專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改變的類(lèi)胡蘿卜素含量的生物體以及制備其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因改變的生物體(有機(jī)體)以及制備其的手段和方法，所述生物體產(chǎn)生提高含量的類(lèi)胡蘿卜素八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素(zeta carotene)或它們的組合。
背景技術(shù)：
類(lèi)胡蘿卜素是40-碳的類(lèi)異戊二烯色素，其由所有植物、藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌以及由幾種非光合作用的細(xì)菌和真菌合成。在植物中，類(lèi)胡蘿卜素是在質(zhì)體內(nèi)合成的。質(zhì)體中類(lèi)異戊二烯生物合成的主要途徑是從產(chǎn)生異戊基二磷酸酯(IPP)開(kāi)始的，異戊基二磷酸酯是一種C5分子，其為在2-C-甲基-d-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑中阻止來(lái)自丙酮酸鹽和甘油醛3_磷酸的所有長(zhǎng)鏈類(lèi)異戊二烯的構(gòu)造。在IPP異構(gòu)化成二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)之后，使三個(gè)另外的IPP分子結(jié)合以獲得C2tl分子，香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP)。這些I’-4縮合反應(yīng)是由異戊烯基轉(zhuǎn)移酶-型酶GGPP合酶催化的。有證據(jù)表明在植物中，同樣的酶，GGPP合酶，進(jìn)行從DMAPP到GGPP的所有反應(yīng)。類(lèi)胡蘿卜素的聚烯鏈可以從3延伸至15個(gè)共軛雙鍵，其是引起類(lèi)胡蘿卜素特征吸收光譜的原因并且賦予特定光化學(xué)性質(zhì)。由于這些性質(zhì)，類(lèi)胡蘿卜素在所有光合生物中是必要組分，其中它們實(shí)現(xiàn)光合作用中不可缺少的功能。類(lèi)胡蘿卜素在植物繁殖中也發(fā)揮作用，通過(guò)向花和果實(shí)提供特定的著色，以吸引動(dòng)物并增強(qiáng)授粉和種子的散播。在這些器官中發(fā)現(xiàn)的許多橙色、黃色或紅色是通過(guò)高濃度的類(lèi)胡蘿卜素在色質(zhì)體(色素體，chromoplasts)中積累產(chǎn)生的。此外，類(lèi)胡蘿卜素的降解產(chǎn)物包括芳香和風(fēng)味化合物,并且它們?cè)诠麑?shí)中的存在吸引動(dòng)物。在過(guò)去的十年 中，已經(jīng)在分子水平上描述了植物中類(lèi)胡蘿卜素的生物合成(例如，在 Lu，S.和 Li, L.2008.J.1ntegr.Plant Biol.50:778-785 中綜述)。類(lèi)胡蘿卜素途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是兩個(gè)GGDP分子的頭對(duì)頭縮合以產(chǎn)生八氫番茄紅素，第一種C40類(lèi)胡蘿卜素，其是由酶八氫番茄紅素合酶(PSY)催化的。向八氫番茄紅素的C40鏈中插入共軛雙鍵(胡蘿卜素脫飽和)導(dǎo)致形成可見(jiàn)的聚烯生色團(tuán)(發(fā)色團(tuán))。植物胡蘿卜素脫飽和是膜結(jié)合的復(fù)雜反應(yīng)次序。通過(guò)兩種酶，即八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(ZDS)向八氫番茄紅素中引入四個(gè)雙鍵，各自分別催化兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的脫飽和步驟以獲得胡蘿卜素和番茄紅素(圖1)。最近建立了在途徑的該部分中的所有中間體都是順式構(gòu)型的，并且特定的異構(gòu)酶，即CRTIS0，與ZDS聯(lián)合作用以產(chǎn)生全反式番茄紅素(Isaacson, T.et al.2002.PlantCell 14:333-342; Isaacson, T.et al.2004.Plant Physiol.136:4246-4255 ; Park, H.etal.2002.Plant Cell 14:321-332)。此外，已預(yù)期了其他酶和輔因子對(duì)該過(guò)程是必要的，包括指定的ζ-1SO因子，其參與15-順-ζ-胡蘿卜素的異構(gòu)化(Li F.et al.2007.PlantPhysiol.144:1181-1189)。胡蘿卜素脫飽和是氧化還原反應(yīng)，與延長(zhǎng)的氧化還原鏈有關(guān)，采用醌類(lèi)作為中間體以及氧作為最終電子受體。通過(guò)質(zhì)體“末端”(“交替”)氧化酶來(lái)還原分子氧。由于這種復(fù)雜性和涉及的酶的膜結(jié)合的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，PDS-ZDS脫飽和系統(tǒng)從未用純化的蛋白質(zhì)在體外重建。在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)之后公開(kāi)的Chen Y等人的論文描述了 Z-1SO基因的分離和特征，并且提出編碼的蛋白質(zhì)在PDS產(chǎn)物中存在的15-順式鍵的異構(gòu)化中發(fā)揮作用，9，15，9’-三-順-ζ-胡蘿卜素以形成ZDS底物9，9’-二-順-ζ-胡蘿卜素。通過(guò)番茄紅素β -環(huán)化酶(Lcyb )或番茄紅素ε -環(huán)化酶(Lcye )使番茄紅素環(huán)化，分別產(chǎn)生了胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。環(huán)狀胡蘿卜素的氧化產(chǎn)生葉黃素。在細(xì)菌中，單獨(dú)的八氫番茄紅素脫飽和酶，CrtI，進(jìn)行八氫番茄紅素向反式番茄紅素的轉(zhuǎn)化。出乎意料地，轉(zhuǎn)基因的CrtI脫飽和酶在植物中是活性的。在植物中，類(lèi)胡蘿卜素也是生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子和發(fā)育信號(hào)的前體。激素脫落酸(ABA)是由葉黃素紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)產(chǎn)生的。最近已發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜素的裂解衍生物，可能為13-阿樸-β -胡蘿卜素酮，充當(dāng)擬南芥中側(cè)芽分枝的嫁接轉(zhuǎn)移抑制劑。全世界正日益關(guān)注農(nóng)作物中維生素和其他功能性養(yǎng)分的含量的增加(DellaPenna, D.1999.Science 285:375-379;Lindsay, D.G.2000.Trends inFood Sc1.Technol.11:145-151)。類(lèi)胡蘿卜素在確定果實(shí)和蔬菜的質(zhì)量參數(shù)中發(fā)揮著重要的作用(在van den Berg, H.et al.2000.J.Sc1.Food Agric.80:880-912 中綜述)。含有 β-環(huán)的所有類(lèi)胡蘿卜素物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化成視黃醇，因而是維生素A的前體(前維生素Α)。盡管人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)中類(lèi)胡蘿卜素至關(guān)重要，但是另外的健康益處歸因于它們?cè)隗w內(nèi)的抗氧化劑活性(Stahl，W.and Sies, H.2003.Mol.Aspects Med.24:345-351)。葉黃素(特別是黃體素)的消耗與預(yù)防年齡相關(guān)的黃斑變性有關(guān)。流行病學(xué)研究已經(jīng)將類(lèi)胡蘿卜素與降低人類(lèi)中癌癥和其它疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)(Cooper, D.A.2004.J Nutr.134:221S-224S)。特定的健康益處已經(jīng)歸因于類(lèi)胡蘿卜素八氧番爺紅素和六氧番爺紅素(Shaish, A.et al.2008.Plant Foods Hum.Nutr.63:83-86)。已報(bào)道了在人類(lèi)中從基于番爺?shù)漠a(chǎn)物中對(duì)八氫番爺紅素和六氫番爺紅素的重要吸收(Aust, 0.et al .2005)，并且發(fā)現(xiàn)了正常的和前列腺腫瘤細(xì)胞容易吸收它們(Campbell，J.K.et al.2007.Nutr.Res.27:794-801)。在動(dòng)物模型中證實(shí)了八氫番茄紅素作為有效的防曬霜(Mathews-Roth, Μ.M.and Pathak, Μ.A.1975.Photochem.Photobiol.21:261-263)。八氫番茄紅素和六氫番茄紅素吸收紫外線(xiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光。八氫番茄紅素的吸收光譜是276-297nm (主峰為285_287nm)，并且六氫番茄紅素的是331-367 (主峰為348醒)。ζ-胡蘿卜素的吸收光譜是374-425nm (主峰為395-400nm)。因此，這些類(lèi)胡蘿卜素可以用作防曬霜以保護(hù)皮膚防止紫處線(xiàn)(UV)光線(xiàn)造成的損傷。實(shí)際上，在食用基于番茄的食物或提取物的人類(lèi)中證實(shí)了保護(hù)皮膚免于UV光線(xiàn)(Stahl，W.et al.2001.J.Nutr.131:1449-1451)，并且這種效果歸因于八氫番茄紅素和六氫番茄紅素(Aust，0.etal.2005.1nt.J.Vitam.Nutr.Res.75:54-60)?；谶@些研究，已經(jīng)提示了飲食的類(lèi)胡蘿
卜素可以有助于終身防止有害的UV福射(Stahl, ff.et al.2006.Photochem.Photobiol.Sc1.5:238-242)。之前的研究支持了使用八氫番茄紅素和六氫番茄紅素作為防曬霜的潛力，這些研究顯示除了口服補(bǔ)充之外結(jié)合用類(lèi)胡蘿卜素局部治療的益處(Palombo，P.et al.2007.SkinPharmacol.Physiol.20:199-210)。已經(jīng)報(bào)道了在向杜氏藻的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入達(dá)草滅(4-氯-5 (甲氨基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-3(2H)_噠嗪酮)之后，八氫番爺紅素和在一定程度上六氫番爺紅素的積累(Ben Amotz, A.et al.1987J.Phycol.，23:176-181)。然而，使用這種化學(xué)品僅在培養(yǎng)生長(zhǎng)的生物體中是可能的。作為類(lèi)胡蘿卜素途徑中的第一種成分的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的量在包含類(lèi)胡蘿卜素的生物體中是相對(duì)較低的。考慮到對(duì)于八氫番茄紅素和六氫番茄紅素報(bào)道的有益效果，具有高的量的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體是公認(rèn)需要的并且將是高度有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及 用于改變類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中組分的表達(dá)的生物技術(shù)手段(途徑，方式，means)和方法，從而朝向八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ -胡蘿卜素或其組合中的至少一種的積累而減少類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有提高的含量的這些類(lèi)胡蘿卜素的基因改變的生物體以及生產(chǎn)其的方法。本發(fā)明部分地基于以下預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)，即與相應(yīng)的野生型番茄相比，包含ζ -突變體的番茄植物(番茄植株)產(chǎn)生具有提高量的類(lèi)胡蘿卜素八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和胡蘿卜素的果實(shí)。在番茄植物的花、根和黃葉中也測(cè)得了提高含量的這些類(lèi)胡蘿卜素。在本發(fā)明中第一次表征了突變和編碼的蛋白質(zhì)，以及野生型番茄基因和蛋白質(zhì)的序列。不希望受到任何特定理論或作用機(jī)制的約束，需要蛋白質(zhì)(指定為Ziso)使ζ-胡蘿卜素適當(dāng)?shù)漠悩?gòu)化。如在番茄植物中證明的，在ζ-突變體中，特別是在包含色質(zhì)體的細(xì)胞中其活性的缺少或缺乏，在產(chǎn)生胡蘿卜素產(chǎn)生之后阻斷了類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑，導(dǎo)致前述組分的積累，主要是八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。因而本發(fā)明提供了用于抑制Ziso蛋白表達(dá)和/或功能的手段(方式，途徑)和方法。結(jié)果，阻止或削弱了在胡蘿卜素異構(gòu)化遠(yuǎn)側(cè)的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，從而導(dǎo)致八氫番爺紅素和六氫番爺紅素的積累。在一些實(shí)施方式中，至今積累的八氫番爺紅素和六氫番爺紅素沒(méi)有離開(kāi)總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15%的六氫番爺紅素和25%的八氫番爺紅素的量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了基因改變的生物體，特別是高等植物，與未改變的生物體相比，具有降低的Ziso表達(dá)或活性以及提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素以及可選地另外的 -胡蘿卜素中的至少一種。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基因改變的產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體，相比于相應(yīng)未改變的生物體，其包含具有降低的Ziso表達(dá)或活性的至少一種細(xì)胞，其中，與相應(yīng)未改變的生物體相比，該基因改變的生物體具有提高含量的至少一種類(lèi)胡蘿卜素，其選自由八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素和它們的組合組成的組。根據(jù)某些實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物體含有提高含量的八氫番茄紅素。根據(jù)另外的實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物含有提高含量的六氫番爺紅素。根據(jù)又一實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物含有提高含量的八氫番爺紅素和六氫番爺紅素的組合。根據(jù)某些實(shí)施方式，具有降低的Ziso表達(dá)或活性的細(xì)胞是包含色質(zhì)體的細(xì)胞。根據(jù)其他實(shí)施方式，具有降低的Ziso表達(dá)或活性的細(xì)胞是非光合的組織。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)某些實(shí)施方式，產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體選自由植物、藻類(lèi)和藻青菌組成的組。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體是植物。根據(jù)其他典型的實(shí)施方式，植物是番茄植物。當(dāng)生物體是植物時(shí)，提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿卜素或其組合存在于植物的至少一種器官中。根據(jù)典型的實(shí)施方式，器官選自由果實(shí)和根組成的組。根據(jù)另外典型的實(shí)施方式，提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和胡蘿卜素中的至少一種存在于肉質(zhì)果實(shí)組織中。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。
抑制Ziso蛋白的表達(dá)或活性可以通過(guò)各種手段實(shí)現(xiàn)，所有這些手段明確地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)某些實(shí)施方式，使用各種干擾Ziso基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的分子(例如反義、siRNA、核酶、或DNA酶)，可以在基因和/或轉(zhuǎn)錄水平上影響抑制Ziso的表達(dá)。也可以使用向Ziso基因中插入突變，包括缺失、插入、部位特異性突變、由鋅指核酸酶介導(dǎo)的突變等，只要突變導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)或非功能性蛋白質(zhì)?？商鎿Q地，可以在蛋白質(zhì)水平上抑制表達(dá)，例如使用裂解多肽的拮抗物、酶，等等。根據(jù)某些實(shí)施方式，生物體的野生型未改變的Ziso蛋白包含以下氨基酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO: 3中給出的氨基酸序列。根據(jù)典型的實(shí)施方式，未改變的Ziso蛋白包含在SEQ ID N0:3中給出的氨基酸序列。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)另外的實(shí)施方式，野生型未改變的Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2中的任一個(gè)中給出的核酸序列。根據(jù)典型的實(shí)施方式，未改變的Ziso基因包含在SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2中的任一個(gè)中給出的核酸序列。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)某些實(shí)施方式，基因改變的生物體含有突變的Ziso基因。通過(guò)如本領(lǐng)域已知的任何方法，包括應(yīng)用誘變性化學(xué)品或輻射，可以將突變施加在多種生物體中。然后對(duì)多種生物體篩選出類(lèi)胡蘿卜素生物合成阻斷在胡蘿卜素，特別是積累9，15，9’-三-順-ζ-胡蘿卜素的階段的特定表型。也可以通過(guò)分子tilling (定向誘導(dǎo)基因組局部突變)的方法對(duì)多種生物體篩選出Ziso基因中的特定突變體(McCallum，C.M.etal.2000.Nat Biotechnol.18:455-457)。任何對(duì)具有期望表型的生物體進(jìn)一步篩選出相比于未改變的生物體具有提高含量的八氫番茄紅素和/或六氫番茄紅素。根據(jù)一些實(shí)施方式，突變基因編碼非功能性Ziso蛋白。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，突變基因包含在SEQ IDN0:4(指定的ZETA°°89)中給出的核酸序列，其編碼具有SEQ ID NO:5的非功能性Ziso蛋白。根據(jù)另外典型的實(shí)施方式，突變基因包含在SEQ ID NO:6 (指定的ZETA28tl3)中給出的核酸序列，其編碼具有SEQ ID NO: 7的非功能性Ziso蛋白。根據(jù)另外的實(shí)施方式，基因改變的生物體是轉(zhuǎn)基因的生物體，其包含至少一個(gè)含有Ziso沉默分子的細(xì)胞，該Ziso沉默分子選自由RNA干擾分子、反義分子和編碼核酶的分子組成的組。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以設(shè)計(jì)Ziso沉默分子。根據(jù)某些實(shí)施方式，沉默分子包含具有基本上與表達(dá)的Ziso基因的區(qū)域互補(bǔ)的核酸序列的多核苷酸。根據(jù)某些實(shí)施方式，Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中給出的核酸序列。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因包含在SEQ ID N0:2中給出的核酸序列。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。
根據(jù)某些實(shí)施方式,互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度為20-500個(gè)核苷酸。根據(jù)一些實(shí)施方式,互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度為20-50個(gè)核苷酸,典型地20-30個(gè)核苷酸。根據(jù)其他實(shí)施方式，互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度為100-400個(gè)核苷酸，典型地200-300個(gè)核苷酸。根據(jù)某些實(shí)施方式，沉默分子是反義RNA。根據(jù)其他實(shí)施方式，沉默分子是RNA干擾(RNAi)分子。根據(jù)另外的實(shí)施方式，RNAi分子被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生靶向Ziso基因的dsRNA，該Ziso基因具有以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中給出的核酸序列。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因具有在SEQ ID N0:2中給出的核酸序列。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)一些實(shí)施方式，本發(fā)明的沉默分子被合并到DNA構(gòu)建體中，使得它們?cè)谏矬w的細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)某些實(shí)施方式，細(xì)胞是包含色質(zhì)體的細(xì)胞。根據(jù)其他實(shí)施方式，細(xì)胞在非光合的組織內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知DNA構(gòu)建體適于特定生物體，包括植物、藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)表達(dá)調(diào)節(jié)元件,該表達(dá)調(diào)節(jié)元件選自由啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、復(fù)制起始子、轉(zhuǎn)錄終止序列、多聚腺苷酸化信號(hào)等組成的組。典型地，啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。根據(jù)某些實(shí)施方式，組織是包含色質(zhì)體的組織。根據(jù)其他實(shí)施方式，組織是非光合的組織。當(dāng)生物體是植物時(shí)，啟動(dòng)子典型地特異于選自由根、塊莖、果實(shí)、花和種子組成的組中的組織。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的基因改變的生物體具有基因改變的細(xì)胞的總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少25% (w / w)的八氫番爺紅素含量。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式,八氫番爺紅素含量為基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素(w / w)總量的至少30%，更典型地至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)其他實(shí)施方式，本發(fā)明的基因改變的生物體具有基因改變的細(xì)胞的總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15% (w / w)的六氫番爺紅素含量。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式,六氫番爺紅素的含量為基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素(w / w)總量的至少20%，更典型地至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)還另外的實(shí) 施方式，本發(fā)明的基因改變的生物具有總的類(lèi)胡蘿卜素含量的至少30% (w / w)的結(jié)合水平(組合水平，合并水平)的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，組合水平的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素是基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素(w / W)總量的至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。明顯地應(yīng)理解，當(dāng)生物體是植物時(shí)，八氫番茄紅素、六氫番茄紅素或它們的組合的百分比是指它們?cè)谥辽僖粋€(gè)植物器官中的百分比。根據(jù)典型的實(shí)施方式，植物器官選自根、塊莖、果實(shí)、花和種子。源于基因改變的細(xì)胞或生物體的基因改變的細(xì)胞和組織培養(yǎng)物的懸浮液也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。細(xì)胞懸浮液和組織培養(yǎng)物可以用于產(chǎn)生八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、
胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種，然后其從細(xì)胞或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提取。可替換地，基因改變的細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)物用于重新生成生物體，該生物體具有降低的Ziso蛋白表達(dá)，從而具有如在本文中披露的提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種。
在其中生物是植物的實(shí)施方式中，本發(fā)明也包括基因改變的植物的種子，其中由所述種子生長(zhǎng)的植物相比于由相應(yīng)未改變的種子生長(zhǎng)的植物具有降低的Ziso表達(dá)，從而具有如在本文中披露的提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種。由本發(fā)明的基因改變的植物產(chǎn)生的包括果實(shí)和塊莖(分別具有總類(lèi)胡蘿
卜素含量的至少25%和15%的八氫番爺紅素和六氫番爺紅素含量)的可食用部分也明確地包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了在生物體的至少一個(gè)細(xì)胞中提高八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素或其組合中的至少一種的含量的方法，包括在至少一個(gè)細(xì)胞中抑制Ziso蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生具有提高量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿卜素或其組合的生物體。根據(jù)某些實(shí)施方式，抑制Ziso表達(dá)包括在Zi so編碼基因中引入突變，其中突變導(dǎo)致Ziso基因降低的表達(dá)或非功能性Ziso蛋白的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以使用如在本文中披露的以及如本領(lǐng)域已知的任何用于在Ziso基因中引入突變的方法。根據(jù)一些實(shí)施方式，抑制Ziso表達(dá)包括用設(shè)計(jì)成沉默Ziso基因的表達(dá)的分子轉(zhuǎn)化生物體的至少一個(gè)細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO: 2中給出的核酸序列。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因包含SEQ ID Ν0:2中給出的核酸序列。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方 式。根據(jù)某些實(shí)施方式，沉默分子選自由反義分子、RNAi分子、編碼核酶的多核苷酸等組成的組。根據(jù)某些實(shí)施方式，由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的生物體具有總類(lèi)胡蘿卜素的至少25%(w / w)的八氫番茄紅素含量，或總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15% (w / w)的六氫番茄紅素含量，或總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少30% (w / w)的結(jié)合水平的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。根據(jù)其他實(shí)施方式，生物體是植物，在其至少一個(gè)器官中具有提高的類(lèi)胡蘿卜素含量。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了編碼非功能性Ziso蛋白的分離的多核苷酸，該非功能性Ziso蛋白具有選自由SEQ ID Ν0:5和SEQ ID NO:7組成的組中的氨基酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方式，分離的多核苷酸包括分別在SEQ ID Ν0:4和6中給出的核酸序列。 從以下描述和附圖，本發(fā)明的其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。


圖1示出了在植物中從香葉基香葉基二磷酸酯到β-胡蘿卜素的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的示意圖。CRTIS0，胡蘿卜素異構(gòu)酶；CYC-B，色質(zhì)體特異性番茄紅素β-環(huán)化酶；GGPP,香葉基香葉基二磷酸酯；LCY-B，番茄紅素β -環(huán)化酶；LCY-E，番茄紅素ε -環(huán)化酶；ros，八氫番茄紅素脫飽和酶；psy，八氫番茄紅素合酶；zds，ζ -胡蘿卜素脫飽和酶；ziso，
胡蘿卜素異構(gòu)酶。圖2是番茄在基因座ζ (ZETA)附近的區(qū)域中的染色體#12上的基因圖的示意圖。Z (ZETA)位于標(biāo)記CT80B和Atlg48300之間。表明了含有覆蓋這些標(biāo)記的番茄基因組序列的BAC克隆。圖3示出了來(lái)自番茄的基因Ziso的基因組序列(用粗字體表示預(yù)期的外顯子序列)。圖4示出了來(lái)自番茄(cv M82)的基因Ziso的cDNA序列。標(biāo)記了起始密碼子(ATG)和終止密碼子。圖5示出了來(lái)自番茄ζ -突變體等位基因z°_的基因Ziso的cDNA序列，表明了突變產(chǎn)生新終止密碼子(圖5A);來(lái)自番茄ζ突變體等位基因ζ2°83的基因Ziso的cDNA序列，表明了突變產(chǎn)生新終止密碼子(圖5B);以及來(lái)自野生型番茄(CV M82)和ζ突變體(等位基因z2°83和z_)的多肽ZISO的氨基酸序列的排列，如由cDNA序列推斷的(圖5C)。圖6示出了攜帶突變?chǔ)频牧鶄€(gè)F2繁殖系的果實(shí)中類(lèi)胡蘿卜素的組成[yg/gFffJ0圖7給出了來(lái)自野生型番茄(CV M82)的多肽ZISO以及來(lái)自細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942的SynpCC7942_1979 (ZIS0 7942)的ζ樣基因產(chǎn)物的氨基酸序列的排列。用黑色背景上的白色字體標(biāo)記同一性；用灰色背景上的黑色字體標(biāo)記相似性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及在類(lèi)胡蘿卜素合成生物體中，用于產(chǎn)生八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、 胡蘿卜素或其組合中的至少一種的手段和方法。特別地，本發(fā)明涉及通過(guò)生物技術(shù)
手段(方法，途徑)而基因改變的生物體，其中抑制了 Ziso蛋白的表達(dá)或活性，使得在產(chǎn)生9，15，9’ -三-順-ζ -胡蘿卜素之后阻斷類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑，并且在基因改變的細(xì)胞中八氫番茄紅素和/或六氫番茄紅素分別積累至總類(lèi)胡蘿卜素水平的至少25%和15%(w /w)的水平。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，生物體是植物，典型地是番茄植物。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體”指的是能夠天然產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體，其中類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑包括胡蘿卜素異構(gòu)化的步驟。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，生物體選自由植物、藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌組成的組。術(shù)語(yǔ)“基因改變的生物體”指的是包含至少一種人為基因改變的細(xì)胞的生物體?；蚋淖儼ㄒ粋€(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的改變，例如通過(guò)向感興趣的內(nèi)源性多核苷酸或基因中引入一個(gè)或多個(gè)突變、缺失、插入、一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座因子(轉(zhuǎn)座元件)等。另外或可替換地，基因改變包括用異源多核苷酸轉(zhuǎn)化生物體的細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體。術(shù)語(yǔ)“八氫番茄紅素”指的是15Ζ-7, 8, 11，12，7’，8’，11’，12’-八氫-Ψ，Ψ-胡蘿卜素。術(shù)語(yǔ)“六氫番茄紅素”指的是15Ζ-7, 8，11，12，7’，8’ -六氫-Ψ，Ψ -胡蘿卜素。術(shù)語(yǔ)“ ζ - 胡蘿卜素”指的是7，8，7’，8’ -四氫-Ψ，Ψ -胡蘿卜素。術(shù)語(yǔ)“三-順-ζ -胡蘿卜素”指的是9Ζ, 15Ζ, 9’ Ζ-7，8，7’，8’ -四氫-Ψ，Ψ -胡蘿卜素。術(shù)語(yǔ)“Ziso”和“Ziso蛋白”在本文中交替使用，并且指的是ζ_胡蘿卜素的異構(gòu)化所必需存在的或活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)某些實(shí)施方式，天然的未改變的Ziso蛋白包括在SEQ ID Ν0:3中給出的氨基酸序列或同源于其的序列。應(yīng)明確地理解，具有相同功能的番茄Ziso的同源體，即使與番茄蛋白質(zhì)共享低的序列同一性，也包含在本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)，“順式類(lèi)胡蘿卜素”指的是具有以順式方向連接兩個(gè)碳的至少一個(gè)雙鍵的類(lèi)胡蘿卜素。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“ ζ胡蘿卜素異構(gòu)化”指的是將9，9’-15-順-ζ-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)?，9’ -順-ζ -胡蘿卜素。術(shù)語(yǔ)“基因”指的是包含產(chǎn)生RNA或多肽所必需的編碼序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可以由全長(zhǎng)編碼序列或其任何部分編碼。當(dāng)引用基因時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“其部分”指的是該基因的片段。片段的尺寸可以在幾個(gè)氨基酸至整個(gè)基因序列減去一個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。因此，“包含基因的至少一部分的核酸序列”可以包含基因片段或整個(gè)基因。術(shù)語(yǔ)“基因”也包含結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)域，并且包含位于5’和3’端的編碼區(qū)域附近的序列，在任意端的長(zhǎng)度為約lkb，使得該基因相當(dāng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)域的5’并存在于mRNA上的序列被稱(chēng)作5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)域的3’或下游并存在于mRNA上的序列被稱(chēng)作3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“Ziso”和“Ziso基因”在本文中可互換使用，并且指的是編碼Ziso蛋白的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的某些典型的實(shí)施方式，Ziso基因包括在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或同源于其的序列中給出的核酸序列。如涉及多肽或蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“同一”或“同源”在本文中用來(lái)指具有任何插入、缺失和取代的多肽，其不影響如在本文中描述的多肽的生物活性。使用National Center ofBiotechnology Information (NCBI)的BlastP或TBlastN軟件，并使用默認(rèn)參數(shù)可以測(cè)定多肽與Ziso蛋白的同一性，可選地和優(yōu)選包括以下:過(guò)濾“打開(kāi)”(該選項(xiàng)使用Seg(蛋白質(zhì))程序從質(zhì)疑物(query)中過(guò)濾重復(fù)的或低復(fù)雜性的序列)，蛋白質(zhì)的記分矩陣是BL0SUM62，字號(hào)是3, E值是10,并且缺失代價(jià)(間隙成本，gap costs)是11,1 (初始化和擴(kuò)展)。當(dāng)涉及多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同一”或“同源”意指編碼具有如在本文中描述的Ziso生物活性的多肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸。根據(jù)某些實(shí)施方式，使用National Center ofBiotechnology Information (NCBI)的BlastN軟件,使用默認(rèn)參數(shù),其優(yōu)選包括使用DUST過(guò)濾程序，并且還優(yōu)選包括E值為10、過(guò)濾低復(fù)雜性序列以及字號(hào)為11，來(lái)測(cè)定核酸序列的同源性/同一性。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“分離的多核苷酸”在本文中可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)包含核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA或其雜交體的聚合物，其為單鏈的或雙鏈的、直鏈的或支鏈的，并且可選地包括合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。術(shù)語(yǔ)也包含RNA / DNA雜交體。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“其補(bǔ)體”在本文中是指多核苷酸的序列，其能夠與遍及整個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的另一特定多核苷酸形成Waston&Crick堿基對(duì)。該術(shù)語(yǔ)僅基于它們的序列應(yīng)用至多核苷酸對(duì)，而不是任何特定的條件集合，在所述條件下兩種多核苷酸將實(shí)際結(jié)合。如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”指的是人為組裝的或分離的核酸分子，其包括感興趣的多核苷酸。通常，構(gòu)建體可以包括感興趣的一個(gè)多核苷酸或多個(gè)多核苷酸、標(biāo)記基因，在某些情況下其也可以是感興趣的基因和適當(dāng)?shù)恼{(diào)控基因。應(yīng)當(dāng)理解在構(gòu)建體中含入調(diào)節(jié)序列是可選的，例如，在要使用宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列的情況下可以不需要這樣的序列。術(shù)語(yǔ)構(gòu)建體包括載體，但是不應(yīng)當(dāng)視 為限制于此。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指的是功能性終產(chǎn)物，例如mRNA或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，當(dāng)引用生物體(例如“轉(zhuǎn)基因生物體”)使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指的是在一種或多種其細(xì)胞中包含至少一種異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的生物體。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因材料”寬泛地指的是植物、藻類(lèi)、藻青菌或其一部分，包括在至少一個(gè)細(xì)胞中包含至少一種異源性多核苷酸的細(xì)胞或組織。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括源于所述細(xì)胞的一次轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和培養(yǎng)物，不考慮轉(zhuǎn)化的數(shù)量。所有后代的DNA含量可以不精確地相同；然而，與原始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有相同功能性的所有后代包括在轉(zhuǎn)化體的定義中。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”或“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的”指的是在不存在外源多核苷酸整合到宿主細(xì)胞的基因組中的情況下，向細(xì)胞中引入一種或多種外源多核苷酸。相反，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”指的是向細(xì)胞的基因組中引入和整合一種或多種外源多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體”指的是向基因組DNA或器官DNA中穩(wěn)定地整合一種或多種外源多核苷酸的細(xì)胞。應(yīng)理解，用本發(fā)明的核酸、構(gòu)建體和/或載體轉(zhuǎn)化的生物體或其細(xì)胞可以是瞬時(shí)以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。用于進(jìn)行本發(fā)明的優(yōu)選模式在研究類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的過(guò)程中，特別是將八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成反式番茄紅素的脫飽和及異構(gòu)化步驟中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)使用了同基因番茄“變異庫(kù)”，該變異庫(kù)是在由本發(fā)明的發(fā)明人之一和合作者處理番茄的先天變異體M82的基因背景下產(chǎn)生的(Menda，N.et al.2004.Plant J.38:861-872)。為了產(chǎn)生庫(kù)，在場(chǎng)條件下使源于甲基磺酸乙酯(EMS)化學(xué)處理和快 中子誘變的種子的總共13，000個(gè)M2家族顯型?；诒硇停瑢⒓易宸殖砂?5個(gè)主類(lèi)和48個(gè)子類(lèi)的形態(tài)種類(lèi)。已鑒別了多于3000種突變，其中一些表示之前描述的來(lái)自 The Tomato Genetics Resource CenterCTGRC:http://tgrc.ucdavis.edu)的單基因突變體集合的表型的新等位基因。許多突變落入多個(gè)單獨(dú)的種類(lèi)，因此對(duì)植物生長(zhǎng)具有多效性的效果。在Solanaceae Genome Network(SGN)中和在名為“The Genes ThatMakeTomatoes” (http: //zamir.sgn.Cornell, edu/mutants/)的地址上可搜索和訪(fǎng)問(wèn)突變體。已鑒別了具有改變顏色的果實(shí)或花的許多突變體(參見(jiàn)，例如，Galpaz，N.et al.2008.Plant J.53:717-730)。番茄突變體ζ篩選上述庫(kù)的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變的植物，該植物具有改變顏色的果實(shí)或花，揭示了至今番茄中還沒(méi)有表征的隱性突變(番茄cvM82)，命名為ζ。攜帶ζ的植物的果實(shí)是橙黃色的，而不是典型的紅色。本發(fā)明現(xiàn)在披露了，代替紅色的色素番茄紅素，ζ (ZETA)的果實(shí)積累八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和9，15，9’-三-順-ζ-胡蘿卜素。在攜帶ζ突變的植物的黃化的子葉和花中，也積累八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和9，15，9’-三-順-ζ-胡蘿卜素。子葉和其他生長(zhǎng)中的葉片暴露于光使表型轉(zhuǎn)變?yōu)檎！＆?(ZETA)的新葉是淡綠的，而隨著它們的生長(zhǎng)變成綠色。不希望受到任何特定的理論或作用機(jī)制的約束，在修復(fù)葉綠體中的損傷時(shí)可以涉及光合活性。八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和9，15，9’ -三-順-ζ -胡蘿卜素的積累，表明在攜帶ZETA的生物體中，在類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中，胡蘿卜素向下游類(lèi)胡蘿卜素的代謝損害了類(lèi)胡蘿卜素的生物合成。本發(fā)明現(xiàn)在表明ZETA與ZDS或CRTISO不是等位的。因此，該突變顯示了新的功能(酶)，該功能對(duì)植物和其他產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體中胡蘿卜素的代謝是必要的。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)該突變涉及ξ胡蘿卜素的異構(gòu)化，所以該基因指定為Ziso0將番茄栽培品種Μ82的突變?chǔ)七z傳繪制至與基因滲入株IL12-4中的潘那利番茄染色體區(qū)段重疊的染色體12。通過(guò)篩選約3000株ZETA和IL12-4之間的雜交F2植株進(jìn)行良好的基因繪圖。結(jié)果表明基因座ZETA的繪圖非常接近(〈0.8cm)遺傳標(biāo)記Atlg48300(圖 2)。因此，根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基因改變的產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體，該生物體與相應(yīng)未改變的生物體相比包括至少一個(gè)具有降低的Ziso表達(dá)或活性的細(xì)胞,其中與相應(yīng)未改變的生物體相比，該基因改變的生物體具有提高含量的至少一種類(lèi)胡蘿卜素，所述類(lèi)胡蘿卜素選自由八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素和其組合組成的組。根據(jù)某些實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物體包含提高含量的八氫番茄紅素。根據(jù)另外的實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物體包含提高含量的六氫番爺紅素。根據(jù)還進(jìn)一步的實(shí)施方式，與相應(yīng)未改變的生物體相比，基因改變的生物體包含提高含量的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的組合。根據(jù)某些實(shí)施方式，具有降低的Ziso表達(dá)或活性的細(xì)胞是包含色質(zhì)體的細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，在基因改變的生物體中，提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和
胡蘿卜素中的至少一種類(lèi)胡蘿卜素存在于肉質(zhì)果實(shí)組織中。根據(jù)某些實(shí)施方式，產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體選自由植物、藻類(lèi)和藻青菌組成的組。根據(jù)典型的實(shí)施方式，生物體是植物。根據(jù)某些實(shí)施方式，如在下文中例證的，天然未改變的Ziso基因包含至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO: 2中給出的核酸序列的核酸序列。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因包含在SEQ ID Ν0:2中給出的核酸序列。每一種可能性都表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)某些實(shí)施方式，如在下文中例證的，生物體的天然未改變的Ziso蛋白包含至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO: 3中給出氨基酸序列的氨基酸序列。根據(jù)典型的實(shí)施方式，未改變的Ziso蛋白包含在SEQ IDNO:3中給出的氨基酸序列。每一種可能性都表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。如技術(shù)人員已知的用于下調(diào)Ziso表達(dá)和/或活性的任何方法可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的基因改變的生物體。根據(jù)某些實(shí)施方式，可以在基因和/或轉(zhuǎn)錄水平上影響Ziso表達(dá)的抑制。根據(jù)其他實(shí)施方式，使用例如，拮抗物、裂解多肽的酶等可以在蛋白質(zhì)水平上抑制表達(dá)。根據(jù)某些實(shí)施方式，基因改變的生物體包含突變的Ziso基因。誘奪使用例如，定點(diǎn)突變，可以向Ziso基因中引入突變體(參見(jiàn)，例如Zhengm L.etal.2004 Nucleic Acid Res.10:32 (14): ell5)。這種誘變可以用于引入特定的、期望的氨基酸插入、缺失或取代?？梢圆捎檬褂弥T如甲基磺酸乙酯(EMS)的試劑的化學(xué)誘變，以獲得大量點(diǎn)突變，并篩選Ziso基因可以變得沉默或下調(diào)的突變體。在植物中，可以使用從天然或突變?nèi)后w傳遞基因的基因滲入的方法。重復(fù)雜交培養(yǎng)的和野生物種，使得分離包含野生的給定區(qū)段或突變?nèi)旧w的植物。特定的植物種，例如玉蜀黍(玉米)或金魚(yú)草具有天然的轉(zhuǎn)座子(轉(zhuǎn)位子)。這些轉(zhuǎn)座子是自主性的(即轉(zhuǎn)座酶(易位酶，transposas)位于轉(zhuǎn)座子序列內(nèi))或非自主性的，沒(méi)有轉(zhuǎn)座酶(transposas )。技術(shù)人員可以弓I起轉(zhuǎn)座子“跳躍”并且產(chǎn)生突變。可替換地，可以合成在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的位置具有隨機(jī)核苷酸的核酸序列，以產(chǎn)生隨機(jī)的氨基酸替換。根據(jù)一些實(shí)施方式，突變基因編碼非功能性Ziso蛋白。根據(jù)特定典型的實(shí)施方式，突變基因包含在SEQ ID N0:4中給出的核酸序列(指定為ζ 0089 (ΖΕΤΑ°°89))，該核酸序列編碼具有SEQ ID Ν0:5的非功能性Ziso蛋白。根據(jù)另外典型的實(shí)施方式，突變基因包含在SEQ ID Ν0:6中給出的核酸序列(指定為ζ 2803 (ZETA28tl3))，該核酸序列編碼具有SEQ IDNO:7的非功能性Ziso蛋白。根據(jù)另外的實(shí)施方式，基因改變的生物體是轉(zhuǎn)基因生物體，該轉(zhuǎn)基因生物體包括至少一個(gè)含有Ziso沉默分子的細(xì)胞，該沉默分子選自由RNA干擾分子、反義分子和編碼核酶的分子組成的組。RNA 干擾(RNAi )分子RNAi指的是引入同源的雙鏈RNA (dsRNA),以靶向特定的基因產(chǎn)物，導(dǎo)致所述基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。首先由Guo和Kemphues (1995.Cell, 81 (4):611_620)報(bào)道了在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中的該現(xiàn)象，隨后Fire等人(1998.Nature 391:806-811)發(fā)現(xiàn)了 dsRNA的存在致使產(chǎn)生了干擾活性，這些dsRNA是由存在于體外RNA制劑中的正義和反義鏈的退火形成的。本發(fā)明預(yù)期了 RNA干擾(RNAi)下調(diào)Ziso的表達(dá)以提高產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體中八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和胡蘿卜素的水平的應(yīng)用。在植物和動(dòng)物中，RNAi是由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)、破壞同源于沉默觸發(fā)物(trigger )的信使RNA的序列特異性多組分核酸酶介導(dǎo)的。已知RISC包括源于雙鏈RNA觸發(fā)物的短RNA (約22個(gè)核苷酸)。短的核苷酸RNA序列同源于被抑制的靶基因。因此，短的核苷酸序列似乎充當(dāng)指導(dǎo)序列以指示多組分的核酸酶RISC破壞特異性mRNA。`用于引發(fā)RNAi的dsRNA可以從天然來(lái)源分離或通過(guò)已知的手段產(chǎn)生，例如從DNA轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在用于產(chǎn)生針對(duì)靶序列的RNAi分子的質(zhì)粒和載體是容易獲得的?？梢詮妮d體以?xún)蓷l獨(dú)立的鏈來(lái)轉(zhuǎn)錄dsRNA。在其他實(shí)施方式中，用于形成dsRNA的DNA的兩條鏈可以屬于相同的或兩個(gè)不同的二倍體，其中，它們各自由至少部分互補(bǔ)序列的DNA鏈形成。當(dāng)因而產(chǎn)生dsRNA時(shí)，用兩個(gè)啟動(dòng)子與要轉(zhuǎn)錄的DNA序列側(cè)連，一個(gè)控制一條鏈的轉(zhuǎn)錄，而另一個(gè)控制互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)啟動(dòng)子可以是相同的或不同的。可替換地，單個(gè)啟動(dòng)子可以得到單鏈發(fā)夾多核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，其具有自我互補(bǔ)的正義和反義區(qū)(其退火以產(chǎn)生dsRNA)。抑制是序列特異性的，因?yàn)閷?duì)應(yīng)于RNA的二倍體區(qū)的核苷酸序列是靶向基因抑制的。優(yōu)選包含與靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子是用于抑制的。發(fā)現(xiàn)了相對(duì)于靶序列具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列對(duì)抑制也是有效的。因此，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的序列比較和排列算法來(lái)優(yōu)化序列的同一'I"生(參見(jiàn)，例如Gribskov andDevereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991,和其中引用的文獻(xiàn))，并通過(guò)例如，如在BESTFIT軟件程序中使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行的Smith-Waterman算法計(jì)算核苷酸序列之間的百分差(例如 University of Wisconsin GeneticComputing Group)。優(yōu)選抑制性RNA和祀基因的一部分之間具有大于90%的序列同一性,甚至100%的序列同一性。可替換地，RNA的二倍體區(qū)可以從功能上定義為能夠與靶基因轉(zhuǎn)錄的一部分雜交的核苷酸序列。相同的核苷酸序列的長(zhǎng)度可以是至少20、25、50、100、200、300或400個(gè)堿基?？梢允褂玫膁sRNA的長(zhǎng)度沒(méi)有上限。例如，相對(duì)于基因的全長(zhǎng)，dsRNA可以在基因的約21個(gè)堿基對(duì)(bp)以上的范圍內(nèi)。根據(jù)雙鏈RNA分子，包括具有至少90%的序列同一于Ziso基因的一部分的第一多核苷酸，以及具有與第一核酸互補(bǔ)的核酸序列的第二多核苷酸。根據(jù)某些實(shí)施方式，Ziso基因是包含在SEQ ID N0:2中給出的多核苷酸序列的番茄基因。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因是番茄基因的同源體。反義分子反義技術(shù)是一種其中反義RNA或DNA分子與靶正義DNA或RNA鏈相互作用的過(guò)程。正義鏈?zhǔn)?’至3’mRNA分子或DNA分子。正義的互補(bǔ)鏈或鏡像鏈稱(chēng)為反義。當(dāng)反義鏈與正義mRNA鏈相互作用時(shí)，認(rèn)為雙螺旋是細(xì)胞的外源物并且將被降解，導(dǎo)致降低的或沒(méi)有蛋白質(zhì)產(chǎn)生。雖然DNA已經(jīng)是雙鏈分子，但是可以對(duì)其應(yīng)用反義技術(shù)，建立三倍體形成。RNA反義鏈可以是催化的或者非催化的。也稱(chēng)為核酶的催化反義鏈在特定的序列處裂解RNA分子。非催化的RNA反義鏈阻止進(jìn)一步的RNA處理。通過(guò)用至少一種反義化合物轉(zhuǎn)化生物體的細(xì)胞或組織可以影響細(xì)胞和組織中Ziso水平的反義調(diào)節(jié)，所述反義化合物包括反義DNA、反義RNA、核酶、DNA酶、鎖核酸(LNA)和適體。在一些實(shí)施方式中，分子是化學(xué)改變的。在其他實(shí)施方式中，反義分子是反義DNA或反義DNA類(lèi)似物。根據(jù)某些實(shí)施方式，Ziso基因是包含在SEQ ID N0:1和SEQ IDN0:2中的任一個(gè)中給出的多核苷酸序列的番茄基因。根據(jù)其他實(shí)施方式，Ziso基因是番茄基因的同源體。DNA酶分子

另一種能夠下調(diào)Ziso表達(dá)的試劑是DNA酶分子，其特別是能夠裂解mRNA轉(zhuǎn)錄物或Ziso的DNA序列。DNA酶是單鏈多核苷酸，其能夠裂解單鏈和雙鏈靶序列。已經(jīng)提出了DNA酶的一般模型(“ 10-23”模型)?！?0-23” DNA酶具有15個(gè)脫氧核苷酸的催化域，各自用7至9個(gè)脫氧核苷酸的底物識(shí)別域與其兩側(cè)相連。這種DNA酶可以有效地在嘌呤:嘧啶連接點(diǎn)裂解其底物RNA (對(duì)于DNA酶的綜述，參見(jiàn):Khachigian，L.M.2002.Curr Opin MolTher 4:119-121)。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，326，174中披露了構(gòu)建和擴(kuò)增識(shí)別單鏈和雙鏈靶裂解部位的合成的、設(shè)計(jì)的DNA酶的實(shí)例。酶促.寡核苷酸(Enzymatic oligonucleotide)術(shù)語(yǔ)“酶促核酸分子”或“酶促寡核苷酸”指的是在底物結(jié)合區(qū)與特定的基因靶中具有互補(bǔ)性，并且也具有酶活性的核酸分子，特別地，其對(duì)裂解靶Ziso RNA是活性的，從而沉默Ziso?；パa(bǔ)區(qū)使得酶促核酸分子與靶RNA充分雜交，隨后裂解。術(shù)語(yǔ)酶促核酸與例如以下互換使用:核酶(ribozymes)、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、適配酶或結(jié)合適體的核酶、催化寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、DNA酶和RNA酶。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo),可以使用如在本領(lǐng)域中已知的任何酶促核酸分子，只要其具有特異性的底物結(jié)合部位，該部位與一個(gè)或多個(gè)靶核酸區(qū)互補(bǔ)，并且其在該底物結(jié)合部位內(nèi)或在其周?chē)哂泻塑账嵝蛄?，其?duì)分子施加核酸裂解和/或結(jié)合活性。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，987，071披露了這種分子的實(shí)例。
轉(zhuǎn)某閔牛物體通過(guò)如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法可以進(jìn)行編碼Ziso沉默分子的多核苷酸的克隆。各種DNA構(gòu)建體可以用于在期望的生物體中表達(dá)靶向Ziso的沉默分子。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含所有用于表達(dá)沉默分子的必要元件的表達(dá)載體。根據(jù)某些實(shí)施方式，沉默分子的表達(dá)是通過(guò)構(gòu)成型啟動(dòng)子控制的。根據(jù)目前典型的實(shí)施方式，生物體是植物，并且構(gòu)成型啟動(dòng)子是組織特異性的。根據(jù)這些實(shí)施方式，特異性啟動(dòng)子選自由根特異性啟動(dòng)子和果實(shí)特異性啟動(dòng)子組成的組。描述了根特異性啟動(dòng)子，例如在 Martinez, E.et al.2003.Curr.Biol.13:1435-1441 中。尤其是在 EstornellL.H et al.2009.Plant Biotechnol.J.7:298-309 和 Fernandez A.1.Et al.2009 PlantPhysiol.151:1729-1740中描述了果實(shí)特異性啟動(dòng)子。根據(jù)某些實(shí)施方式，表達(dá)載體進(jìn)一步在3’非編碼序列包含調(diào)節(jié)元件。如在本文中使用的，“3’非編碼序列”指的是位于編碼序列下游的DNA序列，并且包含多聚腺苷酸化識(shí)別序列和編碼能夠影響mRNA處理或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其他序列。通常多聚腺苷酸化信號(hào)的特征為影響多腺苷酸添加至mRNA前體的3’端。Ingelbrecht I L等人(1989.PlantCelll:671-680)說(shuō)明了不同的3’非編碼序列的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在本發(fā)明中描述的核酸序列和轉(zhuǎn)化載體的各種組分是效力上相關(guān)的，從而導(dǎo)致所述核酸或核酸片段的表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知用于使本發(fā)明的構(gòu)建體和載體的組分有效相關(guān)的技術(shù)。這種技術(shù)包括使用連接子，如合成的連接子，例如，包含一個(gè)或多個(gè)限制酶部位的連接子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體的方法，這些生物體選自由植物、藻類(lèi)和藻青菌組成 的組。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)變”描述了以下過(guò)程，通過(guò)其包括表達(dá)載體的外源DNA，如DNA構(gòu)建體，進(jìn)入受體細(xì)胞并將受體細(xì)胞變?yōu)檗D(zhuǎn)化的、遺傳改變的或轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的(其中核酸序列被整合到生物體基因組中，并且這代表穩(wěn)定的和遺傳的特征)或瞬時(shí)的(其中通過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)核酸序列，但是不整合到基因組中，并且這代表瞬時(shí)特征)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的核酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到生物體細(xì)胞中。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了在生物體的至少一個(gè)細(xì)胞中提高八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素或其組合中的至少一種的含量的方法，包括在至少一個(gè)細(xì)胞中抑制Ziso表達(dá)，從而與具有未抑制的Ziso表達(dá)的相應(yīng)細(xì)胞相比，產(chǎn)生在所述至少一個(gè)細(xì)胞中具有提高量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、胡蘿卜素或其組合的生物體。根據(jù)某些實(shí)施方式，抑制Ziso表達(dá)包括在編碼Ziso的基因中引入突變，其中突變導(dǎo)致Ziso基因降低的表達(dá)或?qū)е路枪δ苄訸iso蛋白的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以使用如在本文中披露的以及如在本領(lǐng)域已知的用于在Ziso基因中引入突變的任何方法。根據(jù)一些實(shí)施方式，抑制Ziso表達(dá)包括，用指定為沉默Ziso基因表達(dá)的分子轉(zhuǎn)化生物體的至少一個(gè)細(xì)胞，該基因具有在SEQ ID NO: USEQID NO: 2或其同源體的任一個(gè)中給出的核酸序列。根據(jù)某些實(shí)施方式，沉默分子選自由反義分子、RNAi分子、編碼多核苷酸的核酶等組成的組。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，基于Ziso基因或蛋白的表達(dá)，典型地首先選擇具有提高含量的期望的一種或多種類(lèi)胡蘿卜素的基因改變的生物體。然后分析Ziso表達(dá)異常的生物體的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、或其組合的含量。采用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的分子遺傳的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)突變的Ziso和/或Ziso沉默分子的存在和/或非功能性Ziso蛋白的存在。為了測(cè)定Ziso基因或沉默分子的表達(dá)，應(yīng)當(dāng)從表達(dá)核酸的器官中獲得cDNA或mRNA。在檢測(cè)步驟之前可以進(jìn)一步處理樣品。例如，細(xì)胞或組織樣品中的多核苷酸可以與樣品的其他組分分離，可以使其擴(kuò)增等。認(rèn)為從生物體獲得的所有樣品，包括經(jīng)受任何種類(lèi)的進(jìn)一步處理的那些，都是從生物體獲得的。典型地，Ziso基因或沉默分子的檢測(cè)需要擴(kuò)增取自待改變的生物體的多核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知用于DNA擴(kuò)增的方法。最常用的用于DNA擴(kuò)增的方法是PCR (聚合酶鏈反應(yīng)；參見(jiàn)，例如，PCR Basics:frombackground to Bench, Springer Verlag, 2000 ；Eckert et al., 1991.PCRMethods and Applications 1:17)。另外的適宜的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和自持式序列復(fù)制以及基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)。根據(jù)某些實(shí)施方式，包含Ziso沉默分子的核酸序列進(jìn)一步包含編碼選擇性標(biāo)記的核酸序列。根據(jù)某些實(shí)施方式，選擇性標(biāo)記對(duì)抗菌素，或在植物和藻類(lèi)的情況下，對(duì)除草劑賦予耐性；在這些實(shí)施方式中，根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物體對(duì)抗菌素或除草劑的耐性來(lái)選擇它們。通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素以及八氫番茄紅素、六氫番茄紅素和胡蘿卜素中的每一種的總含量(參見(jiàn)，例如，Schiedt K andLiaaen-JensenS.1995.Carotenoids:1solation and analysis.1n CarotenoidsVolume 1A:1solationand Analysis, G.Britton, S.Liaaen-Jensen, and H.Pfander, Eds (Basel:Birkhauser), pp.81-108)。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的基因改變的生物體具有的八氫番茄紅素的含量為基因改變的細(xì)胞的總類(lèi) 胡蘿卜素含量的至少25%(w / W)。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，八氫番茄紅素含量為基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素(w / w)的總量的至少30%，更典型地至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)其他實(shí)施方式，本發(fā)明的基因改變的生物體具有的六氫番茄紅素的含量為總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15%(w / W)。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，六氫番茄紅素的含量為基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素(w / w)的總量的至少20%，更典型地至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。根據(jù)還另外的實(shí)施方式，本發(fā)明的基因改變的生物體具有總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少30% (w / w)的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的組合水平。根據(jù)某些典型的實(shí)施方式，八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的組合水平為基因改變的細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素/ )的總量的至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。每一種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方式。提供了以下實(shí)施例，以便更充分地說(shuō)明本發(fā)明的一些實(shí)施方式。然而，決不應(yīng)當(dāng)將它們視為限制本發(fā)明的廣泛范圍。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地作出本文中披露的原則的許多改變和變型。實(shí)施例材料和方法核酸的分離和分析
來(lái)自棺物的DNA提取如描述的(BernatzkyR.and Tanksley S.1986.Plant Mo 1.Biol.Rep0rter4:37-41)，從葉子中提取基因組DNA。為了對(duì)ζ等位基因測(cè)序，根據(jù)制造商推薦的方案(Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Ohio, USA),通過(guò)DNAzol : ES 試劑從0.1-0.2g的葉子組織中制備基因組DNA。來(lái)自棺物的RNA提取和cDNA的牛產(chǎn)根據(jù)制造商推薦的方案，通過(guò)使用TR1-REAGENT從0.1g的葉子組織或1.0g的果實(shí)組織中提取總 RNA (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Ohio, USA ;購(gòu)自Sigma)。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，通過(guò)使用寡聚-dT作為引物以及SUPERSCRIPT II RNase-反轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)或ImPr om-1I 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(Promega)進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。突奪分析對(duì)于cDNA模板，使用Taq聚合酶DynaZyme II DNA聚合酶(重組體，F(xiàn)innZymes0y, Espo, Finland)。對(duì)于基因組DNA,也使用 Taq聚合酶.HotStarlaq (QIAGEN Group)。根據(jù)制造商推薦的方案使用。使用下列引物對(duì)以對(duì)每一個(gè)ζ等位基因擴(kuò)增Ziso的cDNA序列:I) 5，-ACTTAGAGCTCACATAACCTTGTA-3’(Zl-正向，SEQ ID NO:9)2) 5’ -TGTATGGAAACGAGTTATGTAACA-3’(Zl-反向，SEQ ID NO: 10)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并解決與野生型序列的差異。DNA序列分析用ABI Prism 377 DNA測(cè)序儀(Perkin Elmer)測(cè)定DNA序列并用ABI序列分析軟件處理。載體NTI Suit軟件(InforMax, North Bethesda, MDUSA)用于序列分析。類(lèi)胡蘿卜素分析為了使類(lèi)胡蘿卜素的降解和異構(gòu)化最小化，所有操作都在非常暗的光下進(jìn)行，當(dāng)可能時(shí)，將類(lèi)胡蘿卜素樣品保存在厭氧條件下、在冰上或在-20° C下。來(lái)自果實(shí)的類(lèi)胡蘿卜素提取從0.2-0.6g的新鮮組織中提取果實(shí)色素。在Iml的丙酮中研磨組織，并收集和過(guò)濾溶劑。在Iml的二氯甲烷中再次研磨剩余的組織碎片，過(guò)濾溶劑并與丙酮濾液匯合。重復(fù)研磨和收集溶劑，直至組織失去其所有顏色。通過(guò)針對(duì)等體積的二乙醚和0.2體積的12%w / V的NaCl / H2O分開(kāi)溶劑混合物而提取色素。收集帶有顏色的醚部分(上面的相)，在N2流下使其干燥，并且將經(jīng)干燥的脂質(zhì)提取物再次溶解在70 μ I的丙酮中，用于進(jìn)一步分析。來(lái)自花的類(lèi)胡蘿卜素提取從新鮮的單種花的花瓣或花藥中提取花色素。在Iml丙酮中研磨組織，并收集和過(guò)濾丙酮。重復(fù)該過(guò)程，直至從組織中提取了所有色素。在N2流下干燥丙酮，并且將經(jīng)干燥的部分溶解在450 μ I的乙醇中。加入50 μ I的60%K0H (w / v),并且在4° C下孵育樣品16小時(shí)用于皂化。通過(guò)針對(duì)等體積的二乙醚和0.2體積的12%w / V的NaCl / H2O分開(kāi)混合物而提取類(lèi)胡蘿卜素。收集上面的相(醚)，在N2流下使其干燥，并且將經(jīng)干燥的類(lèi)胡蘿卜素溶解在丙酮中，用于進(jìn)一步分析。來(lái)自子葉的類(lèi)胡蘿卜素提取
從黑暗或光照生長(zhǎng)的秧苗的30_100mg新鮮子葉(來(lái)自5_12棵秧苗)中提取葉子色素。在丙酮中切碎新鮮組織并過(guò)濾。在氮流下干燥溶劑，并溶解在70μ I的丙酮中，用于通過(guò)HPLC進(jìn)一步分析。高效液相色譜(HPLC)分析使用由Waters 600栗、Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器和Waters 717plus自動(dòng)取樣器(Waters, Milford, MA)組成的Waters系統(tǒng)，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)來(lái)分離類(lèi)胡蘿卜素。使用兩個(gè)0DS2 C18反相柱:一個(gè)來(lái)自Phenomenex (娃土 5 μ m, 3.2_X 250mm)(Phenomenex , Torrance, CA USA),且一個(gè)來(lái)自 Waters (5 μ m,4.6X 250mm)(Waters, Milford, MA)0 兩個(gè)柱都連接至保護(hù)外殼系統(tǒng) SecurityGuard (Phenomenex ，Torrance, CA USA)。在用于制備用途的HPLC系統(tǒng)I中，以1.6ml/min的恒定流速使用乙腈作為洗脫液(使用Waters柱)。用于分析目的的HPLC系統(tǒng)2是基于溶劑的梯度。使用乙腈:水(9:1 ;A)和乙酸乙酯(B),對(duì)于Phenomenex柱或Waters柱分別以lml/min或1.6ml/min的恒定流速。梯度是:100%至80%的A持續(xù)8分鐘；80%至65%的A持續(xù)4分鐘，之后65%至45%的A持續(xù)14分鐘，并且最后一段為100%的B。記錄HPLC洗脫溶劑在250-600nm的波長(zhǎng)范圍下的光譜并檢測(cè)吸收峰。通過(guò)它們的吸收譜和保留時(shí)間，并且在某些情況下，通過(guò)與可信的參照物質(zhì)相比來(lái)確定胡蘿卜素。從攜帶質(zhì)粒pACCRT-EIB (Cunningham, F.X.Jr.et al.1993.FEBS Lett.328:130-138)、pBCAR (Lotan, T.and Hirschberg, J.1995.FEBS Lett.364:125-128)以及 pAC-NEUR (Cunningham F.X.Jr.et al.1994.Plant Cell6:1107-1121)的大腸桿菌細(xì)胞中，通過(guò)類(lèi)胡蘿卜素提取來(lái)獲得標(biāo)準(zhǔn)的全反式番茄紅素、全反式胡蘿卜素和全反式鏈孢紅素。從CaroteNature GmbH購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)的反式ζ -胡蘿卜素(Lupsingen, Switzerland)。使用Millennium層析軟件(Waters),通過(guò)積分峰面積進(jìn)行定量。類(lèi)胡蘿卜素定暈利用光譜法來(lái)測(cè)定總類(lèi)胡蘿卜素含量。對(duì)于綠色組織，根據(jù)(LiChtenthaler，H.K.1987.Methods Enzymol.148:350-382)進(jìn)行定量。將色素提取物在丙酮中稀釋10倍，并且在661.6nm、644.8nm和470nm下測(cè)定樣品的吸光度。葉綠素和總類(lèi)胡蘿卜素的含量如下計(jì)算:Chla ( μ g / ml 丙酮)=11.24 X A661.6_2.04 XA6448Chlb ( μ g / ml 丙酮)=20.13 X A644.8_4.19 X A661.6類(lèi)胡蘿卜素(μg/ml 丙酮)=(1000XA470-L 9XChla-63.14XChlb) /214其中Ax表示在給定的(X)波長(zhǎng)下，Iml的樣品在Icm路徑長(zhǎng)度的小皿中的吸光度。對(duì)于帶有顏色的組織，按照Schiedt和Liaaen-Jensen對(duì)類(lèi)胡蘿卜素定量(Schiedt K.and Liaaen-Jensen S.1995.Carotenoids:1solation and analysis.1nCarotenoids Volume 1A:1solation and Analysis, G.Britton, S.Liaaen-Jensen, and H.Pfander, Eds (Basel:Birkhauser), pp.81-108.X
類(lèi)胡蘿卜素(mg/ml) = (J X1000) /(A= X100)。
其中，A表示在特定的波長(zhǎng)(對(duì)于葉黃素或反式番茄紅素為470nm，而對(duì)于番茄紅素原為440nm)下，Iml的樣品在Icm路徑長(zhǎng)度的小皿中的吸光度，并且是特定的吸光系數(shù)(對(duì)于葉黃素、反式番茄紅素或番茄紅素原分別為2400、3400或1920)，其定義為在Icm路徑長(zhǎng)度的小皿中1%濃度的溶液的理論吸光度。根據(jù)ζ_胡蘿卜素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素與在組織中的葉黃素、反式番茄紅素或番茄紅素原的相對(duì)比例，計(jì)算它們的含量。實(shí)施例1: ζ突奪的表征將番茄栽培品種Μ82中的突變?chǔ)七z傳繪制至與基因滲入株IL12-4中的潘那利番茄染色體區(qū)段重疊的染色體12。通過(guò)篩選約3000株ζ和IL12-4之間的雜交F2植株進(jìn)行良好的基因繪圖。結(jié)果表明基因座4的繪圖非常接近(<0.8(^)遺傳標(biāo)記4^848300 (圖2)?；谂c擬南芥基因AtlG10830的同源性，克隆名為Ziso的編碼ζ的基因，該擬南芥基因 AtlG10830 已經(jīng)由 Elli Wurtzel 博士(CUNY, LehmanCollege, personalcommunication)鑒定。在ζ (ZETA) χ醋栗番爺雜交的F2群中建立了 AtlG10830序列的番茄同源體和(突變的完全共分離。野生型番茄基因Ziso的DNA序列包含在SEQ ID NO:1中給出的核酸序列(圖3)，并且將其轉(zhuǎn)錄至具有在SEQ ID Ν0:2中給出的核酸序列的Ziso cDNA (圖4)。番茄中的基因Ziso編碼具有41.5kDa的經(jīng)計(jì)算的分子量的369個(gè)氨基酸的多肽。通過(guò)ChloroP程序預(yù)測(cè)了氨基末端用于質(zhì)體靶向的80個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。預(yù)測(cè)成熟的多肽的尺寸為32.4kDa并且包含5個(gè)跨膜螺旋。生物信息分析揭示了 Ziso發(fā)生在所有藍(lán)細(xì)菌、藻類(lèi)和植物中。雖然在細(xì)菌基因Nnru中存在相關(guān)基序，但是其功能已注釋為“未知”的。以下兩種ζ等位基因的序列分析揭示了每一個(gè)ζ等位基因攜帶獨(dú)特的非正義突變:z°°89，具有在SEQ ID Ν0:4中給出的核酸序列(圖5Α);ζ2°83，具有在SEQ ID Ν0:6中給出的核酸序列(圖5Β)。兩種等位基因的編碼蛋白是非功能性的，并且具有分別在SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:7中給出的氨基酸序列。在圖5C中給出了來(lái)自野生型、z2°83和z°_的ZISO多肽的氨基酸序列的排列。在下表I中給出了攜帶ζ突變(z2°83)的番茄植物的果實(shí)和花中的類(lèi)胡蘿卜素的組成與野生型(Μ82)番茄植物的類(lèi)胡蘿卜素的組成的比較。以每克鮮量yg給出了類(lèi)胡蘿
卜素的濃度。結(jié)果明確表明，與野生型植物相比，在攜帶ζ突變的番茄植株中顯著提高了八氫番爺紅素、六氫番爺紅素和ζ胡蘿卜素的含量。表1:野生型和ζ番茄植株的果實(shí)和花中的類(lèi)胡蘿卜素組成
權(quán)利要求
1.一種基因改變的產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的生物體，與相應(yīng)未改變的生物體相比，所述基因改變的生物體包含具有降低的Ziso蛋白的表達(dá)或活性的至少一種細(xì)胞，其中，與相應(yīng)未改變的生物體相比，所述基因改變的生物體具有提高含量的選自由八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿卜素和它們的組合組成的組中的至少一種類(lèi)胡蘿卜素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，其中，具有降低的Ziso蛋白的表達(dá)或活性的所述細(xì)胞是包含色質(zhì)體的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，其中，所述Ziso蛋白由具有以下核酸序列的多核苷酸編碼:所述核酸序列至少55%、60%、70%、75%、80%、85%或95%同源于在SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2的任一個(gè)中給出的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，其中，所述Ziso蛋白由具有在SEQIDNO:1和SEQ ID Ν0:2的任一個(gè)中給出的核酸序列的多核苷酸編碼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，其中，所述Ziso蛋白包含至少55%、60%、70%、75%、80%、85%或95%同源于在SEQ IDNO: 3中給出的氨基酸序列的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，其中，所述Ziso蛋白包括在SEQID NO:3中給出的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因改變的生物體，其中，編碼所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包含形成突變的Ziso多核苷酸的至少一個(gè)突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因改變的生物體，其中，所述至少一個(gè)突變導(dǎo)致所述Ziso蛋白降低的表達(dá)或非功能性Ziso蛋白的產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因改變的生物體，其中，所述突變的Ziso多核苷酸包含在SEQ ID Ν0:4和SEQ ID NO :6的任一個(gè)中給出的核酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因改變的生物體，其中，所述突變的Ziso多核苷酸編碼具有在SEQ ID Ν0:5和SEQ ID NO:7的任一個(gè)中給出的氨基酸序列的蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因改變的生物體，所述生物體是轉(zhuǎn)基因生物體，所述轉(zhuǎn)基因生物體包括含有能夠沉默編碼所述Ziso蛋白的所述多核苷酸的分子的至少一種細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基因改變的生物體，其中，包含能夠沉默編碼所述Ziso蛋白的所述多核苷酸的分子的所述細(xì)胞是包含色質(zhì)體的細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其中，所述沉默分子選自由RNA干擾分子、反義分子和編碼核酶的分子組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其中，所述沉默分子包含具有基本上互補(bǔ)于至少20個(gè)核苷酸的核酸序列的核酸序列的多核苷酸，所述至少20個(gè)核苷酸的核酸序列至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 同源于 SEQ ID NO: 2。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其中，所述沉默分子包含具有基本上互補(bǔ)于至少20個(gè)核苷酸的SEQ ID NO:2的核酸序列的多核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因生物體，其中，所述沉默分子是RNAi分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，所述生物體具有基因改變的細(xì)胞的總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少25% (w / w)的八氫番茄紅素含量。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，所述生物體具有基因改變的細(xì)胞的總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15% (w / w)的六氫番茄紅素含量。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體，所述生物體具有基因改變的細(xì)胞的總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少30% (w / w)的結(jié)合水平的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體,所述生物體選自由植物、藻類(lèi)和藻青菌組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的基因改變的生物體，所述生物體是植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因改變的生物體，所述生物體是番茄植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因改變的植物，在所述植物的至少一個(gè)器官中具有提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、(胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的基因改變的植物，其中，所述器官選自由根、塊莖、花和果實(shí)組成的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求 23所述的基因改變的植物，其中，所述果實(shí)是肉質(zhì)果實(shí)。
26.一種權(quán)利要求21所述的基因改變的植物的種子，其中，由所述種子生長(zhǎng)的植物與由相應(yīng)未改變的種子生長(zhǎng)的植物相比具有降低的Ziso表達(dá)，從而具有提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、 胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種。
27.一種從權(quán)利要求1所述的基因改變的生物體分離的細(xì)胞懸浮液或組織培養(yǎng)液，其中，所述細(xì)胞或組織培養(yǎng)液包含提高含量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種。
28.—種在生物體的至少一個(gè)細(xì)胞中提高八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種的含量的方法，包括在所述至少一個(gè)細(xì)胞中抑制Ziso蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生在所述至少一個(gè)細(xì)胞中具有提高量的八氫番爺紅素、六氫番爺紅素、ζ胡蘿卜素或它們的組合中的至少一種的生物體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，Ziso蛋白的表達(dá)在包含色質(zhì)體的細(xì)胞中被抑制。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，抑制所述Ziso蛋白的表達(dá)包括在編碼所述Ziso蛋白的多核苷酸中引入突變。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述突變導(dǎo)致編碼Ziso蛋白的多核苷酸的降低的表達(dá)或非功能性Ziso蛋白的產(chǎn)生。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，抑制所述Ziso蛋白的表達(dá)包括用指定為沉默編碼所述Ziso蛋白的多核苷酸的表達(dá)的分子轉(zhuǎn)化所述生物體的至少一個(gè)細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，編碼所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包含至少55%、60%、70%、75%、80%、85% 或 95% 同源于在 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 的任一個(gè)中給出的核酸序列的核酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，編碼所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包括在SEQID NOiUSEQ ID NO:2的任一個(gè)中給出的核酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述沉默分子選自由反義分子、RNAi分子和編碼核酶的多核苷酸組成的組。
36.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述生物體具有總類(lèi)胡蘿卜素的至少25%(w/w)的八氫番茄紅素含量，或總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少15% (w / w)的六氫番茄紅素含量，或總類(lèi)胡蘿卜素含量的至少30% (w / w)的結(jié)合水平的八氫番茄紅素和六氫番茄紅素。
37.一種編碼具有在SEQ ID NO: 5中給出的氨基酸序列的非功能性Ziso蛋白的分離的多核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的分離的多核苷酸，具有在SEQID NO: 4中給出的核酸序列。
39.一種編碼具有在SEQ ID NO: 7中給出的氨基酸序列的非功能性Ziso蛋白的分離的多核苷酸。
40.根據(jù) 權(quán)利要求38所述的分離的多核苷酸，具有在SEQID NO:6中給出的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于改變類(lèi)胡蘿卜素生物合成路徑中組分的表達(dá)以改變朝向八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿卜素或其組合中的至少一種的積累而產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的手段和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有提高含量的這些類(lèi)胡蘿卜素的基因改變的生物體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有提高含量的這些類(lèi)胡蘿卜素的基因改變的生物體，特別是在包含色質(zhì)體的細(xì)胞中。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103154250SQ201180023184
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者約瑟夫·希施貝里, 達(dá)尼·扎米爾 申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊森姆研究發(fā)展有限公司