研宄，尚 無文獻(xiàn)報(bào)道。
[0004] 微生物肥料又稱為菌肥、生物肥料，主要作用表現(xiàn)在幫助作物營養(yǎng)吸收、提升化肥 利用率和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性等方面。微生物肥料一般可分為兩類，一類是微生物 通過自身的生命活動(dòng)，增加可供植物吸收的營養(yǎng)元素；另一類，能夠通過微生物生命活動(dòng)的 次生代謝分泌激素，來促進(jìn)植物生長和提高植物的抗逆性。如固氮微生物能夠通過固氮作 用增加土壤氮素含量，微生物可以通過生命活動(dòng)提高土壤中營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和吸收，是大 多數(shù)微生物肥料的主要功能。此外，一些有益微生物可以通過自身的代謝活動(dòng)產(chǎn)生多種糖 類物質(zhì)，這些糖類物質(zhì)不僅能與土壤中的膠類物質(zhì)有機(jī)結(jié)合在一起，同時(shí)還可以與植物自 身產(chǎn)生的粘液結(jié)合在一起，起到改良土壤的作用。微生物菌劑還具有改善作物生長狀況，增 強(qiáng)植物抗性等作用。目前大多數(shù)研宄已表明，微生物制劑能促進(jìn)植物生長和營養(yǎng)元素的吸 收。有研宄者將其應(yīng)用于水稻研宄，結(jié)果表明，與常規(guī)施肥相比，施加生物菌肥能有效促進(jìn) 水稻產(chǎn)量的增加。也有人將篩選出的七種植物促生真菌應(yīng)用于向日葵的培養(yǎng)研宄發(fā)，結(jié)果 證明，真菌可以明顯促進(jìn)其初期生長，并能有效抑制霜霉病的發(fā)生。綜上所述，目前有關(guān)微 生物的研宄多側(cè)重于有益微生物的提取、鑒定及應(yīng)用，但將有益微生物進(jìn)一步強(qiáng)化后應(yīng)用 于草坪植物逆境生長的研宄尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
[0005] 草坪建植體系是集生態(tài)調(diào)控、美化環(huán)境和文化娛樂等多種功能為一體的生態(tài)工 程。作為城市園林綠化的重要組成部分，草坪綠地是衡量經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度的標(biāo)準(zhǔn)之一，也是衡 量現(xiàn)代化城市的標(biāo)準(zhǔn)之一，是現(xiàn)代城市社會(huì)發(fā)展與經(jīng)濟(jì)實(shí)力的一個(gè)有力體現(xiàn)，草坪建植體 系的構(gòu)建對于改善城市投資環(huán)境、招商引資、促進(jìn)旅游等各個(gè)方面都起著不可忽略的作用。 草坪在帶來景觀和美化效果的同時(shí)，在維系生態(tài)系統(tǒng)平衡方面也發(fā)揮著重要作用。首先，它 能夠凈化空氣、殺菌消毒，草坪通過光合作用吸收CO2放出O2保持空氣中CO 2和02的平衡， 草坪還能稀釋、分解、吸收和固定大氣中的有毒氣體、致癌物質(zhì)和某些重金屬氣體等有毒物 質(zhì)，通過光合作用變害為利。其次，草坪能夠保持水土、維持生態(tài)平衡。草坪能致密覆蓋地 表的草層，并且密集的根系能有效固著表土，防止地表徑流的形成，降低表土被帶走的可能 性。另外，草坪還可以減緩太陽輻射，有效降低地表溫度、增加空氣濕度。
[0006] 鹽堿地(土)，是鹽化土，堿化土和鹽堿土的總稱。近年來，土壤鹽堿化不斷的加 重。目前，我國有20X106hm2以上鹽堿地和7X106hm2以上鹽漬化土壤，約占耕地面積的 20%。不論是在干旱地區(qū)，還是在水資源豐富的沿海地區(qū)，鹽脅迫都是一種十分嚴(yán)重的非生 物脅迫。而鹽脅迫是限制草坪草生長的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)境因素之一。大量的鹽漬化土壤被荒廢， 極大地浪費(fèi)了土壤資源，阻礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和城市綠化進(jìn)程。鹽分對作物的危害主要表現(xiàn)為， 種子發(fā)芽率降低、抑制生長減慢、根生長減慢、葉片發(fā)黃、傷害植物組織、造成植物細(xì)胞膜傷 害等現(xiàn)象，致使植物的生長發(fā)育受到嚴(yán)重限制。長期以來，鹽堿土的改良主要采用的是灌溉 排水、施加化學(xué)改良劑或礦質(zhì)肥料和種植耐鹽堿的植物。針對以上問題，目前研宄主要集中 于選取抗逆性強(qiáng)的草坪植物、施用高效肥料、施用保水劑和改良劑等措施。納米肥作為一種 新型的高效肥料，在植物逆境脅迫方面受到越來越多的關(guān)注。
[0007] 納米肥料是一種特殊的高效肥料，其粒子的表面積、表面能及表面結(jié)合能都相對 較大，有助于其在土壤環(huán)境中被植物的根毛或根尖部分吸附，其特有性能有可能解決肥料 利用率、作物增產(chǎn)與植物抗性等問題。目前關(guān)于納米肥料的研宄多數(shù)為納米材料增效肥或 納米材料包膜肥，而將肥料本身加工到納米粒徑應(yīng)用于草坪植物的研宄，同樣也未見相關(guān) 技術(shù)報(bào)道。
[0008] 生活垃圾堆肥是一個(gè)高滲體系，其中的微生物對逆境有一定的適應(yīng)能力，將其中 有益微生物菌劑進(jìn)一步強(qiáng)化后應(yīng)用于草坪逆境建植具有重要意義?；谝陨峡紤]，為了研 宄納米堆肥及其有益微生物在草坪建植中的應(yīng)用效果，本文中將垃圾堆肥經(jīng)納米加工技術(shù) 加工到30nm左右，并從生活垃圾堆肥中分離提取出合適的有益微生物菌株，通過進(jìn)一步抗 性馴化，獲得更為高效的強(qiáng)化微生物菌劑，將其按一定的體積比例混合后，制成復(fù)合微生物 菌劑，與納米堆肥聯(lián)合應(yīng)用于脅迫等逆境脅迫下的草坪建植，通過探索其對逆境脅迫下草 坪植物生理生態(tài)特性的影響，以期為強(qiáng)化微生物聯(lián)合納米堆肥在逆境草坪建植中的應(yīng)用， 促進(jìn)逆境環(huán)境草坪植物的建植提供理論依據(jù)。
[0009] 微生物能顯著促進(jìn)植物生長，促進(jìn)營養(yǎng)元素的吸收。另外，真菌能有效提高草坪植 物的抗寒性、抗旱性、抵抗生物危害等抗性。一些研宄結(jié)果表明，納米堆肥對植物生長具有 明顯的促進(jìn)作用，但將納米堆肥用于鹽脅迫草坪建植的方面的技術(shù)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明從堆肥中提取耐鹽微生物，將篩選得到純種耐鹽微生物，采用逐步提高 NaCl的濃度方法進(jìn)一步強(qiáng)化練制成強(qiáng)化耐鹽菌劑，與納米堆肥聯(lián)合施用于鹽堿土草坪基質(zhì) 中。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)輕度、中度和重度三種鹽脅迫處理，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化微生物聯(lián)合納米堆肥增強(qiáng)草坪草 的抗鹽性，目的為研制高效肥料，以達(dá)到調(diào)節(jié)草坪草的在鹽脅迫下保護(hù)酶活性的增強(qiáng)，以達(dá) 到促進(jìn)鹽堿土草坪建植效果的目的。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的內(nèi)容： 一種采用耐鹽強(qiáng)化活性納米垃圾堆肥調(diào)節(jié)鹽脅迫草坪草保護(hù)酶的方法，其特征在于按 如下的步驟進(jìn)行： (1) 納米堆肥的制備： 將生活垃圾堆肥105°c烘干至恒重，將垃圾堆肥加工研磨制成30-35nm納米堆肥，備 用； (2) 耐鹽微生物菌劑的制備： 將堆肥樣品稱取IOg置于無菌錐形瓶中，加入IOOmL無菌水振蕩均勾后，取IOmL懸浮 液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28°C，220r/min下振蕩培養(yǎng)3d，即為混合微生物 菌群；所述的混合微生物菌群中含有枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌和產(chǎn)黃青霉； (3) 混合微生物菌群耐鹽強(qiáng)化采用的是逐步增加鹽濃度的方法，以減輕瞬間高濃度鹽 對混合菌株造成的沖擊和毒害，NaCl的濃度以0. 5%的梯度增加到3%，每增加一次NaCl的 濃度，要待菌體增長量穩(wěn)定后，才能繼續(xù)增加 NaCl的濃度，逐級馴化出耐鹽微生物菌群； (4) 復(fù)合耐鹽微生物菌劑的制備： 枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌和產(chǎn)黃青霉按體積比1:1:1的比例配制成復(fù)合耐鹽微 生物菌劑，稀釋100倍備用； (5) 草皮建植： 將土壤與鹽堿土過篩除雜，按一定比例制成輕度0. 3%、中度0. 6%和重度0. 9%鹽堿土， 將混合好的鹽堿土在121 °C下滅菌30 min備用； 每個(gè)脅迫設(shè)3個(gè)處理，三個(gè)脅迫所設(shè)處理相同，分別為： 1) 以100% 土壤為對照基質(zhì)并加入15 ml空白培養(yǎng)基 2) 土壤和納米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml空白培養(yǎng)基 3) 土壤和納米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml強(qiáng)化耐鹽微生物菌劑 (5)以混合好的土壤為基質(zhì)進(jìn)行草坪植物栽培試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)基質(zhì)用量為9400gnT2,草皮 基質(zhì)厚度為15 mm，高羊茅草種播種量為160gnT2,將種子浸泡24h后均勻播灑于基質(zhì)表層， 首先進(jìn)行黑暗處理，充分澆水保證萌發(fā)，萌發(fā)后進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為450-700 μ mol. πΓ2. s'期間早晚定期澆一次水，經(jīng)常調(diào)換培養(yǎng)草皮的位置以保證光照一致，室內(nèi)的相對濕度為 40-55%，溫度為20-25°C，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行50d后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測定。其中所述的逐步增加 鹽濃度的方法指的是：NaCl的濃度分別為0. 5%、1%、1. 5%、2%、2. 5%和3%，在馴化過程中，視 〇D_增長而逐步提高鹽濃度，NaCl的濃度以0. 5%的梯度