本發(fā)明涉及一種植物愈傷組織的誘導培養(yǎng)基及使用方法，尤其是一種凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基及其誘導方法。

背景技術：
愈傷組織：本是指植物在受傷后于傷口表面形成的一團薄壁細胞。在組織培養(yǎng)中是指外植體在離體培養(yǎng)條件下，形成一團沒有分化、又能旺盛分裂的薄壁細胞團，是組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一種組織狀態(tài)。凹葉厚樸（拉丁名為MagnoliaofficinalisRehd．etWils．var．bilobaRehd．etWils）的愈傷組織中提取的厚樸酚具有很好的藥用價值，許多科學研究也需要廣泛使用其愈傷組織，因此如果高效的獲得凹葉厚樸的愈傷組織是當前需要解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是：提供一種凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基及其誘導方法，它對凹葉厚樸帶芽莖段的愈傷組織的生長具有高誘導率，而且增長明顯迅速，生長質量好，以克服現(xiàn)有技術的不足。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，它包括基礎培養(yǎng)基、1.5～4.5mg/L的6-BA、1.0～3.0mg/L的NAA、0～1.0mg/L的2，4-D、20～30g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂；PH值為5.8。所述的基礎培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基。更優(yōu)選的方案是，它包括B5培養(yǎng)基、4.5mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的2，4-D、20g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂；PH值為5.8。凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基的誘導方法，先將外植體進行預處理，選擇生長健壯、無病蟲害的凹葉厚樸帶芽莖段，將其修剪好，并用水沖洗干凈后放入盛有洗衣粉水的錐形瓶中浸泡10min，浸泡過程中不斷晃動錐形瓶，使外植體與洗衣粉水充分接觸；再用流水沖洗3h，剝?nèi)パ矿w的2層外苞片，將莖段切口處縱向剪口后放入0.1g/L的VC溶液中浸泡0.5h后作滅菌處理；將預處理過的外植體置于無菌培養(yǎng)瓶中，用75%酒精滅菌30s，再用質量百分比為0.1%的HgCl2溶液滅菌10min，然后用無菌水沖洗5次，保持滅菌和沖洗過程中進行攪動，消毒后剝?nèi)パ康耐獍?～3層后斜插到已滅菌的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。為了進一步驗證本發(fā)明的效果，按不同方案配制出愈傷組織誘導培養(yǎng)基：試驗方法采用不同的培養(yǎng)基、激素種類和濃度進行正交試驗L9(34)，正交設計的因素水平表見表1，實驗設計表見表2，實驗結果見表3。WPM培養(yǎng)基及B5培養(yǎng)基的蔗糖均為20g/L，1/2MS培養(yǎng)基（本發(fā)明中1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中所有元素減半）的蔗糖為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH5.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強度1500~2000lux。每個處理10瓶，每瓶3個外植體，實驗重復3次，觀察記錄。接種后25d統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。表1正交設計因素水平表表2愈傷組織的誘導試驗設計L9(34)A(培養(yǎng)基)B(6-BA)mg/LC(NAA)mg/LD(2,4-D)mg/LE29WPM1.51.00E30WPM3.02.00.5E31WPM4.53.01.0E32B51.52.01.0E33B53.03.00E34B54.51.00.5E351/2MS(所)1.53.00.5E361/2MS(所)3.01.01.0E371/2MS(所)4.52.00表3愈傷組織的誘導試驗結果+表示愈傷組織長勢較差，++表示愈傷組織長勢一般，+++表示愈傷組織長勢較好，++++表示愈傷組織長勢優(yōu)從表3的直觀分析表可知:處理6的愈傷組織誘導率為100%，愈傷組織為淺黃綠色，質地堅硬，長勢優(yōu)，其培養(yǎng)基配方為B5培養(yǎng)基、6-BA4.5mg/L、NAA1.0mg/L、2,4-D0.5mg/L；結合實際應用的因素考慮，當上述培養(yǎng)基中蔗糖為20g/L、瓊脂為6.5g/L（采用固體培養(yǎng)基），pH為5.8時，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)帶芽莖段，外植體的啟動時間快，平均啟動時間為5d；誘導率高，可達100%；而且長勢優(yōu)。組培過程中褐化現(xiàn)象是影響外植體是否誘導成功的一個關鍵因素之一。在本試驗中，在外植體的預處理中用0.1g/L的VC溶液對外植體進行浸泡，對外植體的褐化起到的一定的防制作用。并且在外植體接種時，將帶芽莖段斜插到固體培養(yǎng)基中，對誘導率的提高有一定效果，這是因為斜插使外植體與培養(yǎng)基充分接觸，而且提高了培養(yǎng)基中外植體的透氣性。不同的激素種類和濃度進行配比是愈傷組織誘導率提高的另一個關鍵因素之一，本研究中，最佳的培養(yǎng)基配方為B5培養(yǎng)基、6-BA4.5mg/L、NAA1.0mg/L、2,4-D0.5mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂6.5g/L，pH為5.8，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的帶芽莖段，外植體的啟動時間快，平均啟動時間為5d；誘導率高，可達100%；而且長勢優(yōu)。由于采用上述的技術方案，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用專門配制的愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，利用該愈傷組織的誘導培養(yǎng)基對凹葉厚樸帶芽莖段進行愈傷組織的誘導培養(yǎng)，可使外植體的啟動時間快，平均啟動時間為5d；誘導率高，可達100%；而且長勢優(yōu)。本發(fā)明成本低廉，使用效果好。具體實施方式本發(fā)明的實施例1：凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，它包括B5培養(yǎng)基、4.5mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的2，4-D、20g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂，PH值為5.8。凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基的誘導方法，先將外植體進行預處理，選擇生長健壯、無病蟲害的凹葉厚樸帶芽莖段，用枝剪修剪掉不要的部分，并用自來水沖洗干凈后放入盛有洗衣粉水的錐形瓶中浸泡10min，浸泡過程中不斷晃動錐形瓶，使外植體與洗衣粉水充分接觸；再用流水沖洗3h，剝?nèi)パ矿w的2層外苞片，將莖段切口處縱向剪口后放入0.1g/L的VC溶液中浸泡0.5h后作滅菌處理；將預處理過的外植體置于無菌培養(yǎng)瓶中，用75%酒精滅菌30s，再用質量百分比為0.1%的HgCl2溶液滅菌10min，然后用無菌水沖洗5次，保持滅菌和沖洗過程中進行攪動，消毒后剝?nèi)パ康耐獍?～3層后斜插到已滅菌的上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。本發(fā)明的實施例2：凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，它包括WPM培養(yǎng)基、4.5mg/L的6-BA、3.0mg/L的NAA、1.0mg/L的2，4-D、20g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂，PH值為5.8。所得到的培養(yǎng)基經(jīng)試驗得知其誘導率為100%。本發(fā)明的實施例3：凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，它包括1/2MS培養(yǎng)基、4.5mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA、30g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂，PH值為5.8。本發(fā)明的實施例4：凹葉厚樸帶芽莖段愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，它包括B5培養(yǎng)基、1.5mg/L的6-BA、2.0mg/L的NAA、1.0mg/L的2，4-D、20g/L的蔗糖及6.5g/L的瓊脂，PH值為5.8。采用實施例1中的培養(yǎng)基進行試驗，愈傷組織的誘導率為100%。采用實施例2中的培養(yǎng)基進行試驗，愈傷組織的誘導率為48.6%。采用實施例3中的培養(yǎng)基進行試驗，愈傷組織的誘導率為87.7%。采用實施例4中的培養(yǎng)基進行試驗，愈傷組織的誘導率為63.9%。