專利名稱：一種基于啤酒糟和米糠粕的飼用微生態(tài)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼用微生態(tài)制劑領(lǐng)域，特別是涉及基于纖維質(zhì)的釀造廢棄物的高效低成本的新型微生物飼料添加剤。
背景技術(shù)：
中國(guó)已是世界第一啤酒大國(guó)，年產(chǎn)啤酒糟I千萬(wàn)噸以上，啤酒糟含有豐富蛋白質(zhì)(25-35%)、纖維素(14-25%)、脂類(6 —10%)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，但其水分含量高，不易貯存，一旦滯銷很容易霉?fàn)€、腐敗而影響 環(huán)境。目前國(guó)內(nèi)一些啤酒生產(chǎn)企業(yè)將啤酒糟直接干燥處理，用于飼料出售，不僅能耗大，這種飼料中的非蛋白氮和無(wú)機(jī)氮不能被飼養(yǎng)動(dòng)物有效利用，纖維素也阻礙了營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。因此合理的開發(fā)和利用啤酒糟不僅能變廢為寶，而且能給企業(yè)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益。公開專利CN1745647A以廢酵母和黑曲霉接種啤酒糟發(fā)酵，公開專利CN101779749A以黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母接種啤酒糟發(fā)酵，這些菌種對(duì)纖維素降解都不徹底，霉菌發(fā)酵后霉味明顯，降低飼料的適ロ，產(chǎn)品需要干燥處理，能耗大，特別是益生菌種類少，存活率低，益生效果很小。公開專利CN101139560A以乳酸桿菌，枯草桿菌和奇異酵母接種啤酒糟發(fā)酵，這些菌種對(duì)纖維素降解都不徹底，發(fā)酵只有一歩，需氧和厭氧發(fā)酵沒(méi)有分開，發(fā)酵效果不好，啤酒糟需要風(fēng)干后再配料，重新加蒸餾水，過(guò)程煩長(zhǎng)，不適合產(chǎn)業(yè)化。公開專利CN101584376A和CN101139560A以粗糙脈孢菌為纖維素降解菌，有不錯(cuò)的降解能力，但啤酒糟先烘干，能耗太大，粗糙脈孢菌作為產(chǎn)品成份給畜禽吃，適ロ性不好，菌本身不是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的益生菌，雖然后者有乳酸菌加入，但ー步發(fā)酵，需氧和厭氧矛盾，乳酸菌菌體生長(zhǎng)不好，加上這些產(chǎn)品都要干燥處理，菌體一般已死，益生菌效果不明顯。對(duì)于啤酒糟含水分較多，最好用其它含水分很少的エ農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物調(diào)節(jié)水分為好，如米糠，糠是稻谷加工過(guò)程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，由種皮、果皮、外胚乳和糊粉層組成。米糠營(yíng)養(yǎng)豐富，其中富含水分、粗蛋白質(zhì)(12-15%)、粗脂肪(6-18%)、粗纖維(6-16%)，水溶性多糖、維生素、還含有油酸、亞油酸、磷脂等脂肪酸以及各種礦物質(zhì)。中國(guó)是稻谷產(chǎn)量最大的國(guó)家，年產(chǎn)米糠也在千萬(wàn)噸以上，米糠飼用時(shí)，一般是直接投料飼喂，但是由于米糠粗纖維過(guò)高，糠質(zhì)干燥，難以消化，會(huì)吸收腸道內(nèi)過(guò)多的水分，如果飼喂過(guò)多再加上飲水不足和管理不善，極易引起豬便秘。再者，米糠含有其它ー些抗?fàn)I養(yǎng)因子，例如含有胰蛋白酶抑制因子(trypsininhibitor, TI)。因此,米糠經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后,飼用效果可能更好,公開專利CN102334611A接入納豆芽孢桿菌和酵母菌，公開專利CN102356815A接入酵素菌、枯草桿菌、酵母菌和嗜乳酸桿菌，這些菌對(duì)米糠的木質(zhì)纖維素降解能力有限，而且后者需氧菌和厭氧菌ー步發(fā)酵，效果不好。這些發(fā)酵產(chǎn)品都要干燥處理，能耗大，益生菌菌酶保存率低，飼用效果不佳，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于生產(chǎn)ー種基于啤酒糟、米糠柏的高效極低成本的飼用微生態(tài)制齊U，添加量大，可達(dá)5-30%，綜合營(yíng)養(yǎng)豐富，也稱微生物飼料蛋白，成品中益生菌主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、雙歧桿菌，活菌數(shù)60億以上cfu/g，功能酶、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，必需氨基酸勻恒，飼養(yǎng)效果顯著，價(jià)廉物美，保存期長(zhǎng)，市場(chǎng)容量大，環(huán)境友好，社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益明顯。本發(fā)明所述的基于啤酒糟和米糠的微生態(tài)制劑是以啤酒糟為主要氮源兼部分碳源，以米糠為主要碳源兼氮源，經(jīng)食品級(jí)脈孢霉一期發(fā)酵預(yù)處理，充分降解稻殼來(lái)源的米糠中木質(zhì)素和纖維素及啤酒糟中的粗纖維，再以芽孢桿菌和酵母菌為發(fā)酵菌種同時(shí)補(bǔ)料添加部分米糠柏和少量豆柏進(jìn)行二期發(fā)酵，最后再添加部分米糠柏和少量豆柏作為氮源兼碳源，接種乳酸菌和耐酸雙歧桿菌并充分混勻后，分裝在單向膜厭氧袋中密封保存，即三期發(fā)酵獲得成品。本發(fā)明所有菌種
這里的脈孢霉為粗糙脈孢霉{Neurospora crassa),好食脈孢霉{Neurosporasi tophi la).中間脈孢霉(Neuro spora intermedia)的任意一種或多種。酵母菌為熱帶假絲酵母{Candida tropicalis),產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utiHs),啤酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)等的任意一種或多種。雙歧桿菌為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)等。乳酸菌為植物乳桿菌(ZacioAaciBw1S iara ),保加利亞乳桿菌{Lactobacillus bulgaricus、,嗜酸乳桿菌{Lactobacillus acidophilus、,乳酸乳桿菌(LacioAaciBw1S干酪乳桿菌(ZacioAaciBw1S casei)等的任意一種或
多種。芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌iBaciIlus Iicheniformi5·)、枯草芽孢桿菌(ifeciBiAssubtiIIus的任意一種或多種。上述菌種為普通菌株，在中國(guó)
普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)或市場(chǎng)上都能購(gòu)買到。本發(fā)明產(chǎn)品的具體生產(chǎn)過(guò)程如下
I第一期生物預(yù)處理發(fā)酵
Cl)脈孢霉的種子和生產(chǎn)培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，定容IL中，pH5.0，110°C滅菌 30min。接種 30°C培養(yǎng) 4_10 天。種子液體培養(yǎng)基=KH2PO4 2g，MgSO4 O. 3g，CaCl2 O. 3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3 g，麥芽汁 3g, FeSO4 · 7H20 O. 005g, ZnSO4 O. 0014g, MnSO4. 4H20 0. 0016g, CoCl2O. 002 g，定容于I L中，pH 5.0。500 ml三角瓶中加100 ml培養(yǎng)基，110°C滅菌30min。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基粉碎后的濕啤酒糟占培養(yǎng)基總質(zhì)量40-90%，米糠柏占10-60%，硝酸氨占O. 1_3%，尿素占O. 1_3%，碳酸鈣占O. 1_5%，磷酸ニ氫鉀
O.1-3%，硫酸鎂O. 01-1%，培養(yǎng)基最終含水量為55-70%。(2)培養(yǎng)方法
將脈孢菌各在斜面培養(yǎng)基上劃單菌落復(fù)壯，再各挑選強(qiáng)壯的單菌落，各接種在新的斜面培養(yǎng)基25-38°C生長(zhǎng)，斜面培養(yǎng)基菌種中的孢子用無(wú)菌水洗下接種于搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量 100-250ml /L 三角瓶，150-220 r/min，25_38°C，培養(yǎng) 24_48h，再各以 1_5%(V/V)接種量，混合轉(zhuǎn)接到200L的種子罐中，于25-38°C，150-220 r /min培養(yǎng)24_48h，活菌總數(shù)為I X IO7cfu/ml以上，再各以1-10%接種量轉(zhuǎn)接到上述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢韬螅?5-38°C，發(fā)酵24-72h，作為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種子，以1-15%接種量接種到上述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢韬螅?5-38°C，發(fā)酵24-72h，完成一期預(yù)處理發(fā)酵。進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，一期固態(tài)發(fā)酵接種生產(chǎn)種子為上次發(fā)酵預(yù)處理的固態(tài)培養(yǎng)基菌劑，按1-20%接種量接種。
第二期發(fā)酵
(I)芽孢桿菌培養(yǎng)基
芽孢桿菌斜面和平板菌種培養(yǎng)基蛋白胨log，牛肉膏粉5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000ml，最終 ρΗ7· 0±0· 2。110_121°C滅菌 20_30min.
芽孢桿菌搖瓶種子培養(yǎng)基和種子罐培養(yǎng)基牛肉膏5. Og/L,蛋白胨20. Og/L,葡萄糖5. Og/L, FeCl2 · 6H20 O. 07g/L, MnCl2 · 7H20 O. 01g/L, MgSO4 · 7H20 0. 15g/L, pH 6. 5-7. 0，110-121°C 滅菌 20-30min。 (2)酵母菌培養(yǎng)基
酵母菌斜面培養(yǎng)基和平板菌種培養(yǎng)基(100 ml):葡萄糖2 g、酵母浸出物I g、蛋白胨2g、瓊脂2 g，pH值約6. O。搖瓶種子培養(yǎng)基和種子罐培養(yǎng)基成分同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂。(3)二期發(fā)酵培養(yǎng)基由一期發(fā)酵預(yù)處理的固態(tài)菌劑再加10-30%米糠柏和1-20%的豆柏組成，含水量為45-55%。首次啟動(dòng)二期發(fā)酵要制作混合酵母菌和混合芽孢桿菌液體種子液，再固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生固態(tài)種子，以1-15%接種量接到二期發(fā)酵培養(yǎng)基中。(4)培養(yǎng)方法
芽孢桿菌液體菌種培養(yǎng)無(wú)菌條件下分別將4で保存的芽孢桿菌菌種地衣芽孢桿菌{Bacillus枯草芽抱桿菌{Bacillus納豆桿菌{Bacillus
natto)。各接ー環(huán)至斜面培養(yǎng)基中，30-37で培養(yǎng)16-36 h復(fù)蘇菌種。再在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述芽孢桿菌搖瓶種子培養(yǎng)基，裝液量100-300ml /L三角瓶，150-240 r/min，28-38°C，培養(yǎng)16-24h，再以1_10%的接種量混合接種到上述200L種子罐培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，150-240r/min，通氣量為20_50L/min，培養(yǎng)16_24h后制得復(fù)合芽孢桿菌液體種子，活菌總數(shù)為2 X IO7 cfu/ml以上。酵母菌液體菌種培養(yǎng)
無(wú)菌條件下分別將4 °C保存的酵母菌菌種啤酒酵母i^accharomycGS cerevisiae),熱帶假絲酵母,產(chǎn)朊假絲酵母utilis、。分別接一環(huán)至斜面培養(yǎng)基中，28-38で培養(yǎng)24-48 h復(fù)蘇菌種。再挑單菌落各在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述酵母菌搖瓶種子培養(yǎng)基，裝液量100-300ml /L三角瓶，150-240 r/min，28-38°C，培養(yǎng)24_48h，再以1_10%的接種量混合接種到上述200L種子罐培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，150-240r/min,通氣量為20_50L/min，培養(yǎng)24_48h后制得復(fù)合酵母菌液體種子，活菌總數(shù)為2X IO7 cfu/ml以上。二期固態(tài)發(fā)酵
上述混合芽孢桿菌液體種子以1-10%接種量，混合酵母菌液體菌種以1-10%接種量，都接種到二期發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢瑁?8-38°C通氣發(fā)酵12-72h，得到第一批二期固態(tài)發(fā)酵完成后的半成品。進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，種子為上次二期發(fā)酵的剰余固態(tài)菌劑，按1-20%接種量，接種到二期發(fā)酵培養(yǎng)基上，這樣循環(huán)接種利用。3第三期發(fā)酵 (I)乳酸菌培養(yǎng)基
MRS斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸ニ銨2，吐溫80 I. O ml,こ酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 · 7 H2O 0. 58，MnSO4 · 4H20 0. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。
搖瓶和種子罐乳酸菌種子培養(yǎng)基大豆低聚糖2. 25%、葡萄糖2. 00%、蛋白胨I. 25%、酵母粉I. 25%、番茄汁6. 50%、吐溫80. 10%、磷酸氫ニ鉀O. 20%。pH 6. 5，IL的三角瓶裝液量200 ml。以上培養(yǎng)基配好后均在115_120°C條件下高壓滅菌20_30min。(2)雙歧桿菌的培養(yǎng)基
MRS斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸ニ銨2，吐溫80 I. O ml,こ酸鈉 25，K2HPO4 2 ，MgSO4 · 7 H2O O. 58，MnSO4 · 4H20 O. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。厭氧瓶和種子罐雙歧桿菌増殖培養(yǎng)基蛋白胨5. 0g，牛肉膏5. Og,胰蛋白胨10.(^，酵母浸出粉5.(^，葡萄糖10. 0g，吐溫-80 I. 0ml, K2HPO4 2. 0g，こ酸鈉5. 0g，檸檬酸氫ニ銨 2. 0g, ZnSO4 · 7H20 O. 25g，MgSO4 · 7H20 O. lg，聚果糖 5g 和碳酸鈣 Ig 番茄汁 65ml。加蒸懼水至1000ml,調(diào)pH值為6. 5。以上培養(yǎng)基配好后均在115_120°C條件下高壓滅菌15_30min。(3)三期發(fā)酵培養(yǎng)基
在二期固態(tài)發(fā)酵菌劑上，加1-40%米糠柏和1-30%豆柏，充分混勻，組成三期發(fā)酵培養(yǎng)基，含水量為30-35%。首次啟動(dòng)三期發(fā)酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，以1-15%接種量接到三期發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行三期發(fā)酵。(4)培養(yǎng)方法 乳酸菌種子培養(yǎng)
將植物乳桿菌iLactobacillus plantarum),保加利亞乳桿菌{Lactobacillusbulgaricus),嗜酸乳桿菌iLactobaciIlus acidophiIus),乳酸乳桿菌iLactobaciIlusiis ),干酪乳桿菌{LactobaciIlus Paracasei)等在MRS斜面培養(yǎng)基上劃線活化,在33-38°C培養(yǎng)24-48h進(jìn)行復(fù)壯，并形成單菌落，再各挑取單菌落，接種到乳酸菌種子培養(yǎng)基，33-38°C靜置培養(yǎng)24-48h，通入氮?dú)馐谷苎蹙S持為0，定時(shí)取樣，測(cè)定生物量。再按1_10%接種量接種到種子罐乳酸菌種子培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24-72h，通入氮?dú)馐谷苎蹙S持為0，定時(shí)取樣，測(cè)定生物量，活菌總數(shù)為5X IO7 cfu/ml以上。雙歧桿菌種子培養(yǎng)
首先是菌種活化，取保存的菌種，在厭氧操作臺(tái)上，在裝有MRS固體斜面培養(yǎng)基上劃線復(fù)壯，置于33-38で厭氧培養(yǎng)24 _48h，挑選強(qiáng)壯單菌落，接入裝有10 ml液體MRS培養(yǎng)基的充滿氮?dú)獾膮捬豕苤?，置?3-38°C厭氧培養(yǎng)24-48 h。再按O. 1_1%接種量，接到IL厭氧瓶雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基中置于33-38°C厭氧培養(yǎng)24-48h，然后再按1_10%接種量接到種子罐雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行33-38で厭氧培養(yǎng)，活菌總數(shù)為5X IO7 cfu/ml以上。第三期固態(tài)發(fā)酵
在二期固態(tài)發(fā)酵菌劑上，加1-40%米糠柏和1-30%豆柏組成三期發(fā)酵培養(yǎng)基，含水量為30-35%,首次啟動(dòng)三期發(fā)酵要制作混合乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，混合乳酸菌種子液和雙歧桿菌種子液按I: α-4)比例，活菌總數(shù)為5Χ107 cfu/ml以上，以1-15%接種量接種到三期固態(tài)發(fā)酵菌劑上，充分?jǐn)嚢韬?，盡快裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵，含水量30-35%，產(chǎn)品保質(zhì)期可達(dá)I到2年，保存ニ到三個(gè)月活菌數(shù)達(dá)到高峰，可達(dá)200億cfu/g固體。進(jìn)入連續(xù)發(fā)酵階段，三期發(fā)酵ー個(gè)月后，以此成品為種子，按1-20%接種量，接到上述三期發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵，進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，產(chǎn)品保質(zhì)期可達(dá)I到3年，保存ニ個(gè)月活菌數(shù)達(dá)到高峰，可達(dá)200億cfu/go本發(fā)明固體原料不需高溫滅菌，成品不需要干燥處理，保質(zhì)期一年以上，添加量達(dá)5-30%,活性益生菌數(shù)極高，酶量豐富，雜菌極少，飼養(yǎng)效果明顯，具有明顯的生態(tài)和社會(huì)效益。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用菌種僅為舉例說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)的菌種均都實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的。
實(shí)施例I
第一期生物預(yù)處理發(fā)酵 (O脈孢霉種子和生產(chǎn)培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，定容I L中，pH5.0，110°C滅菌 30min。接種 30°C，培養(yǎng) 7_10 天。種子液體培養(yǎng)基=KH2PO4 2g，MgSO4 O. 3g，CaCl2 O. 3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3 g，麥芽汁 3g, FeSO4 · 7H20 O. 005g, ZnSO4 O. 0014g, MnSO4. 4H20 0. 0016g, CoCl2O. 002 g，定容于I L中，pH 5.0。500 ml三角瓶中加100 ml培養(yǎng)基，110°C滅菌30min。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基粉碎后的濕啤酒糟占培養(yǎng)基總質(zhì)量67%，米糠柏占28%，硝酸氨占2%，尿素占1%，碳酸鈣占1%，磷酸ニ氫鉀1%，硫酸鎂O. 1%，培養(yǎng)基最終含水量為59%。(2)培養(yǎng)方法
將粗糖脈抱霉(Neurospora crassa CGMCC3. 1600),好食脈抱霉(Neurosporasitophila, CGMCC3. 1618).中間脈抱霉(Neurospora intermedia, CGMCC 3.591)。各在斜面培養(yǎng)基上劃單菌落復(fù)壯，再各挑選強(qiáng)壯的單菌落，接種在新的脈孢菌斜面培養(yǎng)基30°C生長(zhǎng)，斜面培養(yǎng)基菌種中的孢子用無(wú)菌水洗下接種于搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量200ml /IL三角瓶，180 r/min, 30 0C，條件下培養(yǎng)24h，再以1%接種量，混合轉(zhuǎn)接到200L的種子罐中，于30°C，180 r /m in培養(yǎng)24h，活菌總數(shù)為5 X 108cfu/ml以上，再以10%(重量)接種量轉(zhuǎn)接到上述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢韬螅?0°C，發(fā)酵48h，作為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種子，以10%接種量(重量)接種到上述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢韬螅?0°C，發(fā)酵48h，完成一期預(yù)處發(fā)酵。進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，一期發(fā)酵接種生產(chǎn)種子為上次發(fā)酵的預(yù)處理的固態(tài)培養(yǎng)基，按10%(重量)接種量接種接到新的一期培養(yǎng)基中。實(shí)施例2 第二期發(fā)酵
(I)芽孢桿菌培養(yǎng)基
芽孢桿菌斜面和平板菌種培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1000ml，最終 ρΗ7·0±0·2。110°C滅菌 30min.
芽孢桿菌搖瓶種子培養(yǎng)基和種子罐培養(yǎng)基牛肉膏5. 0g/L，蛋白胨20. 0g/L,葡萄糖5. 0g/L, FeCl2 · 6H20 0. 07g/L, MnCl2 · 7H20 0. 01g/L, MgSO4 · 7H20 0. 15g/L, pH 7. 0，110°C滅菌30min。(2)酵母菌培養(yǎng)基
酵母菌斜面培養(yǎng)基和平板菌種培養(yǎng)基(100 ml):葡萄糖2 g、酵母浸出物I g、蛋白胨2g、瓊脂2 g，pH值約6. O。搖瓶種子培養(yǎng)基和種子罐培養(yǎng)基成分同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂。(3) 二期發(fā)酵培養(yǎng)基由一期發(fā)酵預(yù)處理的固態(tài)菌劑再加15%米糠和5%豆柏組成，含水量為48%。首次啟動(dòng)二期發(fā)酵要制作酵母菌和芽孢桿菌液體種子液，再固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生固態(tài)種子，以10%接種量接到二期發(fā)酵培養(yǎng)基。 (4)培養(yǎng)方法
芽孢桿菌液體菌種培養(yǎng)無(wú)菌條件下分別將4で保存的芽孢桿菌菌種地衣芽孢桿菌(.Bacillus Ii cheni formi s, CGMCC I. 813)、枯草芽抱桿菌subtil is, CGMCCI. 884)、納豆桿菌UaciBw1S ο, CGMCC I. 1086)。各接ー環(huán)至斜面培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)36 h復(fù)蘇菌種。再在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述芽孢桿菌搖瓶種子培養(yǎng)基，裝液量200ml /IL三角瓶，220 r/min，30°C培養(yǎng)16h，再各以2%的接種量接種到上述200L種子罐培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，220r/min,通氣量為40L/min，培養(yǎng)24h后制得混合芽孢桿菌液體種子，活菌總數(shù)為lX109cfu/ml以上。酵母菌液體菌種培養(yǎng)
無(wú)菌條件下分別將4 °C保存的酵母菌菌種啤酒酵母cerevisiae,CGMCC 2. 1527)，熱帶假絲酵母{Candida tropicalis, CGMCC 2. 637)，產(chǎn)朊假絲酵母{Candida util is, CGMCC 2.1180)。接ー環(huán)至斜面培養(yǎng)基中，30で培養(yǎng)24 h復(fù)蘇菌種。再分別在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述酵母菌搖瓶種子培養(yǎng)基，裝液量200ml /IL三角瓶，220 r/min，30°C培養(yǎng)24h，再各以1%的接種量接種到上述200L種子罐培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，220r/min,通氣量為40L/min，培養(yǎng)24h后制得混合酵母菌液體種子，活菌總數(shù)為I X 109cfu/ml以上。二期固態(tài)發(fā)酵
上述混合芽孢桿菌液體種子以5%接種量，混合酵母菌液體菌種以5%接種量，接種到ニ期固體發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢瑁?5°C通氣發(fā)酵48h，得到第一批二期固態(tài)發(fā)酵完成后的半成品。進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，固態(tài)發(fā)酵種子為上次二期發(fā)酵的剰余固態(tài)菌劑，按10%接種量，接種到新的二期固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，這樣循環(huán)接種利用。實(shí)施例3 第三期發(fā)酵
(I)乳酸菌培養(yǎng)基
MRS斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸ニ銨2，吐溫80 I. O ml,こ酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 · 7 H2O O. 58，MnSO4 · 4H20 O. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。搖瓶和種子罐乳酸菌種子培養(yǎng)基(g/L):大豆低聚糖2. 25%、葡萄糖2. 00%、蛋白胨
I.25%、酵母粉I. 25%、番茄汁6. 50%、吐溫80. 10%、磷酸氫ニ鉀O. 20%。pH 6. 5，IL的三角瓶裝液量200 ml ο以上培養(yǎng)基配好后均在115°C條件下高壓滅菌30min。(2)雙歧桿菌(ガi/Yi/o如Cieriws 應(yīng)，CGMCC I. M77)的培養(yǎng)基MRS斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸ニ銨2，吐溫80 I. O ml,こ酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 · 7 H2O O. 58，MnSO4 · 4H20 O. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。厭氧瓶和種子罐雙歧桿菌増殖培養(yǎng)基蛋白胨5. 0g，牛肉膏5. Og,胰蛋白胨10. 0g，酵母浸出粉5. 0g，葡萄糖10. Og,吐溫-80 I. 0ml, K2HPO4 2. Og,こ酸鈉5. 0g，檸檬酸氫ニ銨 2. 0g, ZnSO4 · 7H20 O. 25g，MgSO4 · 7H20 O. lg，聚果糖 5g 和碳酸鈣 Ig 番茄汁 65ml，加蒸懼水至1000ml,調(diào)pH值為6. 5。以上培養(yǎng)基配好后均在115°C條件下高壓滅菌30min。(3)三期發(fā)酵培養(yǎng)基
在二期固態(tài)發(fā)酵菌劑上，加35%米糠柏和5%豆柏 ，充分混勻，組成三期發(fā)酵培養(yǎng)基，含水量為32%。首次啟動(dòng)三期發(fā)酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，以10%接種量(重量)接到三期發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行三期發(fā)酵。(4)培養(yǎng)方法 乳酸菌種子培養(yǎng)
將植物乳桿菌iLactobacillus plan tarum, CGMCC I. 557),保加利亞乳桿菌^Lactobacillus bulgari cus, CGMCC 7· 74ぬ 嗜酸乳桿菌(LacioAaciBtts acidophilus,CGMCC I. 2467)，乳酸乳桿 M(Lactobacillus Iactis, CGMCC I. 2467)，干酪乳桿菌{Lactobacillus casei, CGMCC I. 62)等各在MRS斜面培養(yǎng)基上劃線活化，在37°C培養(yǎng)28h進(jìn)行復(fù)壯，并形成單菌落，再各挑取單菌落，接種到乳酸菌種子培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)24h，通入氮?dú)馐谷苎蹙S持為0，定時(shí)取樣，測(cè)定生物量。再各按2%接種量接種到種子罐乳酸菌種子培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)48h，通入氮?dú)馐谷苎蹙S持為0，定時(shí)取樣，測(cè)定生物量，活菌總數(shù)為I X 109cfu/ml 以上。袁 iBifidobacterium bifidum, CQKC I. 2477)種子培養(yǎng)
首先是菌種活化，取保存的菌種，在厭氧操作臺(tái)上，在裝有MRS固體斜面培養(yǎng)基上劃線復(fù)壯，置于37で厭氧培養(yǎng)48h，挑選強(qiáng)壯單菌落，接入裝有10 ml液體MRS培養(yǎng)基的充滿氮?dú)獾膮捬豕苤?，置?7で厭氧培養(yǎng)24 h。再按1%接種量，接到IL厭氧瓶雙歧桿菌増殖培養(yǎng)基中置于37で厭氧培養(yǎng)48h，然后再按2%接種量接到種子罐雙歧桿菌増殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行37で厭氧培養(yǎng)，活菌總數(shù)為lX109cfu/ml以上。第三期固態(tài)發(fā)酵
在二期固態(tài)發(fā)酵菌劑基礎(chǔ)上，加35%米糠柏和5%豆柏組成，配成三期發(fā)酵培養(yǎng)基，含水量為32%，首次啟動(dòng)三期發(fā)酵要制作混合乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，混合乳酸菌種子液和雙歧桿菌種子液按1:2比例以10%接種(重量)到三期發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢韬?，盡快裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵，含水量32%，產(chǎn)品保質(zhì)期可達(dá)2年，保存ニ個(gè)月活菌數(shù)達(dá)到高峰，可達(dá)200億cfu/g固體。進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，三期發(fā)酵ー個(gè)月后，以此成品為種子，按10%接種量(重量)，接到上述三期發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵，進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)品保質(zhì)期可達(dá)2年，保存ニ個(gè)月活菌數(shù)達(dá)到高峰，可達(dá)200億cfu/g，產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果如表I。表1，三期發(fā)酵成品檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種基于啤酒糟和米糠的微生態(tài)制劑，其特征是以啤酒糟和米糠經(jīng)食品級(jí)霉菌一期發(fā)酵預(yù)處理，再以芽孢桿菌和酵母菌為發(fā)酵菌種同時(shí)補(bǔ)料添加部分米糠和豆柏進(jìn)行二期發(fā)酵，最后再添加部分米糠和少量豆柏作為氮源兼部分碳源，接種乳酸菌和耐酸雙歧桿菌并充分混勻后，分裝在單向膜厭氧袋中密封保存，即三期發(fā)酵獲得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生態(tài)制劑，其特征是所述預(yù)處理中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為粉碎后的濕啤酒糟占培養(yǎng)基總質(zhì)量40-90%，米糠柏占10-60%，硝酸氨占O. 1-3%，尿素占O. 1-3%，碳酸鈣占O. 1-5%，磷酸ニ氫鉀O. 1-3%，硫酸鎂O. 01-1%,培養(yǎng)基最終含水量為55-70% ； 首次啟動(dòng)一期發(fā)酵要制作液體霉菌種子液，活菌總數(shù)為IXlO7 cfu/ml以上，以1-10%(重量)接種量接到一期發(fā)酵培養(yǎng)基中，再固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生固態(tài)霉菌種子，以1-15%接種量接到白酒糟培養(yǎng)基中，進(jìn)行24-72h的一期發(fā)酵，進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，接種種子為上次預(yù)處理的固態(tài)培養(yǎng)基，按1-20%接種量接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生態(tài)制劑，其特征是所述二期發(fā)酵培養(yǎng)基由一期發(fā)酵預(yù)處理的固態(tài)菌劑再加10-30%米糠柏和1-20%的豆柏組成，含水量為45-55% ； 首次啟動(dòng)二期發(fā)酵要制作酵母菌和芽孢桿菌液體種子液，酵母菌和芽孢桿菌比例為(I :1) (I :4)，活菌總數(shù)為2 X IO7 cfu/ml以上，以ト10% (重量)接種量接到部分的二期發(fā)酵培養(yǎng)基中，再固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生固態(tài)種子，以1-15%接種量接到另外的二期發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行12-48h 二期發(fā)酵；進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段，種子為上次二期發(fā)酵的剰余固態(tài)菌劑，按1-20%接種量，接種二期發(fā)酵培養(yǎng)基上，這樣循環(huán)利用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物飼料，其特征是所述三期發(fā)酵培養(yǎng)基由二期發(fā)酵的固態(tài)菌劑再加1-40%米糠柏和1-30%豆柏組成，三期發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為30-35%，首次啟動(dòng)三期發(fā)酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，乳酸菌和雙歧桿菌活菌數(shù)之比為(I 1) (I :4)，乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液中的活菌總數(shù)為5 X IO7 cfu/ml以上，以1-15%(重量)接種量接到三期發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵；發(fā)酵ー個(gè)月后，以此成品為種子，按1-20%接種量，接到上述三期發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進(jìn)行三期厭氧發(fā)酵，進(jìn)入連續(xù)生產(chǎn)階段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生態(tài)制劑，其特征是所述啤酒糟在潮濕狀態(tài)下經(jīng)過(guò)粉碎，大約20到100目左右。
6.根據(jù)權(quán)利要求I一 5之一所述的微生態(tài)制劑，其特征是所述霉菌為粗糙脈孢霉{Neurospora crassa),好食脈抱霉 i^eurospora,中間脈抱霉{Neurosporaintermedia)的任意ー種或多種；酵母菌為熱帶假絲酵母{Candida tropicalis) ,f11月元假絲酵母啤酒酵母(feccAaro焊Ce1S cerevisiae)的任意一種或多種；雙歧桿菌為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum);乳酸菌為植物乳桿菌{LactobaciIlus iar應(yīng))，保加利亞乳桿菌(Zac οAaciBw1S buIgaricus^),嗜酸乳桿菌{Lactobacillus acidophilus、,乳酸乳桿菌{Lactobacillus I act is),干酪乳桿菌{Lactobacillus casei)的任意一種或多種；芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌)、枯草芽抱桿菌{Bacillus納豆桿菌{Bacillus的任意ー種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用啤酒糟和米糠粕經(jīng)益生菌三期發(fā)酵，生產(chǎn)一種高效、極低成本的飼用微生態(tài)制劑，或者叫微生物飼料添加劑。其特征是啤酒糟和米糠粕經(jīng)過(guò)脈孢菌一期初步發(fā)酵預(yù)處理，充分降解木質(zhì)素、纖維素等，再添加部分米糠粕和少量豆粕經(jīng)芽孢桿菌和酵母菌二期發(fā)酵，吸收霉菌降解廢棄物產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及霉菌本身解體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然后加部分米糠粕和少量豆粕，經(jīng)乳酸菌、雙歧桿菌等最后在單向膜厭氧袋中經(jīng)三期厭氧發(fā)酵成成品。本發(fā)明固體原料不需高溫滅菌，成品不需要干燥處理，保質(zhì)期一年以上，添加量達(dá)5-30%，活性益生菌數(shù)極高，酶量豐富，雜菌極少，飼養(yǎng)效果明顯，具有明顯的生態(tài)和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A23K1/00GK102687792SQ20121017674
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者倪忠, 崔鳳杰, 崔恒林, 施海峰, 李萍萍, 楊勝利, 王浩森, 謝永明, 譚小力, 陳華友, 齊向輝 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)