專利名稱：蓖麻雜交種csr24.181種子純度的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法。
背景技術(shù)：
蓖麻(Ricinus communist L)為大戟科蓖麻屬一年或多年生植物,是重要的工業(yè)油源作物，具有“綠色能源”油料作物之稱。蓖麻油因具有凝固點(diǎn)低、耐高溫等獨(dú)一無二的化學(xué)特性，而廣泛應(yīng)用于航空和精密儀器作高級潤滑油、剎車油和防護(hù)油，以及涂料、增塑齊U、尼龍系列、聚氨酯、香料、化妝品等生產(chǎn)及生物柴油的煉制，目前利用蓖麻油生成化學(xué)衍生物已達(dá)175種，系列產(chǎn)品達(dá)2000多項。國內(nèi)外生產(chǎn)對蓖麻原料的需求呈上升趨勢，市場原料緊張，供需缺口在一半以上。在蓖麻開發(fā)產(chǎn)品逐年增多、原料緊張、油籽價格不斷上升的情況下，農(nóng)民卻因購買的品種種子純度不高，單產(chǎn)產(chǎn)量低而種植積極性不高，種植面積十分不穩(wěn)。優(yōu)良品種是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)，品種混雜和純度降低則會明顯降低產(chǎn)量?？焖贉?zhǔn)確地鑒定品種和進(jìn)行純度分析對于品種審定、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、假種辨別均有重要作用，是種子質(zhì)量和良好信譽(yù)的重要保證。目前蓖麻生產(chǎn)上雜交制種主要采用“一系兩用”兩系法制種,通過生長季節(jié)拔除母本行兩性株去雜來生產(chǎn)雜交種子,但由于蓖麻單雌性狀表現(xiàn)的復(fù)雜性，在識別單雌株和兩性株上還有一定難度，稍有不慎，易導(dǎo)致雜交種純度不夠，影響蓖麻種植的產(chǎn)量和效益。因此，對蓖麻雜交種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確而高效的純度鑒定，對蓖麻雜交種的推廣應(yīng)用具有重要意義。采用田間表型性狀的常規(guī)鑒定方法，耗時耗力，成本高，周期長，速度慢，受環(huán)境影響大。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行蓖麻雜交種種子純度鑒定，能從DNA分子水平上提供最直接的證據(jù)，鑒定速度快，環(huán)境影響小，具有直觀、準(zhǔn)確、便捷、易行的特點(diǎn)，能有效解決長期以來蓖麻雜交種混雜難辨，純度難以判斷的問題，可提高育種利用的效率。CSR24. 181是法國阿圖公司利用隱性單基因控制的單雌蓖麻采用“兩用系法”雜交制種育成的蓖麻雜交種，在我國有一定的種植面積。為保證該優(yōu)良品種的制種純度，為農(nóng)戶提供質(zhì)量可靠的種子，需要一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的檢測方法對其商品種子的真?zhèn)渭捌浼兌冗M(jìn)行早期的快速鑒定。目前，通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行蓖麻雜交種種子純度檢測的方法在蓖麻育種領(lǐng)域未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于田間表型性狀的常規(guī)檢測方法耗時耗力、成本高、周期長、速度慢，尤其是蓖麻雜交制種易混雜的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，該檢測方法具有快速直觀、便捷易行、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)常規(guī)純度檢測工作的不足，為蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子真?zhèn)舞b別和純度的快速鑒定提供有效的質(zhì)量保障。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，包括以下步驟
(1)提取蓖麻雜交種種子幼苗葉片基因組DNA；
(2)以所述的基因組DNA為模板，選用SSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的SSR引物序列選自如下的ー種或多種
引物Rco23
FCATGGATGTAGAGGGTCGAT RCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26
F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT
RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29
FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG
RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05
F CATCACCTCTATCCATCCGTTT
R CCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61
F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC
R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129
FTACTGCAACTCAATCCACTGCT
RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242
F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT
R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT
(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
(4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24.181”雜交種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為其品種種子的純度；其中
引物Rco23產(chǎn)生條帶大小分別為440bp和600bp的母本特異標(biāo)記Rco2344(l和Rco23_，產(chǎn)生條帶大小分別為400bp和580bp的父本特異標(biāo)記Rco234qq和Rco2358(l ；
引物Rco26產(chǎn)生條帶大小為700bp的母本特異標(biāo)記Rco267(i(i，產(chǎn)生條帶大小為705bp的父本特異標(biāo)記Rco267(i5 ；
引物Rco29產(chǎn)生條帶大小為560bp的母本特異標(biāo)記Rco2956(l，產(chǎn)生條帶大小為580bp的父本特異標(biāo)記Rco2958(i ；
引物RC05產(chǎn)生條帶大小分別為330bp和570bp的母本特異標(biāo)記RC0533(I和RC0557(I，產(chǎn)生條帶大小分別為360bp和600bp的父本特異標(biāo)記RC05·和RC05_ ；
引物RC61產(chǎn)生條帶大小為220bp的母本特異標(biāo)記RC6122(I，產(chǎn)生條帶大小為210bp的父本特異標(biāo)記RC6121tl ；
引物RC129產(chǎn)生條帶大小為695bp的母本特異標(biāo)記RC12 9695，產(chǎn)生條帶大小為690bp的父本特異標(biāo)記RC12969Q ； 引物RC242產(chǎn)生條帶大小為680bp的母本特異標(biāo)記RC242_，產(chǎn)生條帶大小分別為685bp 和 690bp 的父本特異標(biāo)記 RC242685 和 RC24269(I。所述的蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，其中步驟(I)可以按如下方法操作取“CSR24. 181”雜交制種所得Fl種子，在室內(nèi)采用沙床25°C條件下培育7_10天，長出2-3片嫩葉時，取其新鮮幼葉，按以下方法進(jìn)行基因組DNA提取取1-2片拇指蓋大小的新鮮蓖麻嫩葉裝入2. Oml離心管中，加液氮磨成粉末狀后，加入700ul CTAB提取液，充分搖勻，65°C水浴45-60 min，中途輕輕搖勻兩次；加入700ul氯仿異戊醇(24:1 )，充分搖勻后10000r/min離心5_10min取上清液，可重復(fù)1_2次；加入1/10體積的3M pH 5. 2的NaAC和等體積冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于_20°C冰箱冷凍靜置30min，10000r/min離心3min ;棄上清，將所得沉淀用70%的こ醇浸泡洗滌，中途換洗2_3次，風(fēng)干后充分溶于200ulTE緩沖液，每管加入2. 5 ul濃度為10mg/ml的RNase A，37°C水浴6小時或過夜；取少量DNA原液在紫外分光光度計或DNA濃度測量儀上進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測，其余的保存于_20°C冰箱備用；所述的 CTAB 提取液為100mM Tris-HCl, pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl,2%(ΤΑΒ，2%β -巰基こ醇，2% PVP ;所述的 TE 緩沖液為10mM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA-Na2pH 8. O0所述的蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，其中步驟(2)可以按如下方法操作Rco23、Rco26和Rco29引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25ul，包括DNA 50ng，I倍Buffer 緩沖液，dNTPsl50uM, Mg2+ I. 5Mm,正、反向引物各 O. 8uM, Taq DNA 聚合酶 IUnit ;擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為94°C Imin ；94°C lmin，62°C或60°C lmin,72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 10 min。引物 RC05、RC61、RC129 和 RC242 的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20ul，包括 DNA 20ng，I 倍 Buffer 緩沖液，dNTPs 100uM,Mg2+ 2mM，正、反向引物各 O. 2uM，Taq DNA聚合酶 IUnit ;擴(kuò)增程序為％°C 3min ；94°C 30 sec, 65°C 30 sec (_1°C/cycle)，72°C 45 86(，10個循環(huán)；94で 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，3O 個循環(huán)；72°C 10 min。所述的蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，其中步驟(3)可以按如下方法操作所述擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直板6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，50W恒定功率電泳60-90min，電泳結(jié)束后凝膠用蒸餾水稍沖洗后，銀染15min，漂洗3_5 sec，顯色液(2. 0%Na0H,O. 4%甲醛，O. 04%Na2C03)顯色，漂洗后在可見燈箱下觀察拍照。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著進(jìn)步
(I)本發(fā)明從所用的大量引物中篩選出能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生父、母本特異標(biāo)記條帶，帶型清晰、重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物RC023、RC026、RC029、RC05、RC61、RC129和RC242，作為蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子真?zhèn)魏图兌辱b定的特征引物。本鑒定方法所篩選的引物均能鑒定出具有父母本特異性條帶(見附圖1-7)。7對SSR引物在多次重復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，可有效用于鑒別蓖麻雜交種種子的真?zhèn)魏图兌龋欣诒吐樯唐贩N子快速高效的質(zhì)量控制，加快了蓖麻商品種子的質(zhì)量檢測進(jìn)程。(2)利用本發(fā)明的方法檢測蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子的純度，具有速度快、省時省エ、簡便、易行，鑒定準(zhǔn)確性高，結(jié)果穩(wěn)定，不受環(huán)境條件及發(fā)育時期影響的優(yōu)點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確地檢測蓖麻品種種子的真?zhèn)巍?br>

圖I為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物Rco23的PCR電泳圖譜。L 為 50bp DNA Ladder ;M 為“0 24. 181” 母本 “CSR24” ;F 為“0 24. 181” 父本 “CSR181 ” ；其中數(shù)字1-58分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、8、13、32、37、43、54、56和58單株 為真雜種。圖2為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物Rco26的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-58分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、8、13、32、37、43、54、56和58單株為真雜種。圖3為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物Rco29的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-58分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、7、8、13、32、37、43、54、55、56和58單株為真雜種。圖4為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物RC05的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-57分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、7、8、11、13、32、37、43、54、55和56單株為真雜種。圖5為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物RC61的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-57分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、8、11、13、27、32、37、43、54和56單株為真雜種。圖6為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物RC129的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-57分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、43和56單株為真雜種。圖7為蓖麻“CSR24. 181”雜交制種F1種子檢測特征引物RC242的PCR電泳圖譜。L 50bp DNA Ladder ；M :“CRS24. 181” 母本 “CSR24” ；F :“CRS24. 181” 父本 “CSR181” ；其中數(shù)字1-58分別表示“CSR24. 181”雜交制種F1種子的單株，箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記，同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24. 181”雜交種，如圖中4、5、6、7、8、11、13、32、37、43、54、55、56 和 58 單株為真雜種。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例的檢測方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。本實(shí)施例的實(shí)驗材料為蓖麻“CSR24. 181”的雜交制種F1種子及其親本材料種子。在室內(nèi)采用沙床25°C條件下培育7-10 天，取其新鮮嫩葉。本實(shí)施例的方法提取蓖麻嫩葉基因組DNA，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，統(tǒng)計結(jié)果并篩選特征引物。1、蓖麻基因組DNA提取
取1-2片拇指蓋大小的新鮮蓖麻嫩葉裝入2. Oml離心管中，加液氮磨成粉末狀后，加入700ul CTAB提取液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl，2% (ΤΑΒ，2%β-巰基こ醇，2% PVP)充分搖勻，65°C水浴45-60 min,中途輕輕搖勻兩次；加入700ul氯仿異戊醇(24:1)，充分搖勻后10000r/min離心5-10min取上清液，可重復(fù)ト2次;加入1/10體積的3M NaAC (pH 5. 2)和等體積冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于_20°C冰箱冷凍靜置30min，10000r/min離心3min ;棄上清,將所得沉淀用70%的こ醇浸泡洗漆，中途換洗2_3次,風(fēng)干后充分溶于 200ul TE緩沖液(IOmM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA-Na2 pH 8.0)，每管加入 2. 5ul RNase A (10mg/ml), 37°C水浴6小時或過夜；取少量DNA原液在紫外分光光度計或DNA濃度測量儀上進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測，其余的保存于_20°C冰箱備用。2、PCR擴(kuò)增及分子標(biāo)記分析
Rco23、Rco26和Rco29引物的反應(yīng)體系為25ul，包括DNA 50ng, I倍Buffer緩沖液，dNTPs 150uM, Mg2+ I. 5Mm，正、反向引物各O. 8uM，Taq DNA聚合酶lUnit。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為94°C lmin ；94°C lmin，62°C或 60°C lmin,72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 10 min。另外4對引物(RC05、RC61、RC129和RC242)的反應(yīng)體系為20ul，其中 DNA 20ng，I 倍 Buffer 緩沖液，dNTPs IOOuM, Mg2+ 2mM，正、反向引物各 O. 2uM，Taq DNA聚合酶 lUnit。擴(kuò)增程序為％°C 3min ；94°C 30 sec,65°C 30 sec (-1°C /cycle), 72°C45 sec，10 個循環(huán)；94°C 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，3O 個循環(huán)；72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直板6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，50W恒定功率電泳60-90min。電泳結(jié)束后，將兩塊玻璃板分離開來，將粘膠板用雙蒸水漂洗3_5秒；稍浙干，放入銀染液(AgNO3 lg/L,0. 056%甲醒,共2L,可重復(fù)利用)中染色15min ;染色過程中配顯色液(2. 0%Na0H，0. 4%甲醛，O. 04%Na2C03，可重復(fù)使用，重復(fù)使用時加l_2ml甲醛，天氣太冷時可適當(dāng)加熱顯色液，以便快速顯色)，染色將結(jié)束時，把顯色液倒入顯色盒中備用；染色結(jié)束后，雙蒸水漂洗3-5秒；顯色盒中顯色，待條帶清晰可見吋，終止顯色，再用蒸餾水漂洗；最后在可見燈箱下觀察拍照。3、篩選純度鑒定的特征引物
從所用的引物中篩選出具有父、母本特征帶、能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生父、母本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓逦⒅貜?fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物7對，分別為RCO23、RCO26、RCO29、RC05、RC61、RC129和RC242，可作為蓖麻雜交種“CRS24. 181”種子真實(shí)性和/或品種純度鑒定的特征引物(見附圖1-7)。7對引物序列為
引物Rco23
FCATGGATGTAGAGGGTCGATRCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26
F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT
RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29
FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG
RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05
FCATCACCTCTATCCATCCGTTT
RCCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61
F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC
R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129
FTACTGCAACTCAATCCACTGCT
RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242
F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT
R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT
其中
引物Rco23產(chǎn)生條帶大小分別為440bp和600bp的母本特異標(biāo)記Rco2344(l和Rco23_，產(chǎn)生條帶大小分別為400bp和580bp的父本特異標(biāo)記Rco234qq和Rco2358(l ；
引物Rco26產(chǎn)生條帶大小為700bp的母本特異標(biāo)記Rco26■，產(chǎn)生條帶大小為705bp的父本特異標(biāo)記Rco267(i5 ；
引物Rco29產(chǎn)生條帶大小為560bp的母本特異標(biāo)記Rco2956(l，產(chǎn)生條帶大小為580bp的父本特異標(biāo)記Rco2958(i ；
引物RC05產(chǎn)生條帶大小分別為330bp和570bp的母本特異標(biāo)記RC0533(I和RC0557(I，產(chǎn)生條帶大小分別為360bp和600bp的父本特異標(biāo)記RC0536(i和RC05_ ；
引物RC61產(chǎn)生條帶大小為220bp的母本特異標(biāo)記RC6122(I，產(chǎn)生條帶大小為210bp的父本特異標(biāo)記RC6121tl ；
引物RC129產(chǎn)生條帶大小為695bp的母本特異標(biāo)記RC12 9695，產(chǎn)生條帶大小為690bp的父本特異標(biāo)記RC12969Q ；
引物RC242產(chǎn)生條帶大小為680bp的母本特異標(biāo)記RC242_，產(chǎn)生條帶大小分別為685bp 和 690bp 的父本特異標(biāo)記 RC242685 和 RC24269(I。
4、利用特征引物對種子進(jìn)行遺傳純度鑒定
應(yīng)用篩選到的特征引物，對雜交種“ CSR24. 181 ”進(jìn)行純度鑒定，步驟為DNA提取，PCR擴(kuò)增分析，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳，結(jié)果分析及統(tǒng)計。具體操作步驟同上。同時具有親本特異標(biāo)記條帶的單株則為真正的雜交種。 通過應(yīng)用多對特征引物對雜種單株幼苗的標(biāo)記基因型進(jìn)行分析，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即可記為雜交種的遺傳純度。這7對引物在多次重復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，分析結(jié)果可相互驗證和補(bǔ)充，可以準(zhǔn)確地鑒定蓖麻雜交種純度。
權(quán)利要求
1.蓖麻雜交種“CSR24. 181”種子純度的檢測方法，包括以下步驟 (1)提取蓖麻雜交種種子幼苗葉片基因組DNA； (2)以所述的基因組DNA為模板，選用SSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的SSR引物序列選自如下的一種或多種 引物Rco23 FCATGGATGTAGAGGGTCGATRCAGCCAAGCCAAAGATTTTC引物Rco26F TTGCTTGTCAAAGGGGAGTT RTCATTTTGAGGGAGAAACCA引物Rco29 FGGAGAAAAGAAAGGGAGAAGG RGCCAAAAGCACACTTAATTTGA引物RC05F CATCACCTCTATCCATCCGTTT R CCTTCATCATTGAACTCCCTTC引物RC61F GCACTGAGGGTTAATTCTGGAC R GTCGTAGACCACCTTAGCATCC引物RC129FTACTGCAACTCAATCCACTGCT RGATAGTGCCTTTGCCTCTTTTC引物RC242F ACCCCTGCAAAACCCTAATAAT R TTCGGTGTAAAGAATCCGACTT (3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳； (4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24.181”雜交種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為其品種種子的純度；其中 引物Rco23產(chǎn)生條帶大小分別為440bp和600bp的母本特異標(biāo)記Rco2344(l和Rco23_，產(chǎn)生條帶大小分別為400bp和580bp的父本特異標(biāo)記Rco234qq和Rco2358(l ； 引物Rco26產(chǎn)生條帶大小為700bp的母本特異標(biāo)記Rco26■，產(chǎn)生條帶大小為705bp的父本特異標(biāo)記Rco267(i5 ； 引物Rco29產(chǎn)生條帶大小為560bp的母本特異標(biāo)記Rco2956(l，產(chǎn)生條帶大小為580bp的父本特異標(biāo)記Rco2958(i ； 引物RC05產(chǎn)生條帶大小分別為330bp和570bp的母本特異標(biāo)記RC0533(I和RC0557(I，產(chǎn)生條帶大小分別為360bp和600bp的父本特異標(biāo)記RC0536(i和RC05_ ； 引物RC61產(chǎn)生條帶大小為220bp的母本特異標(biāo)記RC6122(I，產(chǎn)生條帶大小為210bp的父本特異標(biāo)記RC6121tl ； 引物RC129產(chǎn)生條帶大小為695bp的母本特異標(biāo)記RC12 9695，產(chǎn)生條帶大小為690bp的父本特異標(biāo)記RC12969Q ； 引物RC242產(chǎn)生條帶大小為680bp的母本特異標(biāo)記RC242_，產(chǎn)生條帶大小分別為685bp 和 690bp 的父本特異標(biāo)記 RC242685 和 RC24269(I。
2.如權(quán)利要求I所述的蓖麻雜交種“CSR24.181”種子純度的檢測方法，其特征在于步驟(I)中取“CSR24. 181”雜交制種所得Fl種子，在室內(nèi)采用沙床25 °C條件下培育7_10天，長出2-3片嫩葉時，取其新鮮幼葉，按以下方法進(jìn)行基因組DNA提取取1-2片拇指蓋大小的新鮮蓖麻嫩葉裝入2. Oml離心管中，加液氮磨成粉末狀后，加入700ul CTAB提取液，充分搖勻，65°C水浴45-60 min，中途輕輕搖勻兩次；加入700ul氯仿異戊醇(24:1 )，充分搖勻后10000r/min離心5-10min取上清液，可重復(fù)1_2次；加入1/10體積的3M pH 5. 2的NaAC和等體積冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于_20°C冰箱冷凍靜置30min，10000r/min離心3min ;棄上清，將所得沉淀用70%的乙醇浸泡洗滌，中途換洗2_3次，風(fēng)干后充分溶于200ulTE緩沖液，每管加入2. 5 ul濃度為10mg/ml的RNase A，37°C水浴6小時或過夜；取少量DNA原液在紫外分光光度計或DNA濃度測量儀上進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測，其余的保存于_20°C 冰箱備用；所述的 CTAB 提取液為100mM Tris-HCl, pH 8. 0,50mM EDTA-Na2,1. 4M NaCl,2% CTAB，2%3 -巰基乙醇，2% PVP ;所述的 TE 緩沖液為10mM Tris-HCl pH 8. 0, ImM EDTA-Na2pH 8. O0
3.如權(quán)利要求I所述的蓖麻雜交種“CSR24.181”種子純度的檢測方法，其特征在于步驟(2)中Rco23、Rco26和Rco29引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25ul，包括DNA 50ng, I倍Buffer 緩沖液，dNTPsl50uM, Mg2+ I. 5Mm,正、反向引物各 0. 8uM, Taq DNA 聚合酶 IUnit ;擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為94°C Imin ；94°C lmin，62°C或60°C lmin,72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 10 min ;引物 RC05、RC61、RC129 和 RC242 的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20ul，包括 DNA 20ng，I 倍 Buffer 緩沖液，dNTPs 100uM,Mg2+ 2mM，正、反向引物各 0. 2uM，Taq DNA聚合酶 IUnit ;擴(kuò)增程序為95°C 3min ；94°C 30 sec, 65°C 30 sec (-1°C/cycle),72°C 45 86(3，10個循環(huán)；941 30 sec, 55°C 30 sec (-1°C /cycle) ,72°C 45 sec，30 個循環(huán)；72°C 10 min。
4.如權(quán)利要求I所述的蓖麻雜交種“CSR24.181”種子純度的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直板6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，50W恒定功率電泳60-90min，電泳結(jié)束后凝膠用蒸餾水稍沖洗后，銀染15min，漂洗3_5 sec,顯色液(2. 0%Na0H,0. 4%甲醛，0. 04%Na2C03)顯色，漂洗后在可見燈箱下觀察拍照。
全文摘要
蓖麻雜交種“CSR24.181”種子純度的檢測方法，包括以下步驟(1)提取蓖麻雜交種種子幼苗葉片基因組DNA；(2)以所述的基因組DNA為模板，選用特定SSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；(4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“CSR24.181”雜交種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為其品種種子的純度。本發(fā)明的檢測方法具有快速直觀、便捷易行、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)常規(guī)純度檢測工作的不足。
文檔編號C12Q1/68GK102618629SQ20111029334
公開日2012年8月1日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者嚴(yán)興初, 嚴(yán)明芳, 汪磊, 王力軍, 譚美蓮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所