一種sll0659基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種S110659基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用，特別涉及集胞 藻PCC6803中S110659基因在集胞藻PCC6803光合作用中合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng) 用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素（Carotenoids)是胡蘿卜素（Carotenes)和葉黃素（Xanthophylls) 兩大類色素的總稱，通常是碳?xì)浠衔锛捌涞难趸苌?，?個(gè)類異戊二烯單位組成， 是一類重要的天然色素，目前已發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素有700多種，常見的有a-胡蘿卜素 (a-Carotene)、0 -胡蘿卜素（0 -Carotene)、玉米黃素（Zeaxanthin)、葉黃素（Lutein)和 4下青素（Astaxanthin)等。
[0003] 類胡蘿卜素在自然界中分布廣泛，主要由植物、藻類、藍(lán)藻以及一些細(xì)菌、真菌等 微生物合成，動(dòng)物自身不能合成類胡蘿卜素，只能通過食物鏈獲取。在光合生物中，類胡蘿 卜素作為捕光色素成分參與光合作用和通過清除自由基的參與抗光氧化的保護(hù)作用，同時(shí) 在動(dòng)物和人類體內(nèi)也發(fā)揮著重要作用。例如類胡蘿卜素（尤其是(6-胡蘿卜素）是作為人 體內(nèi)維生素A的重要來源，類胡蘿卜素如番茄紅素、(6-胡蘿卜素、蝦青素及葉黃素等具有 很強(qiáng)的抗氧化活性，可以有效地抑制自由基的產(chǎn)生，阻斷體內(nèi)的鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)，阻止脂質(zhì) 過氧化，延緩衰老和老年動(dòng)脈粥樣硬化的形成。它同樣可以治療疾病并提高機(jī)體免疫力。同 時(shí)，類胡蘿卜素也具有較大的醫(yī)用價(jià)值，人類攝食類胡蘿卜素不僅可以預(yù)防眼病、心血管病 的發(fā)生，還可以增強(qiáng)生物機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能，增強(qiáng)腫瘤免疫。
[0004] 目前，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上，類胡蘿卜素主要作為醫(yī)藥原料、功能食品、膳食補(bǔ)充劑和 飼料色素，價(jià)格昂貴，市場(chǎng)需求量極大。功能性天然色素的類胡蘿卜紅素在醫(yī)藥、食品、化妝 品等方面都有著良好的應(yīng)用前景，它的開發(fā)應(yīng)用將給農(nóng)業(yè)、食品加工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等相關(guān)的 行業(yè)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的市場(chǎng)前景。類胡蘿卜素的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、 微生物發(fā)酵法和天然植物提取法三種。其中天然提取法正逐步成為類胡蘿卜素生產(chǎn)的主要 方法。從植物資源中提取主要是以果蔬為原料，存在成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)品得率偏低 等問題，目前此方法已不占主導(dǎo)地位。與植物相比，大多數(shù)的藻類能夠合成類胡蘿卜素，如 藍(lán)藻中的北冰洋聚球藻能合成玉米黃素、(6-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)等，紅球藻（Haematococcus pluvialis)在氮磷饑餓條件下，細(xì)胞中的蝦青素積累增大，綠藻中的杜氏藻（Dunaliella) 能大量積累(6-胡蘿卜素。同時(shí)由于微藻不與農(nóng)作物爭(zhēng)地、爭(zhēng)水；在環(huán)境脅迫如缺氮等條件 下，有些單細(xì)胞微藻可大量積累類胡蘿卜素，所以有很多利用微藻生產(chǎn)高附加值物質(zhì)的研 究。而隨著代謝工程技術(shù)的發(fā)展及日趨成熟，通過改造、阻斷及引入新的代謝途徑來提高 細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素的含量，可以在提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率同時(shí)減少副產(chǎn)物的生成。
[0005] 近年來，應(yīng)用類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因植物研究取得了較大進(jìn)展。類 胡蘿卜素生物合成的第一步是由八氫番茄紅素合酶（PSY)催化兩個(gè)櫳牛基櫳?；沽姿?(GGPP)分子合成八氫番茄紅素（phytoene)。PSY是類胡蘿卜素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵 調(diào)節(jié)酶，其編碼基因成為植物類胡蘿卜素遺傳工程中的首選目的基因。GGPP是許多途徑的 反應(yīng)前體，在番茄中過量表達(dá)PSYl基因時(shí)，GGPP大量轉(zhuǎn)向合成類胡蘿卜素，而赤霉素的合 成水平下降。在油菜種子中過量表達(dá)細(xì)菌的PSY基因發(fā)現(xiàn)成熟的種子中類胡蘿卜素含量增 加了 50倍。在水稻胚乳中共表達(dá)水仙的PSY基因、LCY基因和細(xì)菌的CRTI基因，結(jié)果轉(zhuǎn)基 因水稻種子胚乳中積累了大量P_胡蘿卜素及其氧化產(chǎn)物葉黃體素、玉米黃質(zhì)等，這種水 稻米粒金黃，被譽(yù)為"金色水稻"。利用果實(shí)特異性啟動(dòng)子在番茄中過量或反義表達(dá)Lcy-b 基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)中的(6-胡蘿卜素含量大量增加。過量表達(dá)番 茄紅素(6-環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)基因番茄，發(fā)現(xiàn)番茄紅素向(6-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化加強(qiáng)，而且總類 胡蘿卜素的含量也增加了 50%以上。在擬南芥中過量表達(dá)胡蘿卜素羥化酶（BCH)使葉黃素 的含量增加，其他類胡蘿卜素的含量并沒有明顯的降低。不過，通過基因工程技術(shù)提高植物 的類胡蘿卜素含量和種類，還面臨著許多問題，如前體GGPP的供應(yīng)與幾種物質(zhì)代謝調(diào)控的 平衡等。
[0006] 藍(lán)藻（cyanobacteria)又稱藍(lán)細(xì)菌，是一類能進(jìn)行光合作用的原核生物。藍(lán)藻細(xì) 胞可以利用簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物合成有機(jī)物，所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物不形成包含體，并且多數(shù)藍(lán) 藻及其提取物對(duì)人畜無(wú)毒，是轉(zhuǎn)基因研究的良好受體。集胞藻PCC6803(Synechocystissp. spPCC6803)做為一種單細(xì)胞藍(lán)藻，具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、不產(chǎn)生毒素、細(xì)胞結(jié)構(gòu) 簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、方便分子操作等特點(diǎn)，適合于利用廣核生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，是很 好的藍(lán)藻基因工程受體。鑒于藍(lán)藻表達(dá)的外源基因產(chǎn)物易純化、不含毒素、藻細(xì)胞培養(yǎng)成本 低且不容易污染等的優(yōu)點(diǎn)，隨著藻類基因工程的發(fā)展，使利用藍(lán)藻作為外源基因表達(dá)載體 以生產(chǎn)藥物等高附加值產(chǎn)品成為可能。
[0007] 集胞藻PCC6803中顯著積累四種類胡蘿卜素，S卩(6-胡蘿卜素（p-carotene)、玉 米黃素（Zeaxanthin)、海膽酮（Echinenone)和藍(lán)藻葉黃素（Myxoxanthophyll)。集胞藻 PCC6803中類胡蘿卜素生物合成途徑見圖1。目前，已經(jīng)從集胞藻PCC6803中克隆到十多 個(gè)與類胡蘿卜素合成有關(guān)的基因，分別為主要有編碼異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的ipi，編碼櫳 牛兒基焦磷酸合成酶的crtE，編碼八氫番茄紅素合成酶的crtB，編碼八氫番茄紅素脫氫酶 的crtP，編碼G-胡蘿卜素脫氫酶的crtQ，編碼P-胡蘿卜素酮醇酶的CrtO，編碼P-胡 蘿卜素羥化酶的crtR，編碼胡蘿卜素異構(gòu)酶的crtH，和編碼番茄紅素環(huán)化酶/雙加氧酶的 CrtLdl'它們分別參與了從異戊二烯焦磷酸（IPP)到海膽酮及玉米黃素的羥基化與酮基化 反應(yīng)。集胞藻PCC6803中類胡蘿卜素生物合成途徑如圖1所示。
[0008] 番茄紅素是類胡蘿卜素合成途徑中的重要分支點(diǎn)，在不同環(huán)化酶的作用下形成一 系列的胡蘿卜素。已從聚球藻7942中克隆了編碼番茄紅素環(huán)化酶的CrtL。近年來，在綠 硫細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一類新的雙功能番茄紅素環(huán)化酶基因CruA，在大腸桿菌中可以將番茄紅素 轉(zhuǎn)化為y_胡蘿卜素。而在聚球藻7002(Synechococcussp.PCC7002)中也發(fā)現(xiàn)了同源 基因CruA和CruP。集胞藻PCC6803中不含crtL-e，而尚未見有關(guān)crtL-b的報(bào)道。集胞 藻？0：6803中8110659基因（66油31^登錄號(hào)為1?_010873989.1)與聚球藻〇1^(661*&1^ 登錄號(hào)為WP_012305684. 1)氨基酸相似性為51. 12%，已有研究表明，S110659的突變對(duì) 番茄紅素環(huán)化過程影響不明顯，但尚沒有對(duì)集胞藻PCC6803中S110659基因在提高集胞藻 PCC6803a-胡蘿卜素合成及促進(jìn)光合方面的應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種S110659基因在合成集胞藻類胡蘿卜素 中的應(yīng)用。本發(fā)明通過在集胞藻PCC6803中利用基因敲除技術(shù)降低S110659基因的表達(dá) 后，發(fā)現(xiàn)增加了藍(lán)藻葉黃素和玉米黃素的百分含量，其中藍(lán)藻葉黃素含量增加了 22. 3%，玉 米黃素含量增加了 31. 3%，而海膽酮含量和0 -胡蘿卜素百分含量則分別降低了 34. 3%和 1.3%。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，與野生型集胞藻PCC6803相比，S110659基因敲除突變體中明 顯增加了a_胡蘿卜素的含量。同時(shí)，普通光（40ymolphotonsIii2S1)及強(qiáng)光（200ymol photonsIii2S1)處理?xiàng)l件下，與野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突變株P(guān)SI/ PSII比例明顯降低。
[0010] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0011] -種S110659基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用，所述S110659基因核苷酸 序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 上述應(yīng)用，步驟如下：
[0013] (1)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的集胞藻PCC6803S110659序列擴(kuò)增集胞藻 PCC6803S110659上游cDNA片段，制得上游片段，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示；
[0014] (2)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的集胞藻PCC6803S110659序列擴(kuò)增集胞藻 PCC6803S110659下游cDNA片段，制得下游片段，核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；
[0015] (3)將步驟⑴制得的上游片段連接入載體，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail雙酶 切，回收載體片段1，將步驟（2)制得的下游片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail雙酶切，制 得回收片段2,連接載體片段1和片段2,制得sll0659BamHI載體；
[0016] (4)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切pBluescript-Gm載體，回收慶大霉素抗性片段； 將步驟（3)制得的sll0659BamHI載體用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切后，與慶大霉素抗性片段 連接，制得集胞藻PCC6803S110659基因敲除的載體pKNsll0659-Gm;
[0017] (5)將步驟（4)制得的載體pKNsll0659-Gm轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803,經(jīng)篩選，制得轉(zhuǎn) 基因集胞藻，經(jīng)培養(yǎng)，即得。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，擴(kuò)增引物核苷酸序列如下：
[0019]S110659-1-F :5'-ATGAACTATGCAACTACACC-3' ；
[0020] sll0659-l-BamHI-R:5,-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3,；
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，擴(kuò)增體系如下：
[0022] 2XHifiPCRMix10yL，大腸桿菌基因組DNA模板IyL，正向引物S110659-1-F lyL，反向引物sll0659-l-BamHI-RlyL，ddH20 7yL，總反應(yīng)體系為 20yL。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，擴(kuò)增體系如下：
[0024] 94°(：預(yù)變性5!^11;94°(：變性3〇8,60°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸1111111，35個(gè)循環(huán)后 ； 72°C10min，4°C保存。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，擴(kuò)增引物核苷酸序列如下：
[0026]si10