專利名稱：全人源抗人cd20單抗分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人CD20單抗。本發(fā)明特別與高親和力、低解離速率的抗人CD20單抗有關(guān)。本發(fā)明還披露了這種全人源抗體組成的藥物在人類疾病治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
⑶20蛋白，也稱之為人B淋巴細胞限制性分化抗原或Bp35，是一種非糖基化的疏水穿膜磷酸化蛋白，其分子量為35kD，在所有成熟B細胞表面表達，由MS4A1基因編碼(Valentine et al，1989，J Biol Chem 264(19) :11282-11287 ；and Einfield et al,1988,EMBO J7(3) :711-717)。在人體，⑶20在B細胞發(fā)育的整個過程中，除了第一和最后階段外均進行表達；它從pre-pre B細胞到記憶細胞都存在，但是在pro_B細胞或漿細胞中不表達(Bona C,et al, 1996, Textbook of Immunology. Martin Soohoo,2rd edition). CRC Press, pl02.ISBN9783718605965)。曾經(jīng)認為，它可能是B細胞激活過程中的一個調(diào)節(jié)步驟，是細胞周期啟動、分化所需要的，并在B細胞發(fā)育和分化成成漿細胞過程中起重要作用。在B細胞淋巴瘤、毛發(fā)細胞白細胞瘤和慢性B細胞淋巴細胞白血病發(fā)現(xiàn)它的存在，在皮膚/黑色素瘤癌干細胞也發(fā)現(xiàn)它的存在(Fang D，et al.，2005，Cancer Res. 65(20) :9328-37)。CD20 存在于90%以上的外周血或淋巴器官的B細胞表面，并且在早前B細胞(early pre-B)發(fā)育過程中表達，直到漿細胞分化。CD20不但存在于正常的B細胞，也存在于惡性B細胞。特別是，CD20 在 90% 以上的 B 細胞非霍金奇(NHL)中表達(Anderson, et al (1984)Blood63 (6)1424-1433)。但是在造血干細胞，pro_B細胞，正常漿細胞和其他正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)它的存在(Tedder et al, 1985, J Immunol, 135 (2) :973-979)。在體液免疫反應(yīng)(與由T細胞控制的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相對)中B細胞是其重要作用的淋巴細胞。B細胞的重要功能是制造抗抗原的抗體，起抗原提呈細胞(APCs)作用，并經(jīng)與抗原作用最終發(fā)育成記憶細胞。B細胞是被動免疫系統(tǒng)的重要組分。另一個重要方面是，⑶20不發(fā)生遮蔽、調(diào)變或內(nèi)部化(internalize) (Cragg MS,etal.，2005，Curr Dir Autoimmun 8:140-74)。所有這些背景都是使得它成為誘人的治療性靶點。已經(jīng)有幾個抗人⑶20的單抗被成功用于與該靶點相關(guān)的惡性腫瘤的治療，例如rituximab, Ibritumomab tiuxetan和tositumomab,它們都是治療B細胞淋巴瘤和白血病的有效藥物?？谷薈D20單抗Ofatumumab (GenMab公司產(chǎn)品)2009年被FDA批準用于治療慢性淋巴細胞白血病，正在開發(fā)的其他抗人⑶20抗體治療藥物還有AME-133v(AME開發(fā))andIMMU-106(veltuzumab)(Morrow KJ, Methods for Maximizing Antibody Yields. GeneticEngineering&Biotechnology News (Mary Ann Liebert, Inc.) :p. 36)。Rituximab,商品名為Rituxan和MabThera，是人鼠嵌合的IgGlkappa型抗人⑶20基因工程抗體，其分子量為145kD，與人⑶20的親和力大約是8. OnM，可有效地破壞B細胞?？谷刷?0抗體治療可以單獨注射，也可以與第二種放射性標記的或偶聯(lián)了化學(xué)治療劑的抗人CD20抗體聯(lián)用。FDA已經(jīng)批準了用一種這樣的抗⑶20抗體Rituxan用于治療復(fù)發(fā)性及已治療過的低度非霍金奇淋巴細胞瘤(NHL)。盡管Rituxan對于治療B細胞淋巴瘤有治療效果，但被治療的病人經(jīng)常復(fù)發(fā)。最近發(fā)現(xiàn)，Rituxan對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有療效(Edwards J, et al, 2004, N Engl JMed350 (25) :2572-81)，并被FDA批準與MTX聯(lián)用治療對一種或多種抗TNFa治療方法無效的中重度活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。已有證據(jù)表明，Rituxan對多種自身免疫疾病有效，并已被off-label用于治療難治性多發(fā)性硬化(Stephen LH, et al,2009, N Engl J Med 2008 ；358 :676-688)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及自身免疫性貧血。盡管CD20在促進B細胞增值和分化方面的實際功能和機理還不清楚，但是它是以抗體為基礎(chǔ)的控制或殺死與癌癥和自身免疫疾病有關(guān)的B細胞的重要靶點已是不爭的事 實。特別是，在NHL這樣的癌癥細胞中CD20的表達使其成為以抗體為基礎(chǔ)的治療方法的重要靶點，用于使治療劑特異性地攻擊⑶20陽性癌癥細胞。然而，在至今已經(jīng)獲得的證據(jù)證明CD20是免疫治療的有效靶點的同時，也發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的鼠源、嵌合甚至人源化或全人源的抗體因為其HAMA或HACA反應(yīng)、高達375mg/m2的劑量和因為注射間隔過短而導(dǎo)致的頻繁注射，作為治療劑仍不夠理想。因此，存在著進一步改進抗人⑶20抗體，使其在治療或預(yù)防與⑶20表達有關(guān)的疾病方面更為有效的現(xiàn)實需求。PEG化是一種有效的改進蛋白質(zhì)特性的方法。與蛋白分子共價結(jié)合的PEG可以起到遮蔽作用，使其免疫原性和抗原性降低，借以逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，提高其流體動力學(xué)體積，通過降低腎排而延長在循環(huán)系統(tǒng)的滯留時間。PEG化還可以為疏水性藥物或蛋白提供良好的水溶性。因此，PEG化可以用于改進抗體，特別是scFv，F(xiàn)ab這類半衰期短的分子形式的特性。純化的scFv, Fab分子可以定點共價鏈接上帶分支的PEG分子?，F(xiàn)在需要的是具有高親和力和低解離速率的抗人CD20分子，使得治療過的B細胞淋巴瘤病人不再復(fù)發(fā)，并且給未進行免疫抑制的病人施用后不引起HAMA或HACA反應(yīng)或引起的可能性大大降低，在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期長以延長注射間隔。當然，也期望產(chǎn)品的成本能夠大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種全人源抗人⑶20單克隆抗體(以下簡稱抗人⑶20單抗分子)及其編碼核酸序列。特別是，本發(fā)明的這種分子對人CD20分子具有高親和力和低解離速率。本發(fā)明中，所述抗體分子的重鏈和輕鏈是全人源的，盡管嵌合的或人源化的也可以使用，但是用于人體時，全人源的可以避免很多副作用，例如HAMA和HACA反應(yīng)引起的副作用。本發(fā)明的某些實施例提供了包括抗人CD20單抗分子的組合物，所述分子包含(a) 一個由可變區(qū)和Fe片段等部分構(gòu)成的完整的或不完整的輕鏈，其可變區(qū)由氨基酸序列SEQ IDNO 1或由SEQ ID NO 3或編碼同樣氨基酸序列的等效序列編碼的SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列組成jPb) —個由可變區(qū)和Fe片段等部分構(gòu)成的完整的或不完整的重鏈，其可變區(qū)包含SEQ. ID NO 2或由SEQ. ID NO 5或其等效序列編碼的SEQ. ID NO 6所示的
氨基酸序列。本發(fā)明的抗人⑶20單抗分子包括重鏈與輕鏈；所述輕鏈包含有序列如SEQ IDNO: I所示的輕鏈可變區(qū)或其一部分，所述重鏈包含有序列如SEQ ID NO :2所示的重鏈可變區(qū)或其一部分；或所述輕鏈包含有序列如SEQ ID NO :4所示的輕鏈可變區(qū)或其一部分，所述重鏈包含有序列如SEQ ID NO 6所示的重鏈可變區(qū)或其一部分。本發(fā)明的優(yōu)選抗人⑶20單抗包含全人源Fe區(qū)和框架區(qū)以及通過分子進化獲取的全人源的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。本發(fā)明中，輕鏈和重鏈的框架區(qū)都是全人源的，其框架區(qū)來自人 IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亞型；優(yōu)選的是來自人IgGl,最優(yōu)先選擇的是來自IgGl kappa。本發(fā)明中，重鏈和輕鏈的Fe區(qū)都是全人源的，其Fe區(qū)來自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亞型，優(yōu)選的是人IgGl。本發(fā)明所述抗體分子的Fe可以是天然的，也可以是修改過的。所述Fe區(qū)可以是采用任何有效的基因工程方法或其他方法改造過的，其效應(yīng)功能得到提高或降低的變異體。本發(fā)明的全人源框架和Fe區(qū)是直接或間接從人體得到的。所述的直接方法包括但不限于基因組DNA克隆、cDNA、cDNA文庫。所述的間接方法包括但不限于根據(jù)包括但不限于GenBank或其他出版物提供的生物信息為基礎(chǔ)部分合成或完全從頭合成完整的DNA。DNA合成技術(shù)包括但不限于以PCR為基礎(chǔ)的DNA合成方法。在某些實施例中，所述抗人⑶20抗體分子包括全長分子或其一個片段(例如Fv、Fab、F(ab’)2等)。在特定實施例中，所述抗人CD20抗體分子包含一個單域(即CDR)，單鏈 Fv、Fab 或 F (ab)2 等。在某些實施例中，輕鏈可變區(qū)包括全人源框架。在另一些實施例中，輕鏈可變區(qū)包含一種人源的種系框架。在特定的實施例中，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在特定的實施例中，重鏈可變區(qū)包含人的種系框架區(qū)。在另外一些實施例中，所述重鏈可變區(qū)包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。在某些情況下，所述抗人CD20抗體分子可以是為延長其在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期用化學(xué)方法進行了 PEG修飾的。PEG修飾是通過活化scFv、Fab或Fab ’ 2分子上截短的鉸鏈區(qū)的一個氨基酸殘基實現(xiàn)的，方法是Chapman AP等的論文中描述的(PEG)-Iysyl maleimide方案(Chapman AP, et al, 1999, Nature Biotechnology 17,780-783。其他替代方法的細節(jié)可以在許多出版物中找到，例如Knight DM, et al，2004，Platelets 15(7) :409-18和美國專利 US5824784。在某些實施例中，所述抗人⑶20單抗分子包含由輕鏈和重鏈組成的Fab分子。所述輕鏈是由SEQ ID NO 7所示的DNA片段或編碼同樣氨基酸序列的等效DNA序列編碼的SEQ IDNO :8所示的氨基酸序列。其重鏈包括由SEQ ID NO :9或編碼同樣氨基酸序列的等效DNA序列編碼的如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。在某些實施例中，所述抗人⑶20抗體分子包含一種Fab，并進一步包含完整的Fe區(qū)，從而形成全長的HiAb分子，或者進一步包含F(xiàn)e的一部分，從而形成不完整的mAb分子。此外，F(xiàn)e區(qū)應(yīng)當具有補體依賴的細胞毒作用(CDC)和抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。這些功能可以通過氨基酸替換進行修飾，以減少或消除或增強其效應(yīng)功能。
本發(fā)明的抗人CD20抗體分子是在真核或原核受體細胞中表達的。在某些實施例中，編碼輕鏈和/或重鏈的核酸序列包含在一種質(zhì)?；蚱渌磉_載體中。本發(fā)明還提供了在治療疾病時施用這種抗體的方法。這些方法包括(I) 一種包含本發(fā)明所述抗人⑶20抗體分子的藥物組合；(2)對客體施用這種藥物組合。所述客體是指具有本品適應(yīng)癥癥狀的病人。在某些實施例中，所述適應(yīng)癥可從以下疾病中選擇=(I)B細胞相關(guān)的疾病復(fù)發(fā)性霍金奇病、B細胞急性淋巴白細胞瘤(B-CLL)、抗性霍金奇病和高度、中度和低度非霍金奇淋巴細胞瘤(NHLs)、彌散性大細胞淋巴細胞瘤(DLCL)、Burkitt淋巴細胞瘤(BL) ；(2)自身免疫疾病類風(fēng)關(guān)、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強制性脊柱炎、多發(fā)性硬化等。(3)其他與CD20有關(guān)的疾病。本發(fā)明提供了抗人CD20單抗分子及其編碼核酸序列。特別是，本發(fā)明提供了具有 高親和力和低解離速率的抗人CD20單抗分子。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的所述抗人CD20單抗分子由具有全人源框架的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)組成。為方便描述，本發(fā)明就此內(nèi)容分成以下幾方面I.抗人CD20單抗分子；II.制備抗人CD20單抗分子；III.用于治療的配方和使用方法。以及IV.抗人⑶20抗體分子的應(yīng)用。I.抗人⑶20單克隆抗體分子本發(fā)明的單抗可以用多種技術(shù)獲得，包括但不限于Kohler and Milstein,Nature256:495(1975)發(fā)表的標準的雜交瘤技術(shù)。盡管原則上這一技術(shù)是受偏愛的，但其他獲得單抗的技術(shù)也可以應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)基因小鼠或雜交瘤技術(shù)。小鼠中的雜交瘤技術(shù)已經(jīng)十分成熟。免疫和融合伙伴已經(jīng)十分清楚。但是，用小鼠或其他非人動物雜交瘤產(chǎn)生的抗體會引起HAMA反應(yīng)，從而導(dǎo)致用于人體疾病治療時會引起副作用。以這些抗體為基礎(chǔ)獲得的嵌合的或人源化的單抗用于人體時仍然能夠引起HACA反應(yīng)，從而導(dǎo)致類似的免疫反應(yīng)，盡管比起原型分子輕微。全人源雜交瘤技術(shù)仍然處于開發(fā)狀態(tài)，尚不足以獲得用于人類疾病治療的單抗。對于人類疾病治療來說，需要全人源抗體以減少或消除引起副作用的HAMA或HACA反應(yīng)。盡管轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)有很成功的記錄，其他技術(shù)也是可以選擇的?？贵w庫技術(shù)，特別是由CAT及其他機構(gòu)建立的全人源抗體庫技術(shù)就是其中值得考慮的一種選擇。CAT建立的技術(shù)在一些治療性抗體的開發(fā)上獲得了某種程度的成功，引起了國際上的關(guān)注，但是它依然有非常明顯的問題獲得高親和力scFv分子的幾率很低。這就需要對該技術(shù)進行改進，以滿足治療性抗體的需要。本發(fā)明對現(xiàn)有抗體庫技術(shù)的最重要的改進有(I)用3000位來自于不同民族和地區(qū)的健康成年人血樣構(gòu)建了超大規(guī)模全人源天然Fab抗體庫,稱之為HuLib。顯然，與已發(fā)表的抗體庫相比，該抗體庫具有更豐富的遺傳變異。對于熟知本領(lǐng)域的人員來說，不難理解這將大大提高遺傳復(fù)雜性和通過淘篩或其他方法獲得高親和力Fab分子的可能性。此處可以使用的其他抗體庫可以是合成的或部分合成的，也可以是scFv，起始材料也可以是其他非人動物，例如小鼠。(2)為了提高親和力和改變獲得的Fab分子親和力以外的其他性狀以滿足治療的需要，采用了分子進化技術(shù)。通過分子進化改進的分子可以借助哺乳動物細胞、酵母菌細胞或細菌細胞進行生產(chǎn)。本發(fā)明中的原型Fab分子是用人CD20作為抗原上述抗體庫進行淘篩獲得的，它將被用于后續(xù)通過分子進化的原型分子，以獲得親和力等技術(shù)指標達到治療性藥物要求的候選單抗。本發(fā)明的分子進化技術(shù)是通過PCR引入突變的，它包括(1)關(guān)鍵氨基酸(KA)掃描。KA掃描被用來在人工進化之前檢定最有意義、最有可能獲得有用突變體的位點，以減少無效突變。KA掃描是檢定可以通過任何可能的突變方案并通過親和力測定獲得有效突變體的氨基酸位點的過程。若一個具有一個特定氨基酸位點突變的突變子的親和力發(fā)生了變化，該位點就是有用的突變位點，反之亦然?；谶@樣的掃描方法就可以確定有效的和無效的突變位點，并可借助Cunningham和Wells (Science, 1998, 244 :1081-1085)的方法在設(shè)計突變方案之前對各位點進行分類。借此可以大大簡化突變設(shè)計的數(shù)據(jù)處理，并減少甚至避免無效突變，這又使突變后亞庫的構(gòu)建和淘篩大大簡化。(2)突變引物設(shè)計。突變引物設(shè)計是這一技術(shù)中獲得足夠數(shù)量的有用突變的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明中采用了以GCR引物設(shè)計方案，詳細情況見PCT/CN2009/074839。本發(fā)明中所述的目標區(qū)域(即擬突變的區(qū)域)是一個抗體分子的CDR區(qū)，優(yōu)先選擇的是輕鏈和重鏈的CDR3。本發(fā)明中，所述的隨機突變優(yōu)先選擇的是在每一個有用突變位點以19種或20種天然氨基酸進行飽和隨機突變。(3)此外，根據(jù)Kabat計數(shù)法確定的目標CDR的側(cè)翼序列也有一些氨基酸對于產(chǎn)生對親和力有意義的突變 子是重要的，至少在某些情況下，某種程度上是這樣。因為此，KA掃描應(yīng)當覆蓋CDR及其側(cè)翼氨基酸以獲得更廣泛的親和力改善的變異。在本發(fā)明，有用的氨基酸位點可以用本領(lǐng)域熟知的方法突變?yōu)殡S機氨基酸或特定的氨基酸。突變?yōu)閿M定的氨基酸序列可以通過改變編碼該氨基酸的核酸序列來實現(xiàn)。這種編碼在特定CDR區(qū)具有一個或多個突變的突變子的核酸分子可以用本領(lǐng)域熟知的方法獲得。所述的突變方法包括但不限于對已經(jīng)提前制備的編碼CDR區(qū)的核酸進行定點突變、寡核苷酸介導(dǎo)的突變、位點特異性突變或隨機PCR突變、表達框突變等。制備這種取代突變子的一種優(yōu)選方法是定點突變。這一技術(shù)在本領(lǐng)域是廣為熟知(see, e.g., Carter et al,1985，NAR, 13 :4431-4443, and Kunkel et al, 1987，PNAS，82 :488-492)。以 PCR 為基礎(chǔ)的突變方法，其突變核苷酸被置入到了引物中，從而使相應(yīng)的PCR產(chǎn)物帶有突變，這也是可達到此目的的一種優(yōu)選的方法，詳細情況可參考see Vallette et al, (1989)NAR，723-733。本發(fā)明中最佳的突變方法是用根據(jù)GCR方法(詳見PCT/CN2009/074839)或其他可用的方法設(shè)計引物，通過PCR在特定的位點進行隨機突變。必要時可以同時對一個以上的位點進行突變，從而獲得具有多個突變的突變子。本發(fā)明米用Kabat 方法編碼各個CDR 區(qū)(EA, et al, 1991, Sequences of proteinsof immunological interest，5th ed. U. S. Department of Health and Human Services,National Institutes of Health，Bethesda，Md.)。在某些實施例中，抗人⑶20單抗分子由一條輕鏈和帶有全人源恒定區(qū)的一條重鏈組成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，不難理解當本發(fā)明的抗人CD20單抗分子用于人體治療疾病時將很少或沒有免疫反應(yīng)。本發(fā)明的某些實施例中，抗人CD20單抗分子帶有Fe區(qū)，其優(yōu)選來源是直接從人種系獲得或通過其他途徑例如全長DNA合成，人基因組庫等。本發(fā)明提供一種親和力高、解離速率低的抗人CD20單抗，該單抗在低劑量下是有效的。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，本發(fā)明的抗人CD20單抗分子特別適合用于人體疾病的治療，它不像帶有鼠源成分的嵌合型抗人CD20單抗分子(例如Rituxan)那樣容易引發(fā)HACA反應(yīng)。本發(fā)明所述的⑶R可以與任何類型的框架區(qū)整合為有功能的scFv、Fab和/或進一步與Fe區(qū)整合從而形成有功能的全長抗體分子。優(yōu)選的CDR區(qū)與全人源框架區(qū)或其亞區(qū)和種系的或經(jīng)過修飾的Fe區(qū)進行整合?？梢杂糜谂c本發(fā)明的CDR區(qū)整合的全人源框架包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(見 (I)Kabat et al, 1991, Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services,and(2)NIH，USA ;and Wu et al，1970，J Exp Med 132:211-250)。II.產(chǎn)生結(jié)合⑶20分子的方法本發(fā)明的抗體或抗體片段可以通過輕鏈和重鏈基因在受體細胞中的重組表達來實現(xiàn)。所述受體細胞可以是哺乳動物細胞，也可以是酵母或細菌細胞。本發(fā)明中輕鏈和重鏈的表達可以通過瞬時或穩(wěn)定表達來實現(xiàn)。兩種表達策略都包括用一種或多種帶有編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA片段的表達載體轉(zhuǎn)染(哺乳動物和酵母系 統(tǒng))或轉(zhuǎn)化(細菌系統(tǒng))受體細胞，從而使輕鏈和重鏈在受體細胞中表達，優(yōu)選的表達方式是分泌到培養(yǎng)基中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的層析等方法從中回收抗體。標準的重組DNA方法可以有效地用于輕鏈和重鏈基因的獲得、克隆至表達載體以及引入到受體細胞。本發(fā)明中在分子進化之前或之后通過淘篩獲得的抗體分子是Fab形式的。這種形式可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的基因工程技術(shù)方便地進一步轉(zhuǎn)換成scFv、全長抗體或其他形式。本發(fā)明中，一旦通過上述方法獲得了編碼所需VL和VH區(qū)的DNA片段，就可以用標準基因工程方法進一步轉(zhuǎn)換成全長的抗體輕鏈和重鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。為獲得全長輕鏈基因，可以把編碼VL區(qū)的DNA整合到人輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)先選擇的是人kappa或lambda恒定區(qū),最優(yōu)先選擇的是人kappa恒定區(qū)。為了獲得全長重鏈基因，可以把編碼VH區(qū)的DNA整合到重鏈的恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以從以下幾種中選擇，IgG，、IgA、IgE、IgM或IgD。優(yōu)先選擇的是IgGl IgG4,最優(yōu)先選擇IgGl (gamma)的恒定區(qū)。為了獲得單鏈Fv基因，可以用PCR方法從上述Fab分子進一步獲得VH-和VL-DNA編碼區(qū)，然后用(Gly4) 3編碼區(qū)作Linker把兩個片段連接成一個完整分子，使得所述VH和VL序列可以用McCafferty et al, 1990, Nature 348 :552-554描述的方法以單鏈Fv蛋白的方式在E. coli中表達。為了表達本發(fā)明所述的抗體或抗體的片段，可以把其相應(yīng)的輕鏈和重鏈編碼序列插入到表達載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列之間。本發(fā)明所述的表達載體包含調(diào)控序列如啟動子、增強子等。所述的表達載體及其控制序列應(yīng)當與受體細胞兼容。編碼輕鏈和重鏈的基因可以分別插入到兩個獨立的載體，也可以插入到同一個載體。所述表達載體可以預(yù)置了恒定區(qū)，也可以不預(yù)置恒定區(qū)。如果一個抗體基因只含有可變區(qū)，應(yīng)當使用預(yù)置了恒定區(qū)的表達載體。除了轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，本發(fā)明的表達載體還含有(I)在每一個表達框有一個信號肽序列，它可以促進抗體從受體細胞分泌到培養(yǎng)基中；(2)至少一個復(fù)制起點；(3)一個或多個選擇標記基因，借此可方便地對引入了表達載體的受體細胞進行篩選。典型的選擇標記基因可為受體細胞提供抗性，例如細菌對抗生素的抗性，哺乳動物細胞或其他受體細胞對G418、潮霉素和MTX等的抗性。所有這些信息對本領(lǐng)域的人員都已經(jīng)廣為熟知。
優(yōu)選的用于本發(fā)明的受體細胞包括具有或不具有DHFR的CHO細胞系、HEK293細胞系?？贵w的表達是通過培養(yǎng)攜帶有上述表達載體的受體細胞，然后對產(chǎn)物進行純化進行的。本發(fā)明的受體細胞也可易用來生產(chǎn)截短的抗體片段，如Fab或scFv。為此目的，盡管哺乳動物或其他受體細胞也可以使用，但以E. coli為代表的細菌是優(yōu)先選擇的受體細胞。本發(fā)明中抗體或抗體片段的回收和純化主要包括(I)對樣品進行調(diào)適，即為純化做準備。首先要去除細胞、細胞碎片、脂質(zhì)和凝聚物。為此，可先離心，然后0.45 μ m過濾的方法。(2)層析，包括但不限于親和、離子交換、分子篩的等層系方法。，在有些情況下，超濾或透析也可選用。本發(fā)明優(yōu)先選擇的純化方法是Protein A/G親 和后在目標抗體可結(jié)合到柱子上、陰離子可穿過的低PH下進行陽離子交換層析。也可以在抗體分子可穿過，但陰離子可結(jié)合到柱子上的高PH下用陰離子層析。在離子交換層系中，許多具有不同等電點的雜蛋白可以被去除。(3)如有必要，可用分子篩對已經(jīng)獲得的原液進行進一步純化。為獲得高純度的單抗，本發(fā)明中在過濾后經(jīng)過GE HealthCare生產(chǎn)的MabselectSuRe,CaptoS和Capto Q進行純化。為建立更有效的方法，也可以使用包括MabselectSuRe和CaptoAdhere兩種組分的兩步法。III.制劑及其應(yīng)用本發(fā)明的抗人CD20單抗，包括全長的和截短的，都是治療或診斷與CD20相關(guān)的人體疾病的有用材料。如上所述，抗人CD20單抗可用于治療B細胞淋巴瘤或CD20相關(guān)的其他腫瘤或疾病，自身免疫疾病例(如RA、SLE等)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，與各種放射性或非放射性標記物偶聯(lián)的抗人CD20對于診斷和治療是有用的?？捎糜诖四康姆派湫詷擞浳锇ǖ幌抻?31I，125I，"Tc和9°Y，可用于此目地的非放射標記物包括但不限于酶(例如HRP，AP等)、熒光染料、毒素等。在優(yōu)選的案例中，接受治療的客體是非免疫抑制的(如SLE和RA病人)。盡管機理仍然不清楚，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚，本發(fā)明的抗人CD20抗體分子引起HACA反應(yīng)的可能性比以前知道的抗人CD20抗體要低很多，特別是對非免疫抑制的病人來說更是如此。因此，非免疫抑制的病人可以不用過分顧忌引起副作用的HACA反應(yīng)。此外，本發(fā)明的抗體分子的親和能力顯著提高，因此其有效劑量可明顯降低。這進一步避免了可能的HACA反應(yīng)。本發(fā)明的抗人CD20單抗分子可以與包括但不限于化療或放療等其他抗腫瘤治療方法聯(lián)用，在某些情況下，也可以與一些細胞因子，如G-CSF聯(lián)用。本發(fā)明的抗人CD20抗體分子可以制備成適于給病人使用的劑型，其含有一種人CD20結(jié)合分子，例如抗體或抗體片段，和一種或多種作為醫(yī)藥可接受的載體，例如溶劑、分散介質(zhì)、包裹劑、抗生素、抗真菌物質(zhì)、等滲物質(zhì)、減緩吸收物質(zhì)以及其他的生理學(xué)上能接受的物質(zhì)?？山邮艿妮d體物質(zhì)包括以下一種或多種水、鹽、磷酸鹽緩沖液、葡聚糖、甘油、乙醇等，可單用或組合使用。優(yōu)選的等滲劑是糖、聚乙醇如mannitol, sorbito,也可以是氯化鈉。最優(yōu)先選擇的等滲劑是海藻糖。所述載體可進一步含有微量auxi I iary物質(zhì),如潤濕劑、乳化劑、防腐劑或緩沖液，這些物質(zhì)有助于提高所述分子的貨架期或有效性。本發(fā)明的組分可以形成多種多樣的形式，例如注射或輸液、分散液或懸浮液等。本發(fā)明的優(yōu)選方式是注射液或輸液。IV.抗人⑶20單抗的其他應(yīng)用本發(fā)明的抗人⑶20單抗可用于樣品中⑶20定性或定量免疫檢測。免疫檢測是一種檢測在含有復(fù)雜混合物的溶液中是某種物質(zhì)是否存在或濃度的方法。除了結(jié)合的特異性夕卜，所有免疫檢測的主要共同特點是可產(chǎn)生可檢測的信號。當今，多數(shù)多數(shù)免疫檢測方法都依賴于與可測標記相關(guān)的分析試劑。本發(fā)明可用的標記可以從以下物質(zhì)中選擇放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、磷光物質(zhì)和合學(xué)發(fā)光染料、磁性顆粒、染料、金和銀等的膠體、金屬螯合齊U、輔酶等。本發(fā)明中優(yōu)選方案是酶(例如HRP和AP)，以及熒光染料。其中最選的是HRP和AP等酶。本領(lǐng)域中的許多檢測方法都是廣為熟知并在臨床或科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，例如疾 病檢測、生物化學(xué)研究等。


圖I是Fab表達載體pGPIO結(jié)構(gòu)示意圖。其中，Plac是在E. coli中表達的啟動子，ompA和pelB是信號肽編碼序列，GPIII是噬菌體尾部蛋白GPIII的編碼序列，MCSl和MCS2是Fab輕鏈和重鏈的克隆位點。圖2是全長抗體分子在哺乳動物細胞(如CHO、HEK293等)瞬時或穩(wěn)定表達的雙元表達載體PGP6C構(gòu)建過程及結(jié)構(gòu)示意圖。為了在哺乳動物細胞表達抗體的輕鏈和重鏈，用如下方法構(gòu)建了雙表達框表達載體。(I).用PCR為基礎(chǔ)的全基因合成方法(Xiong A S，Yao Q H, PengR H, et al. , 2004, Nucleic Acids Research, 32 (12) e98.)按照 GenBankAccessionNo. AB608262. I序列資料合成人IgGl輕鏈(Kappa)恒定區(qū)CL,5’增加多克隆位點 Pstl/Nhel/Bglll/EcoRI/EcoRV/XhoI, 3’ -端增加 SV40 poly A signal 編碼區(qū)(簡寫為pASV40)5’ -端22個堿基(以pCI-Neo為模板)，以便于通過重疊PCR與Pcmv片段進行拼接。片段長度為 345bp。(2)以 P3(ttccctttagtgagggttaatg, pASV405’ -端引物區(qū))和 P4(ccggatcgatccttatcggattt/ACCACATTTGTAG AGGTTTTACTTG, Pcmv3，-端引物區(qū)/PA 5’-端引物區(qū))為引物，pCI-Neo為模板擴增pASV40片段，長度為295bp。以Pl (ctgcag(PstI) gctagcagatctgaattc gatatcctcgag,多克隆位點-CL 片段 5’ _ 端引物區(qū))和P4為引物進行重疊PCR對上述兩個片段拼接，獲得多克隆位點-CL-pA片段，長度為 618bp。 (3)以 P5(caagtaaaacctctacaaatgtggta/aaatccgataaggatcgatccgg, pASV403’ -端引物區(qū)/Pcmv5’ -端引物)和 P6 (ggtacc (KpnI)CTGTGGAGAGAAAGG CAAAGTG，KpnI 位點/PCMV 3’-端引物區(qū))為引物，pCI-Neo (Invitrogen)為模板進行PCR擴增，獲得1151bp片段。用Pl和P6為引物通過重疊對上述兩個片段拼接，其最終結(jié)構(gòu)為=PstI-多克隆位點-CL-pA-PCMV-Kpnl，長度為1791bp。該片段克隆至pUC57上，測序驗證無誤后，插入到phCMVI (Gene Therapy Systems, Inc.)載體的 Pstl/Kpnl 位點，即構(gòu)成預(yù)置了 CL 的雙表達框表達載體。最后，把根據(jù)GenBank Accession No. BC092518. I人工合成的人CH(Gamma)片段插入到上述載體的Acc65I/NotI位點，即構(gòu)成預(yù)置了人輕鏈恒定區(qū)CL和重鏈恒定區(qū)CH的雙表達框載體PGP6C。圖3是從7F2分子進化群體中獲得的幾個Fab分子、陽性對照(C2B8_Fab)和陰性對照(Humira-Fab)親和力的比較圖。陰性對照和陽性對照是本公司制備的。親和力數(shù)據(jù)是用Friguet方法測定的。圖4是全長F8G3及自備陽性對照C2B8 (即Rituxan)和2F2 (即HuMax-CD-20)親和力比較圖。親和力數(shù)據(jù)是用Friguet方法測定的。圖5是F8G3、C2B8和2F2從hCD20的解離情況圖?？梢钥闯?，F(xiàn)8G3解離常數(shù)顯著低于C2B8和2F2。圖6是抗人⑶20抗體在免疫缺陷型荷DHL4瘤小鼠中抑制腫瘤生長的情況。圖7 是 F8G3、2F2 和 Humira 誘發(fā) Daudi cells (圖 7A)和 Raji cells (圖 7B)細胞裂解比較圖。加入抗體可在五分鐘內(nèi)誘導(dǎo)到細胞裂解，F(xiàn)8G3和2F2在兩種B細胞可分別誘導(dǎo)90%以上和80%以上細胞裂解。陰性對照未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細胞裂解，此處未顯示。圖8是F8G3和2F2以MNC作為效應(yīng)細胞時誘導(dǎo)Raji細胞ADCC能力的比較圖?？谷刷?0單抗有明顯劑量效應(yīng)。F8G3和2F2均可誘導(dǎo)誘導(dǎo)Raji細胞發(fā)生特異性裂解，2F7 最高僅誘導(dǎo)35%，而F8G3則高達47%。陰性對照Humira不能誘導(dǎo)特異性裂解。
具體實施例方式以下實施例是為了說明或進一步闡釋本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案以及某些論點，并非要限制本發(fā)明的范圍。實施例I.大規(guī)模全人源抗體庫構(gòu)建這一實施例描述如何構(gòu)建Fab形式的超大規(guī)模全人源天然抗體庫。本發(fā)明的Fab抗體庫是用來自不同地區(qū)、不同民族的3000多名健康成人的血樣，參照以下文獻構(gòu)建的，詳細構(gòu)建過程在文獻目錄之后描述。I. Dantas, BC, et al,2005, Construction of a human Fab phage displaylibrary from antibody repertoires of osteosarcoma patients.Gene. Mo. Res, 4(2)126-140.2. Hiroshi, T，et al,1999, Preparation of Recombinant Human MonoclonalAntibody Fab Fragments Specific for Entamoeba histolytica, Clinical andDiagnostic Labor Immunol, May 1999,383-387.3. Wu, BP, et al,2001, Construction and selection of the natural immuneFab antibody phage display library from patients with colorectal cancer， WorldJGastroenterol,7(6) :811-815.4. Lee , CV, et al, 2004 , Hi gh_af f in i t y Human Antibodies fromPhage-displayed Synthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold，J MolBiol，340，1073-1093.5. Michael H，et al,2005, Antibody phage display, Mod Asp Immunobiol，15 47-49.6. De Haard HJ,et al,1999,A large non-immunized human Fab fragment phagelibrary that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinityantibodie. J Biol Chem，1999，274 :18218-18230.7.Fel louse，F(xiàn)A，2007，High-throughput generation of synthetic antibodiesfrom highly functional minimalist phage-displayed libraries. J Mol Biol 373，924-940.I.血樣和cDNA合成取每個供體的血樣I毫升混合，用淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞，然后用Invitrogen或Roche公司的試劑盒分離總mRNA,用GIBCO的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一鏈。所有步驟按照制造商的說明書進行。2.擴增重鏈和輕鏈的Fab區(qū)
為了擴增編碼kappa和lambda輕鏈以及gamma重鏈的Fd區(qū),采用了表I所示的引物組。除了上述輕鏈或重鏈的互補序列外，引物上了帶有特定的酶切位點和保護堿基以便于克隆。用IOOy I體系進行PCR擴增，正義鏈和反意鏈引物均采用ImM終濃度，PCR按下述條件進行25個循環(huán)94°C 30秒，500C 30秒，72°C I分鐘；94°C 4分鐘預(yù)變性，72°C 5分鐘后延伸。用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, Hi I den, Germany)純化擴增的DNA片段。純化的片段用Sacl/Hindlll或Xhol/Spel酶切后瓊脂糖電泳分離，用QIAEXGelExtraction Kit進行膠回收。表I.用于人免疫球蛋白基因PCR擴增的引物組，下劃線部分是增加的酶切位點，兼并密碼為M = A or C，Y = C or T, W = A or T, R = A or G, H = A, C, or T, S = C orG, and K = T or G.
權(quán)利要求
1.一種全人源抗人CD20單克隆抗體，所述全人源抗人CD20單克隆抗體能特異性地與人⑶20結(jié)合。
2.如權(quán)利要求I所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人CD20 單克隆抗體為 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2，分泌型 IgA、IgD 或 IgE 型的抗體。
3.如權(quán)利要求I所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人⑶20單克隆抗體包括重鏈與輕鏈；所述輕鏈包含有序列如SEQ ID NO :1所示的輕鏈可變區(qū)或其一部分，所述重鏈包含有序列如SEQ ID NO 2所示的重鏈可變區(qū)或其一部分；或所述輕鏈包含有序列如SEQ ID NO :4所示的輕鏈可變區(qū)或其一部分，所述重鏈包含有序列如SEQID NO 6所示的重鏈可變區(qū)或其一部分。
4.如權(quán)利要求3所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人CD20單克隆抗體是一種全長的抗體、抗體的一個片段或片段的組合物或單鏈抗體。
5.如權(quán)利要求3所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人CD20單克隆抗體為scFv、Fab、F(ab)2、F(ab’)2，或具有與人CD20結(jié)合能力的其他形式。
6.如權(quán)利要求I所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人⑶20單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO :8，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO=IO0
7.如權(quán)利要求I所述的全人源抗人CD20單克隆抗體，其特征在于，所述全人源抗人⑶20單克隆抗體是PEG化或非PEG化的。
8.一種轉(zhuǎn)染子、真核或原核受體細胞、轉(zhuǎn)基因的非人動物或者植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染子、真核或原核受體細胞、轉(zhuǎn)基因的非人動物或者植物能產(chǎn)生權(quán)利要求3所述抗體或權(quán)利要求3所述抗體一部分的抗體，其中，權(quán)利要求3所述抗體一部分的抗體選自權(quán)利要求3所述抗體的scFv、Fab、F(ab)2、F(ab’)2或其他形式的能與人⑶20結(jié)合的抗體。
9.一種用于治療或預(yù)防與人CD20或CD20表達細胞有關(guān)的疾病的藥物組合物，它包治療有效量的權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述全人源抗人CD20單克隆抗體及藥學(xué)上可接受的輔料。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人CD20單抗及其編碼核酸序列。本發(fā)明特別與高親和力低解離速率的抗人CD20單抗有關(guān)。本發(fā)明的優(yōu)選抗人CD20單抗包含全人源Fc區(qū)和框架區(qū)以及通過分子進化獲取的全人源的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還披露了這種全人源抗體組成的藥物組成及其在人疾病的治療中的應(yīng)用以及在治療中使用這種全人源抗體的方法。
文檔編號A01K67/033GK102875678SQ20111019625
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者劉慶法 申請人:無錫天演生物技術(shù)有限公司