專(zhuān)利名稱(chēng)：一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)方法，具體為一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
弗吉尼亞櫟(以/ercW1S屬殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)樹(shù)種， 原產(chǎn)美國(guó)，為常綠闊葉高大喬木。單葉，互生，老葉革質(zhì)，葉表面深綠色具光澤，背面綠色泛白，葉片顏色、形狀、大小、質(zhì)地等性狀隨發(fā)育階段、環(huán)境等影響具有很強(qiáng)的可塑性，新葉大而肉質(zhì)，顏色淡綠，葉緣齒大而少；老葉小而革質(zhì)，葉緣齒小而多。早春開(kāi)花，花黃色，成熟果實(shí)呈褐色，俗稱(chēng)橡樹(shù)果，為鳥(niǎo)類(lèi)和動(dòng)物提供豐富的食物來(lái)源，成熟以后即落下，種子活力較低。弗吉尼亞櫟喜排水良好的砂質(zhì)土壤，能夠耐鹽霧和較高的土壤鹽分，對(duì)土壤水分敏感， 可以忍受中等程度的干旱，粘土也可以生長(zhǎng)，可以耐受最低_13°C的低溫。弗吉尼亞櫟幼年生長(zhǎng)速度較快，幼苗在第一年可以生長(zhǎng)至4英尺(I. 2m)，隨著苗木的長(zhǎng)大，生長(zhǎng)速度會(huì)減少。在沒(méi)有限制的空間生長(zhǎng)的成年弗櫟平均可達(dá)15m高，胸徑可達(dá)91-122cm，樹(shù)冠范圍可達(dá) 46m以上，壽命長(zhǎng)達(dá)數(shù)百年。弗吉尼亞櫟主要分布于美國(guó)東南沿海和墨西哥灣海岸，即從弗吉尼亞州南部、佐治亞州、佛羅里達(dá)州、路易斯安娜州，直至德克薩斯州中南部一線；在俄克拉哈馬州西南部和墨西哥東北山區(qū)也有零星分布，是美國(guó)沿海硬闊林和灌叢林地的重要組成樹(shù)種，在美國(guó)東南沿海被廣泛用作城市遮蔭樹(shù)和觀賞樹(shù)木。中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所從美國(guó)密蘇里州引進(jìn)的弗吉尼亞櫟種子， 成苗后大約5%的植株主干明顯，高生長(zhǎng)突出，分枝稀疏，冠形狹?。欢鄶?shù)苗木則沒(méi)有明顯主干，枝葉密集，冠形開(kāi)張，或呈多干叢生狀態(tài)。弗吉尼亞櫟引種后，在我國(guó)浙江、上海、 江蘇、福建等亞熱帶、熱帶地區(qū)均可生長(zhǎng)，同時(shí)由于弗吉尼亞櫟具有很強(qiáng)的耐鹽堿能力，加之根系發(fā)達(dá)，萌生性強(qiáng)，枝條具韌性，具有抗擊颶風(fēng)的能力，因此被廣泛用于我國(guó)長(zhǎng)三角地帶的沿海防護(hù)林建設(shè)，彌補(bǔ)了目前我國(guó)沿海防護(hù)林體系中缺乏常綠闊葉抗風(fēng)耐鹽樹(shù)種的缺陷，是目前東南沿海防護(hù)林體系中唯一一種耐鹽常綠高大喬木樹(shù)種。同時(shí)，橡樹(shù)果吸引了大批的鳥(niǎo)類(lèi)和動(dòng)物匯集，豐富了沿海防護(hù)林體系的生物多樣性。弗吉尼亞櫟還可用于庭院、公園、農(nóng)莊等公共休閑場(chǎng)所綠化，其樹(shù)冠廣闊，葉色鮮亮，為人們良好的遮蔭、休閑場(chǎng)所和動(dòng)物的棲息地。弗吉尼亞櫟在原產(chǎn)地每年會(huì)產(chǎn)生大量橡果，因此大多采用種子繁殖，只有少數(shù)苗木公司依靠無(wú)性繁殖獲得不同性狀的無(wú)性系用于不同的育種目的。目前國(guó)內(nèi)弗吉尼亞櫟苗木大多依賴進(jìn)口種子繁殖，但由于弗吉尼亞櫟種子沒(méi)有休眠期，只要溫度合適即可萌發(fā)，因此在進(jìn)口種子過(guò)程中，由于機(jī)械損傷等原因，使得很大一部分種子在萌發(fā)后得不到及時(shí)播種而喪失活力，導(dǎo)致出苗率低，苗木成本較高。中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所在國(guó)內(nèi)首次引進(jìn)弗吉尼亞櫟并開(kāi)展相關(guān)的研究，并開(kāi)展了弗吉尼亞櫟無(wú)性繁殖技術(shù)研究，在弗吉尼亞櫟扦插繁殖方法方面取得了很大突破(ZL200910097684.0)，成活率可高達(dá)80_85%
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種可顯著提高其繁殖系數(shù)的弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法的技術(shù)方案，且大大縮短了弗吉尼亞櫟育苗周期，解決了依賴進(jìn)口種子進(jìn)行育苗的方式，節(jié)約了成本。所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟
1)外植體的選取外植體取自大田植株或室內(nèi)培養(yǎng)的幼苗；
2)外植體消毒取帶芽莖段作為外植體，外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗10-14小時(shí)后，再以 70-75%的酒精消毒25-35秒，然后升汞浸泡3_5分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗2_3次，置于無(wú)菌玻璃瓶備用；
3)初代培養(yǎng)將消毒外植體剪成0.8-1. 2cm的帶芽莖段接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天， 給予光照約2500-3500 Lx，光周期14-18hr/6_10hr，溫度25°C ±2°C;所述的初代培養(yǎng)基由 WPM培養(yǎng)基或1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤0. 8-1. 2mg/L組成；
4)不定芽增殖培養(yǎng)將初代培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)跡象的帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟3)，培養(yǎng)周期為40-50天；所述的增殖培養(yǎng)基由WPM或1/4MS+6-芐基腺嘌呤0. 1-0. 3mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸0. 4-0. 6 mg/L組成；
5)壯苗培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠，長(zhǎng)度l_2cm的不定芽逐個(gè)切下，接入WPM或 1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)條件同步驟3)；
6)生根培養(yǎng)將壯苗培養(yǎng)后健壯的芽切去基部褐色物質(zhì)和愈傷組織接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)I. 5-2. 5周，再光照培養(yǎng)3. 5-4. 5周后生根，培養(yǎng)條件同步驟3); 所述的生根培養(yǎng)基由WPM或1/4MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤0.8-1. 2 mg/L +生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸0. 4-0. 6 mg/L組成；
7)煉苗和移栽將有生根的弗吉尼亞櫟幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下室溫下煉苗 2-4天后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭即可。所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟I)中
大田植株一般應(yīng)在上半年取材，選取當(dāng)年萌發(fā)的帶芽莖段為外植體，大田采集的外植體，另加入1-2滴吐溫80消毒；
室內(nèi)培養(yǎng)選取無(wú)蟲(chóng)眼、顆粒飽滿的弗吉尼亞櫟種子，在自來(lái)水中浸泡22-26小時(shí)， 棄去漂浮的種子，然后以飽和漂白粉上清液浸泡25-35分鐘進(jìn)行表面消毒，消毒后的種子播種于30cmX20cmX8cm的塑料容器中，容器中覆蓋河沙，河沙厚度為4_6cm，將塑料容器置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ± I °C，光照強(qiáng)度11000- 13000LX,光/暗周期為 14-18h/6-10h。所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的初代培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中分別添加蔗糖15-25g. L-1，瓊脂0. 5-1. 0%，調(diào)節(jié)PH至 5. 5-5. 9。所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)所述的初代培養(yǎng)過(guò)程中需采取外植體防褐化措施，具體為在初代培養(yǎng)基中加添加0. 2-0. 4%或0. 4-0. 6%的活性炭，或多次反復(fù)轉(zhuǎn)接，即外植體第一次接種后，培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，這樣轉(zhuǎn)2-3 次。所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的WPM培養(yǎng)基由由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成；
所述的大量元素為(I)硝酸銨 NH4NO3,400 mg .L-1，(2)硝酸鈣 Ca (NO3)2, 556 mg .L-1， (3)氯化鈣 CaCl2 H20,96mg L' (4)硫酸鎂 MgSO4 7H20，370 mg L' (5)硫酸鉀 K2SO4, 990 mg I71, (6)磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg L-1 ；
所述的微量元素為:(I)硼酸H3BO3,6. 2 mg 2)鑰酸鈉Na2MoO4.240,0. 25 mg .L' (3)硫酸錳 MnSO4 4H20, 22. 3 mg L' (4)硫酸銅 CuSO4 5H20,0. 25 mg L' (5)硫酸鋅 ZnSO4 7H20,8. 6 mg L 1 ;
所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 EDTA, 37. 3 mg L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 7H20, 27. 8 mg L—1 ；
所述的有機(jī)成分為:(1)肌醇C6H12062H20，100 mg 2)煙酸NC5H4 .COOH5O. 5 mg .L' (3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS 2HC1，I. 6 mg L'所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成；
所述的大量元素為(I)硝酸鉀KNO3, 1900 mg L_\⑵硝酸銨NH4NO3, 1650 mg L—1， (3)磷酸二氫鉀 KH2PO4, 170 mg L-1，(4)硫酸鎂 MgSO4 IW2Q, 370 mg L-1，(5)氯化鈣 CaCl2 H2O, 440 mg L 1 ;
所述的微量元素為(1)碘化鉀KI，0.83 mg T1,⑵硼酸H3BO3, 6. 2 mg L' (3) 硫酸錳 MnSO4 4H20, 22. 3 mg L' (4)硫酸鋅 ZnSO4 7H20, 8.6 mg I71 (5)鑰酸鈉 Na2MoO4 2H20, 0. 25 mg L-1 (6)硫酸銅 CuSO4 5H20, 0. 025 mg L' (J)氯化鈷 CoCl2 6H20, 0. 025 mg L-1 ；
所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 EDTA, 37. 3 mg L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 7H20, 27. 8 mg L—1 ；
所述的有機(jī)成分為(I)肌醇 C6H12OJH2O, 100 mg L-1 (2)甘氨酸 NH2CH2 C00H, 2 mg L-1，(3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS 2HC1, 0. I mg L-1 (4)鹽酸吡哆醇 C8H11O3N HCl, 0. 5 mg I71 (5)煙酸 NC5H4 C00H, 0. 5 mg L'所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所用1/4MS培養(yǎng)基為大量元素是MS基本培養(yǎng)基的1/4，其余成分微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分同MS基本培養(yǎng)基。上述一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，能較好的保持母本的抗逆性和觀賞性，有效提高弗吉尼亞櫟繁殖系數(shù)。與種子繁殖相比，組織培養(yǎng)降低對(duì)進(jìn)口種子的依賴性，能有效降低苗木成本，節(jié)省開(kāi)支；與扦插繁殖相比，組織培養(yǎng)育苗周期短，4個(gè)月即可獲得生根苗木， 節(jié)約了成本。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例I :一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)步驟如下
(I)外植體的選取外植體米自中國(guó)林科院亞林所抗逆生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)的植株。(2)外植體消毒取帶芽莖段作為外植體，外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗12小時(shí)后，再以 70-75%的酒精消毒30秒(若是大田采集的外植體，則加入1-2滴吐溫80，以加強(qiáng)消毒劑的滲透)，然后升汞浸泡3-5分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗數(shù)次，置于無(wú)菌玻璃瓶備用。
(3)初代培養(yǎng)將消毒外植體剪成Icm左右的帶芽莖段接入WPM或1/4MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤I. Omg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，給予光照約30001x，光周期16hr/8hr， 溫度25°C ±2°C。由于弗吉尼亞櫟外植體含較多酚類(lèi)物質(zhì)，因此在初代培養(yǎng)過(guò)程中需采取防褐化措施，具體措施包括向培養(yǎng)基中添加0. 2-0. 4%或0. 4-0. 6%的活性炭,或多次反復(fù)轉(zhuǎn)接，即外植體第一次接種后，培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，這樣轉(zhuǎn)3次，可以有效防止褐化發(fā)生。(4)不定芽增殖培養(yǎng)將初代培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)跡象的帶芽莖段接入WPM或1/4MS+ 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤0. 2mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸0. 5 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟3)初代培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為45天。(5)壯苗培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠，長(zhǎng)度l_2cm的不定芽逐個(gè)切下，接入WPM 或1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，培養(yǎng)條件同步驟3)初代培養(yǎng)。(6)生根培養(yǎng)將壯苗培養(yǎng)后健壯的芽切去基部褐色物質(zhì)和愈傷組織接入WPM或 1/4MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤1.0 mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸0.5 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)2周，再光照培養(yǎng)4周后生根，培養(yǎng)條件同步驟3)初代培養(yǎng)。(7)煉苗和移栽將有生根的弗吉尼亞櫟幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下室溫下煉苗3天后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭，成活率可達(dá)90%以上。所述的WPM培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成
所述的大量元素為(I)硝酸銨 NH4NO3,400 mg .L-1，(2)硝酸鈣 Ca (NO3)2, 556 mg .L-1， (3)氯化鈣 CaCl2 H20,96mg L' (4)硫酸鎂 MgSO4 7H20，370 mg L' (5)硫酸鉀 K2SO4, 990 mg I71, (6)磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg L-1 ；
所述的微量元素為:(I)硼酸H3BO3,6. 2 mg 2)鑰酸鈉Na2MoO4.240,0. 25 mg .L' (3)硫酸錳 MnSO4 4H20, 22. 3 mg L' (4)硫酸銅 CuSO4 5H20,0. 25 mg L' (5)硫酸鋅 ZnSO4 7H20,8. 6 mg L 1 ;
所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 EDTA, 37. 3 mg L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 7H20, 27. 8 mg L—1 ；
所述的有機(jī)成分為:(1)肌醇C6H12062H20，100 mg 2)煙酸NC5H4 .COOH5O. 5 mg .L' (3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS 2HC1，I. 6 mg L'所述的MS培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成
所述的大量元素為(I)硝酸鉀KNO3, 1900 mg L_\⑵硝酸銨NH4NO3, 1650 mg L—1，
(3)磷酸二氫鉀 KH2PO4, 170 mg L-1，(4)硫酸鎂 MgSO4 IW2Q, 370 mg L-1，(5)氯化鈣 CaCl2 H2O, 440 mg L 1 ;
所述的微量元素為(1)碘化鉀KI，0.83 mg T1,⑵硼酸H3BO3, 6. 2 mg L' (3) 硫酸錳 MnSO4 4H20, 22. 3 mg L' (4)硫酸鋅 ZnSO4 7H20, 8.6 mg I71 (5)鑰酸鈉 Na2MoO4 2H20, 0. 25 mg L-1 (6)硫酸銅 CuSO4 5H20, 0. 025 mg L' (J)氯化鈷 CoCl2 6H20, 0. 025 mg L-1 ；
所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 EDTA, 37. 3 mg L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 7H20, 27. 8 mg L—1 ；
所述的有機(jī)成分為(I)肌醇 C6H12OJH2O, 100 mg L—1 (2)甘氨酸 NH2CH2 C00H, 2mg L-1，(3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS 2HC1, 0. I mg L-1 (4)鹽酸吡哆醇 C8H11O3N HCl, 0. 5 mg I71 (5)煙酸 NC5H4 C00H, 0. 5 mg L'上述步驟3)中外植體剪成0. 8cm或I. 2cm的帶芽莖段，培養(yǎng)25天或35天,給予光照約2500 Lx,2600 Lx或3500 Lx，光周期14hr/6hr或18hr/10hr，所述的初代培養(yǎng)基中 6-芐基腺嘌呤0. 8mg/L或I. 2mg/L ;步驟4)中培養(yǎng)周期為40天或50天；所述的增殖培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤0. I或0. 3mg/L,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸0. 4或0. 6 mg/L。步驟5)中培養(yǎng)周期為25或35天；步驟6)中先暗培養(yǎng)I. 5周或2. 5周，再光照培養(yǎng)3. 5周或4. 5周，所述的生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤為0.8或I. 2 mg/L，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸為
0.4或0.6 mg/L。其它步驟同實(shí)施例1，也能達(dá)到本發(fā)明所述的有益效果。
權(quán)利要求
1.一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟1)外植體的選取外植體取自大田植株或室內(nèi)培養(yǎng)的幼苗；2)外植體消毒取帶芽莖段作為外植體，外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗10-14小時(shí)后，再以 70-75%的酒精消毒25-35秒，然后升汞浸泡3_5分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗2_3次，置于無(wú)菌玻璃瓶備用；3)初代培養(yǎng)將消毒外植體剪成O.8-1. 2cm的帶芽莖段接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天， 給予光照約2500-3500 Lx，光周期14-18hr/6_10hr，溫度25°C ±2°C;所述的初代培養(yǎng)基由 WPM培養(yǎng)基或1/4MS培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤O. 8-1. 2mg/L組成；4)不定芽增殖培養(yǎng)將初代培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)跡象的帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟3)，培養(yǎng)周期為40-50天；所述的增殖培養(yǎng)基由WPM或1/4MS+6-芐基腺嘌呤O. 1-0. 3mg/L+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸O. 4-0. 6 mg/L組成；5)壯苗培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)基中葉色濃綠，長(zhǎng)度l_2cm的不定芽逐個(gè)切下，接入WPM或 1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)條件同步驟3)；6)生根培養(yǎng)將壯苗培養(yǎng)后健壯的芽切去基部褐色物質(zhì)和愈傷組織接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)I. 5-2. 5周，再光照培養(yǎng)3. 5-4. 5周后生根，培養(yǎng)條件同步驟3); 所述的生根培養(yǎng)基由WPM或1/4MS+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤O. 8-1. 2 mg/L +生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸O. 4-0. 6 mg/L組成；7)煉苗和移栽將有生根的弗吉尼亞櫟幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下室溫下煉苗 2-4天后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭即可。
2.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟I)中大田植株一般應(yīng)在上半年取材，選取當(dāng)年萌發(fā)的帶芽莖段為外植體，大田采集的外植體，另加入1-2滴吐溫80消毒；室內(nèi)培養(yǎng)選取無(wú)蟲(chóng)眼、顆粒飽滿的弗吉尼亞櫟種子，在自來(lái)水中浸泡22-26小時(shí)， 棄去漂浮的種子，然后以飽和漂白粉上清液浸泡25-35分鐘進(jìn)行表面消毒，消毒后的種子播種于30cmX20cmX8cm的塑料容器中，容器中覆蓋河沙，河沙厚度為4_6cm，將塑料容器置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ± I °C，光照強(qiáng)度11000- 13000Lx，光/暗周期為 14-18h/6-10h。
3.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的初代培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中分別添加蔗糖15_25g. L-1，瓊脂 O. 5-1. 0%，調(diào)節(jié) PH 至 5. 5-5. 9。
4.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)所述的初代培養(yǎng)過(guò)程中需采取外植體防褐化措施，具體為在初代培養(yǎng)基中加添加O. 2-0. 4%或O.4-0. 6%的活性炭，或多次反復(fù)轉(zhuǎn)接，即外植體第一次接種后，培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，這樣轉(zhuǎn)2-3次。
5.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的WPM培養(yǎng)基由由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成；所述的大量元素為(I)硝酸銨NH4NO3,400 mg · Λ (2)硝酸鈣Ca (NO3)2, 556 mg .L-1， (3)氯化鈣 CaCl2 · H20,96mg · Γ1，(4)硫酸鎂 MgSO4 · 7Η20，370 mg · L' (5)硫酸鉀 K2SO4,·990 mg · I71, (6)磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg · L-1 ；所述的微量元素為:(I)硼酸H3BO3,6. 2 !!^ 171，(2)鑰酸鈉似^004 .2!120，0.25 mg · Λ (3)硫酸錳 MnSO4 · 4Η20, 22. 3 mg · L' (4)硫酸銅 CuSO4 · 5Η20,0. 25 mg · L' (5)硫酸鋅 ZnSO4 · 7H20,8. 6 mg · L 1 ;所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 · EDTA, 37. 3 mg · L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 · 7H20, 27. 8 mg · L—1 ；所述的有機(jī)成分為:(1)肌醇C6H12062H20，100 !!^ 171，(2)煙酸撕5!14*0)0!1，0.5 mg · Λ (3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS · 2HC1，I. 6 mg · L'
6.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分組成；所述的大量元素為(I)硝酸鉀KNO3, 1900 mg · L_\⑵硝酸銨NH4NO3, 1650 mg · Λ(3)磷酸二氫鉀 KH2PO4, 170 mg · L-1，(4)硫酸鎂 MgSO4 · 7H20, 370 mg · L-1，(5)氯化鈣 CaCl2 · H2O, 440 mg · L 1 ;所述的微量元素為(1)碘化鉀KI，O. 83 mg · Γ1,⑵硼酸H3BO3, 6.2 mg · L_\ (3) 硫酸錳 MnSO4 · 4H20, 22. 3 mg · Γ1，(4)硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20, 8.6 mg · Γ1 (5)鑰酸鈉 Na2MoO4 · 2Η20, O. 25 mg · Γ1 (6)硫酸銅 CuSO4 · 5Η20, O. 025 mg · Γ1，(7)氯化鈷 CoCl2 · 6Η20, O. 025 mg · L-1 ；所述的鐵鹽為(I)乙二胺四乙酸二鈉Na2 · EDTA, 37. 3 mg · L_\⑵硫酸亞鐵 FeSO4 · 7H20, 27. 8 mg · L—1 ；所述的有機(jī)成分為(I)肌醇 C6H12OJH2O, 100 mg · L-1 (2)甘氨酸 NH2CH2 · C00H, 2 mg · L-1，(3)鹽酸硫胺素 C12H17ClOS · 2HC1, O. I mg · L-1 (4)鹽酸吡哆醇 C8H11O3N · HCl, O. 5 mg · Γ1 (5)煙酸 NC5H4 · C00H, O. 5 mg · L'
7.如權(quán)利要求I所述的一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，其特征在于所用1/4MS培養(yǎng)基為大量元素是MS基本培養(yǎng)基的1/4，其余成分微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分同MS基本培養(yǎng)基。
全文摘要
一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，屬于植物組織培養(yǎng)方法。其特征在于包括以下步驟1)外植體的選??；2)外植體消毒；3)初代培養(yǎng)；4)不定芽增殖培養(yǎng)；5)壯苗培養(yǎng)；6)生根培養(yǎng)；7)煉苗和移栽。上述一種弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)方法，能較好的保持母本的抗逆性和觀賞性，有效提高弗吉尼亞櫟繁殖系數(shù)。與種子繁殖相比，組織培養(yǎng)降低對(duì)進(jìn)口種子的依賴性，能有效降低苗木成本，節(jié)省開(kāi)支；與扦插繁殖相比，組織培養(yǎng)育苗周期短，4個(gè)月即可獲得生根苗木，節(jié)約了成本。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577952SQ20121002972
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者孫海菁, 王樹(shù)鳳, 路曉宏, 陳益泰, 陳雨春 申請(qǐng)人:上虞市世紀(jì)陽(yáng)光園林綠化工程有限公司, 東臺(tái)市通源種苗場(chǎng), 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所