專利名稱：一種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莖尖細胞層的離體重排技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法。
背景技術(shù)：
彩葉植物是指葉片呈現(xiàn)除綠葉以外的各種顏色或包括綠色的多種顏色的植物。由于彩葉植物具有色彩絢麗，觀賞期長，易養(yǎng)護等特點，已成為園林綠化的新寵，市場需求大。其中，嵌合體彩葉植物是彩葉植物是一個重要的類型群體(嵌合體植物即其頂端分生組織包含兩種或兩種以上遺傳型細胞并由這些細胞層共同形成器官并最終發(fā)育而成的完整植株)，例如常見的金心吊蘭、“法蘭西”玉簪、雙色美人蕉等都屬于嵌合體彩葉植物，觀賞價值極聞。 然而，現(xiàn)有的大多數(shù)嵌合體彩葉植物都是在自然條件下自發(fā)產(chǎn)生的，人為合成技術(shù)的難度較大；此外，我國嵌合體彩葉觀賞植物品種絕大多數(shù)是由國外引進的，自主創(chuàng)新的廣度和深度都非常有限。眾所周知，優(yōu)良品種是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)花卉植物和產(chǎn)業(yè)提升的關(guān)鍵。因此，有效利用現(xiàn)有的嵌合體彩葉植物資源進行種質(zhì)創(chuàng)新工作，對于增強我國花卉業(yè)國際競爭力、快速拉近與國際育種水平的差距具有重要的意義。由于大多數(shù)被子植物的雌雄配子均來源于其莖尖分生組織的L2層，常規(guī)的有性雜交育種會造成嵌合體彩葉植物獨特性狀的分離，極大地限制了嵌合體彩葉植物育種的發(fā)展(參見 Opportunities for synthetic plant chimeral breeding:Past and future.Burge GK, Morgan ER, Seelye JF. Plant Cell Tiss Organ Cult,第 70 卷第 I 期，13-21頁，2002年)。因此，目前急需一套針對嵌合體植物的種質(zhì)改良與創(chuàng)新方法，而莖尖細胞層的離體重排技術(shù)能夠從現(xiàn)有的嵌合體植物中篩選出有價值的嵌合體新類型。但在此之前還沒有關(guān)于通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的技術(shù)方法，更沒有成功的實例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是要解決上述技術(shù)存在的不足，而提供一種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，包括如下步驟(I)選取具有嵌合性狀的嵌合體植株材料的頂芽或帶有腋芽的莖段作為外植體，對外植體進行表面消毒處理后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗3飛遍；(2)將沖洗后的外植體于滅菌濾紙上吸去水分后接種到初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2° C、光照強度為O 80 μ mol · m_2 · s'光照時間為8 12小時/天；(3)將獲得的無菌母本嵌合體幼苗于增殖培養(yǎng)基上以腋芽或叢生芽方式進行擴繁；(4)切取母本嵌合體的莖段或葉片組織接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行不定芽的誘導(dǎo)，使母本嵌合體莖尖細胞層結(jié)構(gòu)重新排布，進而產(chǎn)生不同于母本性狀的新類型嵌合芽；(5)待新類型的嵌合芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進行腋芽或叢生芽方式擴繁，并觀察其性狀的穩(wěn)定性；(6)篩選出穩(wěn)定的新嵌合體類型株系，并將其小植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；(7)將生根后的幼苗從培養(yǎng)基中取出，洗掉根部的培養(yǎng)基并將幼苗移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，經(jīng)煉苗后將幼苗移栽至田間，待植株成活后進一步觀察植株性狀的穩(wěn)定性，篩選獲得新類型的嵌合體品種。作為優(yōu)選，所述的通過莖尖細胞層重排進行種質(zhì)創(chuàng)新的植物材料為嵌合體，是周 緣嵌合體、扇形嵌合體或混合嵌合體類型。作為優(yōu)選，在所述步驟(2) (3) (4) (5)中，所述的初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)基都是以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加30g/L蔗糖、0. 7%瓊脂粉、0. r5mg/L細胞分裂素和 0. 05 0. 5mg/L 生長素，pH=5. 8。作為優(yōu)選，對紅網(wǎng)紋草進行莖尖細胞層重排所使用的初代培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+0. 2mg/L6-BA+0. 05mg/LNAA ;增殖培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+0. 5mg/L6-BA+0. lmg/LNAA ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +3. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA。作為優(yōu)選，對臥牛錦進行莖尖細胞層重排所使用的初代培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +4. 0mg/L6-BA+0. lmg/LIBA ;增殖培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +1. Omg/L6-BA+O. lmg/LNAA ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +0. 5mg/L6-BA+0. lmg/L NAA。作為優(yōu)選，在所述步驟(4)中，所述的母本嵌合體莖尖細胞層結(jié)構(gòu)的重排，是通過誘導(dǎo)其莖段或葉片等組織產(chǎn)生嵌合不定芽而實現(xiàn)的。作為優(yōu)選，在所述步驟(5) (6) (7)中，所述新類型嵌合體品種的獲得需經(jīng)過對瓶內(nèi)培養(yǎng)及田間種植的植株進行植物性狀觀察并從中選擇嵌合性狀能穩(wěn)定保持且能存活的嵌合體株系。作為優(yōu)選，在所述步驟(6)中，所述生根培養(yǎng)基的配方為l/2MS+3%蔗糖+0. 8%瓊脂 +0. 05^0. 5mg/L 生長素。作為優(yōu)選，在所述步驟(7)中，所述基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，蛭石和珍珠巖的體積比為 2: I。作為優(yōu)選，在步驟(7)中進行煉苗時，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗6 12天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境。本發(fā)明有益的效果是本發(fā)明采用莖尖細胞層的離體重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新，克服了傳統(tǒng)的育種方式的束縛；且不受季節(jié)氣候等環(huán)境因素的影響，可周年進行；育種周期短，獲得穩(wěn)定新類型嵌合體后可直接進行無性快繁后應(yīng)用。該方法可操作性強，簡單實用，育種效率高，可以廣泛應(yīng)用于嵌合體彩葉植物的新品種選育，對于彩葉觀賞植物種質(zhì)資源的利用和創(chuàng)新具有重要的意義。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例I :材料本實例以周緣嵌合體植物紅網(wǎng)紋草(Fittonia verschaffeltii)為材料。步驟(I):取材及消毒選取網(wǎng)紋草的莖段作為外植體材料，是為了保持母本嵌合體的觀賞特性。將外植體先用自來水沖洗，然后用75%的酒精消毒30秒，再用有效氯含量為1%的次氯酸鈉溶液浸泡7分鐘，其間搖動幾次以徹底消毒，最后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗4遍。步驟(2):接種將沖洗后的材料于滅菌濾紙上吸去水分后接種到初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，配方 為 MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +0. 2mg/L6-BA+0. 05mg/L NAA, pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2° C，40 u mo I IrT2S'光照時間為16小時/天。步驟(3):增殖將獲得的無菌母本網(wǎng)紋草轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基上以叢生芽方式進行擴繁，目的是保持母本性狀的前提下將群體擴大。增殖培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+0. 5mg/L6-BA+0. lmg/LNAA, pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2。C，40 y molnT2s'光照時間為 16 小時 /天。步驟(4):莖尖細胞層結(jié)構(gòu)的重排將母本網(wǎng)紋草的葉片和莖段分別切成0. 5cm左右見方的小塊和0. 2cm左右的小段后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行不定芽的誘導(dǎo)，使產(chǎn)生不同于母本網(wǎng)紋草莖尖細胞層排布結(jié)構(gòu)和性狀的新類型嵌合芽。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+3. Omg/L6-BA+0. 2mg/L NAA,pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2。C, 40 u mo I nT2s'光照時間為 16 小時 /天。步驟(5):嵌合芽的篩選將新類型的網(wǎng)紋草嵌合芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖，觀察各類型嵌合性狀的穩(wěn)定性，進而篩選出穩(wěn)定的新嵌合體類型株系4個。增殖培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0. 5mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA，pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2° C, 40 u mo I nT2s'光照時間為16小時/天。步驟(6):生根將篩選出的新類型網(wǎng)紋草嵌合體轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)基，配方為l/2MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+0. lmg/La-萘乙酸(NAA)。培養(yǎng)條件溫度為25±2 ° C，80 u Hi0InT2s-1光照下培養(yǎng)，光照時間為12小時/天。步驟(7):幼苗的移栽及新品種的獲得當(dāng)幼苗生根后將其從培養(yǎng)瓶中取出，輕輕沖洗掉根部的培養(yǎng)基，然后移栽至營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)缽中的基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，v/v=2:l)，為防止幼苗失水萎蔫，提高移栽成活率，可在幼苗上方覆蓋薄膜并適當(dāng)遮蔭以保持濕度，2天后開始逐漸揭開薄膜使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境。大約煉苗10天后移至田間，從而獲得I個能夠在田間條件下存活的網(wǎng)紋草嵌合體新品種。實施例2:
材料本實例以臥牛錦(Gasterieaarmstrongii f. variegata)為材料。步驟(I):取材及消毒選取同時具有黃色和綠色的臥牛錦花葶作為外植體材料，原因同實施例I。將花序上未開放的花蕾切下，先用自來水沖洗，然后用75%的酒精消毒45秒，再用有效氯含量為1%的次氯酸鈉溶液浸泡6分鐘，其間搖動幾次以徹底消毒，最后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗4遍。步驟(2):接種將沖洗后的材料于滅菌濾紙上吸去水分后接種到初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，配方為 MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +4. 0mg/L6-BA+0. lmg/LIBA (吲哚丁酸)，pH=5. 8。培養(yǎng)條件為25±2° C，暗培養(yǎng)。 步驟(3):增殖及莖尖細胞層結(jié)構(gòu)的重排待愈傷組織形成后將材料轉(zhuǎn)移到光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，隨后將轉(zhuǎn)綠分化的愈傷組織轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行不定芽的誘導(dǎo)，使產(chǎn)生不同莖尖細胞層排布結(jié)構(gòu)和性狀類型的臥牛錦嵌合芽，從而完成莖尖細胞層排布結(jié)構(gòu)的重排。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+3%鹿糖+0. 7% 瓊脂 +0. 5mg/L6-BA+0. lmg/LNAA, pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2。C，40 u mo I IrT2S-1,光照時間為16小時/天。步驟(4):嵌合芽的篩選將新類型的臥牛錦嵌合芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖，觀察各類型嵌合性狀的穩(wěn)定性，進而篩選出穩(wěn)定的新嵌合體類型株系。增殖培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/L NAA，pH=5. 8。培養(yǎng)條件為 25±2° C,40umol nT2s'光照時間為16小時/天。步驟(5):生根將篩選出的新類型臥牛錦嵌合體轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)基，配方為l/2MS+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+0. lmg/La-萘乙酸(NAA)。培養(yǎng)條件溫度為25±2° C，80 u Hi0InT2s-1光照下培養(yǎng)，光照時間為12小時/天。步驟(6):幼苗的移栽及新品種的獲得當(dāng)幼苗生根后將其從培養(yǎng)瓶中取出，輕輕沖洗掉根部的培養(yǎng)基，于陰涼通風(fēng)處放置3飛天后移栽至營養(yǎng)缽中(基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，v/v=2:l),從而獲得本發(fā)明的新類型的嵌合體臥牛錦植株，移栽成活率可達100%。最后需要說明的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)選取具有嵌合性狀的嵌合體植株材料的頂芽或帶有腋芽的莖段作為外植體，對外植體進行表面消毒處理后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗3飛遍； (2)將沖洗后的外植體于滅菌濾紙上吸去水分后接種到初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2° C、光照強度為O 80μηιο1 · πΓ2 · s'光照時間為8 12小時/天； (3)將獲得的無菌母本嵌合體幼苗于增殖培養(yǎng)基上以腋芽或叢生芽方式進行擴繁； (4)切取母本嵌合體的莖段或葉片組織接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行不定芽的誘導(dǎo)，使母本嵌合體莖尖細胞層結(jié)構(gòu)重新排布，進而產(chǎn)生不同于母本性狀的新類型嵌合芽； (5)待新類型的嵌合芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進行腋芽或叢生芽方式擴繁，并觀察其性狀的穩(wěn)定性； (6)篩選出穩(wěn)定的新嵌合體類型株系，并將其小植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng); (7)將生根后的幼苗從培養(yǎng)基中取出，洗掉根部的培養(yǎng)基并將幼苗移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，煉苗后將幼苗移栽至田間，待植株成活后進一步觀察植株性狀的穩(wěn)定性，篩選獲得新類型的嵌合體品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于所述的通過莖尖細胞層重排進行種質(zhì)創(chuàng)新的植物材料為嵌合體，是周緣嵌合體、扇形嵌合體或混合嵌合體類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在所述步驟(2) (3) (4) (5)中，所述的初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)基都是以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加30g/L蔗糖、O. 7%瓊脂粉、O. r5mg/L細胞分裂素和O. 05 O. 5mg/L 生長素，pH=5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于對紅網(wǎng)紋草進行莖尖細胞層重排所使用的初代培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖+0. 7% 瓊脂 +0. 2mg/L6-BA+0. 05mg/LNAA ;增殖培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +0. 5mg/L6-BA+0. lmg/LNAA ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +3. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于對臥牛錦進行莖尖細胞層重排所使用的初代培養(yǎng)基配方為MS+3%蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +4. 0mg/L6-BA+0. lmg/LIBA ;增殖培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +1. Omg/L6-BA+0. lmg/LNAA ;誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +0. 5mg/L6-BA+0. lmg/LNAA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在所述步驟(4)中，所述的母本嵌合體莖尖細胞層結(jié)構(gòu)的重排，是通過誘導(dǎo)其莖段或葉片等組織產(chǎn)生嵌合不定芽而實現(xiàn)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在所述步驟(5) (6) (7)中，所述新類型嵌合體品種的獲得需經(jīng)過對瓶內(nèi)培養(yǎng)及田間種植的植株進行植物性狀觀察并從中選擇嵌合性狀能穩(wěn)定保持且能存活的嵌合體株系。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在所述步驟(6)中，所述生根培養(yǎng)基的配方為l/2MS+3%蔗糖+0. 8%瓊脂+0. 05 O. 5mg/L 生長素。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在所述步驟(7)中，所述基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，蛭石和珍珠巖的體積比為2:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法，其特征在于在步驟(7)中進行煉苗時，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗6 12天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過莖尖細胞層重排對嵌合體彩葉植物進行種質(zhì)創(chuàng)新的方法。本發(fā)明選取具有嵌合性狀的母本嵌合體植物的頂芽或腋芽為外植體，對其進行表面消毒和沖洗后接種于初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，建立母本嵌合體的腋芽或叢生芽快繁體系。然后利用母本嵌合體的莖段或葉片等組織進行不定芽的誘導(dǎo)，使產(chǎn)生不同于母本嵌合體莖尖細胞層排布結(jié)構(gòu)和性狀的新類型嵌合芽。篩選性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的新型嵌合體株系進行生根誘導(dǎo)及煉苗，成活后移至田間再次進行篩選，從而獲得彩葉嵌合體新品種。本發(fā)明有益的效果本發(fā)明方法可操作性強，簡單實用，育種周期短，可以廣泛應(yīng)用于嵌合體彩葉植物的新品種選育。
文檔編號A01H4/00GK102812903SQ201210237049
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者王燕, 徐剛, 陳劍平, 汪一婷, 呂永平, 牟豪杰, 陳志 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院