丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其部位的制備和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WSE），它是收集發(fā)酵培養(yǎng)9-14天的丹參內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，110-130℃滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液。本發(fā)明還公開(kāi)了丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了SWE、PPF和PSF在促進(jìn)宿主丹參的組織培養(yǎng)物丹參毛狀根生長(zhǎng)，提高丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分含量的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其部位的制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種丹參內(nèi)生真菌菌絲的水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位，此外，本發(fā)明還涉及該丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位的用途，用于促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)和提高丹參酮類(lèi)成分含量。
【背景技術(shù)】
[0002]丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)是唇形科鼠尾草屬植物,其干燥根及根莖同名入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國(guó)常用傳統(tǒng)中藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效。臨床廣泛用于心腦血管疾患，是國(guó)內(nèi)外現(xiàn)代化中藥研究的熱點(diǎn)品種之一。現(xiàn)代研究表明，丹參的化學(xué)成分主要分為兩大類(lèi):一是以丹參素為基本結(jié)構(gòu)的水溶性成分——酹酸類(lèi)化合物，包括原兒茶醛、丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；二是脂溶性成份一二萜類(lèi)化合物，包括丹參酮1、丹參酮II A、II B、隱丹參酮1、二氫丹參酮I等。臨床研究證實(shí)，丹參含有的多種化學(xué)成分具有廣泛的生物活性，其傳統(tǒng)藥理以擴(kuò)血管，活血化瘀，改善微循環(huán)為主。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參尚具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纖維化，促進(jìn)組織修復(fù)和再生等多種藥理活性。丹參的市場(chǎng)需求大，而野生資源日益減少，栽培品種退化嚴(yán)重。人工引種栽培存在引種困難和栽培環(huán)境制約等客觀因素的影響，活性次生代謝成分的含量不穩(wěn)定，藥材質(zhì)量得不到保證。
[0003]利用生物技術(shù)手段獲得丹參有效化學(xué)成分相繼成為研究熱點(diǎn)，丹參毛狀根培養(yǎng)技術(shù)就是其中之一。它利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主受傷部位細(xì)胞并產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化不定根， 又稱(chēng)毛狀根。與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，毛狀根具有生長(zhǎng)迅速、遺傳性狀穩(wěn)定及激素自養(yǎng)型等特點(diǎn)。目前丹參毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已相當(dāng)成熟，但有效成分含量較低大大制約了毛狀根的應(yīng)用。采用生物與非生物誘導(dǎo)子進(jìn)行刺激，能夠有效地促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)和提高丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，希望利用植物內(nèi)生真菌資源，采用生物與非生物誘導(dǎo)子進(jìn)行刺激，能夠有效地促進(jìn)丹參毛狀根的生長(zhǎng)和提高丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量，并提供一種丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)、丹參內(nèi)生真菌菌絲多糖蛋白部位(PPF)和丹參內(nèi)生真菌菌絲多糖部位(PSF)，進(jìn)而提供丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)、丹參內(nèi)生真菌菌絲多糖蛋白部位(PPF)、丹參內(nèi)生真菌菌絲多糖部位(PSF)在丹參毛狀根中提高丹參酮類(lèi)成分含量的應(yīng)用，為新型誘導(dǎo)子的開(kāi)發(fā)和探討內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關(guān)系提供依據(jù)。
[0005]本發(fā)明涉及的丹參內(nèi)生真菌和中國(guó)專(zhuān)利CN102676392A公開(kāi)的丹參內(nèi)生真菌相同，它的命名為深綠木霉Trichoderma atroviride,菌株代號(hào)為D16,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏登記號(hào)為CGMCC N0.4712。[0006]1.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)的制備。
[0007]收集發(fā)酵培養(yǎng)9-14天的丹參內(nèi)生真菌菌絲體，加入適量蒸餾水重懸，高壓鍋110-130°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為丹參內(nèi)生真菌水溶性提取物。采用硫酸-苯酚法測(cè)定總糖濃度。
[0008]2.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制備。
[0009]減壓濃縮丹參內(nèi)生真菌水溶性提取物WSE至適當(dāng)體積，加入4-7倍體積70-95%的乙醇2-8°C靜置24-72小時(shí)，以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，無(wú)水乙醇洗3-5次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位PPF。
[0010]3.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)的制備。
[0011]將丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位PPF重新溶于適量蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍體積的70-95%的乙醇2_8 °C靜置24-72小時(shí)，以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，無(wú)水乙醇洗3_5次后收集沉淀。將沉淀用適量蒸餾水溶解，室溫在蒸餾水中透析24-72h (截留分子量為1000-10000Da)，然后以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位PSF。
[0012]4.丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)特征。
[0013]培養(yǎng)基:1/2B5培養(yǎng)基(NaH2PO4.H2O:75mg/L, CaCl2:56.62mg/L, KNO3:1250mg/L,(NH4)2SO4:67mg/L, MgSO4:61.05mg/L，乙二胺四乙酸二鈉:18.65mg/L，F(xiàn)eSO4.7H20:13.9mg/L, MnSO4.2H20:5.0mg/L, ZnSO4.7H20:1.0mg/L,硼酸:1.5mg/L, Na2MoSO4:0.125mg/L,CuSO4.5H20:0.0125mg/L, CoCl2.5H20:0.0125mg/L, K1:0.375mg/L,維生素 B1:5.0mg/L,維生素 B5:0.5mg/L，煙酸:0.5mg/L，肌醇:50mg/L，蔗糖:20000mg/L, PH (25。。):5.5)，121。。滅菌15分鐘后自然冷卻待用。
[0014]培養(yǎng)溫度:25±2°C。
[0015]培養(yǎng)時(shí)間:20-50天不等。
[0016]搖床轉(zhuǎn)速:180rpm。
[0017]培養(yǎng)特征:丹參毛狀根聚成團(tuán)向四周生長(zhǎng)。
[0018]5.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和丹參酮生物合成的影響。
[0019]在丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為30_400mg/L的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物WSE，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30天，毛狀根生物量提高了 30%-80%，二氫丹參酮I的含量提高了 15-40倍，丹參酮I的含量提高了 1-3倍，隱丹參酮的含量提高了 50-90倍，丹參酮II A的含量提高了 2-5倍，總丹參酮的含量(即二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A含量之和)提高了 10-25倍。丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物菌絲WSE能夠有效地提高丹參毛狀根的生物量，促進(jìn)丹參酮類(lèi)成分的生物合成。
[0020]6.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和丹參酮生物合成的影響。
[0021]在丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加濃度為30_400mg/L丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)或丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30天，毛狀根干重都提高了 10%-70%，二氫丹參酮I的含量都提高了 10-40倍，丹參酮I的含量都提高了 1-8倍，隱丹參酮的含量都提高了 20-50倍，丹參酮II A的含量都提高了 5-15倍，總丹參酮的含量(即二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A含量之和)都提高了 10-25倍。PPF和PSF均能夠有效地提高丹參毛狀根的生物量，促進(jìn)丹參酮類(lèi)成分的生物合成。
[0022]本發(fā)明首次從丹參內(nèi)生真菌菌絲中制備了水溶性提取物(WSE)、多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)，發(fā)現(xiàn)WSE、PPF和PSF均能有效促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)，同時(shí)顯著性地提高毛狀根中丹參酮類(lèi)成分的含量，從而有效提高了丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分的產(chǎn)量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是丹參內(nèi)生真菌在1/2B5平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖。
[0024]圖2是丹參內(nèi)生真菌在1/2B5液體培養(yǎng)基中的形態(tài)圖。
[0025]圖3是丹參毛狀根液體懸浮培養(yǎng)形態(tài)圖。
[0026]圖4是丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位作用丹參毛狀根12天的形態(tài)圖(A為對(duì)照，B為菌絲水溶性提取物處理，C為多糖蛋白部位處理，D為多糖部位處理)。
【具體實(shí)施方式】 [0027]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。
[0028]實(shí)施例1:內(nèi)生深綠木霉菌D16的發(fā)酵
[0029]將丹參內(nèi)生真菌D16接種至1/2B5固體培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)3_5天(見(jiàn)圖1);然后采用打孔器打孔的方式將固體培養(yǎng)基上的D16菌絲接種至250ml三角瓶(內(nèi)含100ml 1/2B5培養(yǎng)液)中，26°C、180rpm培養(yǎng)3_5天即得培養(yǎng)種子液(見(jiàn)圖2);最后將培養(yǎng)種子液接種至5L三角瓶(內(nèi)含4L 1/2B5培養(yǎng)液)中，26°C、160rpm培養(yǎng)10天。
[0030]實(shí)施例2:丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)的制備
[0031]通過(guò)減壓抽濾收集培養(yǎng)10天的D16菌絲體，并用蒸餾水洗滌3次；然后加入適量蒸餾水將D16菌絲體重懸，121°C高溫高壓處理40分鐘。待自然冷卻，減壓抽濾所得濾液適當(dāng)濃縮即為內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲WSE。
[0032]采用硫酸-苯酚法測(cè)定內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲WSE中總糖濃度。以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程:y=0.0136Χ - 0.0151，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，葡萄糖濃度范圍10_50ug/ml。[0033]實(shí)施例3:丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制備
[0034]減壓濃縮內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲WSE溶液(30L)至適當(dāng)體積，加入5倍體積95%的乙醇4°C靜置48小時(shí)，以5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘得白色沉淀，無(wú)水乙醇洗3次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲PPF。
[0035]實(shí)施例4:丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)的制備[0036]將內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲PPF重新溶于適量蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入5倍體積的95%的乙醇4°C靜置48小時(shí)，以5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘得白色沉淀，無(wú)水乙醇洗3次后收集沉淀。將沉淀用適量蒸餾水溶解，室溫在蒸餾水中透析48小時(shí)(截留分子量為2000Da)，然后通過(guò)5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為內(nèi)生深綠木霉菌D16菌絲PSF。
[0037]實(shí)施例5:丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)特征
[0038]本發(fā)明采用的是搖床培養(yǎng)，250ml體積的三角瓶中盛1/2B5培養(yǎng)液100ml，將預(yù)先液體培養(yǎng)好的丹參毛狀根接種至已滅菌的培養(yǎng)基中，每瓶接種lg，在25°C、180rpm下暗培養(yǎng)20天-50天不等，每周更換一次培養(yǎng)液(見(jiàn)圖3)。丹參毛狀根收獲時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，蒸餾水洗3次后濾紙吸干殘留水分。50°C烘干至恒重后，按實(shí)施例6中描述方法測(cè)定丹參酮類(lèi)成分的含量。
[0039]實(shí)施例6:丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分含量的測(cè)定
[0040]采用高效液相色譜法(HPLC)分析丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分的含量，主要定量檢測(cè)二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A的含量。具體步驟如下:
[0041]丹參毛狀根HPLC進(jìn)樣樣品的制備:精密稱(chēng)量烘干至恒重的毛狀根，記錄干重后研成粉末。精密稱(chēng)取毛狀根粉末0.15g，加入5ml甲醇超聲提取3次，每次40分鐘。所得提取溶液過(guò)0.45um微孔濾膜即得HPLC進(jìn)樣樣品溶液。
[0042]HPLC色譜分析條件:色譜柱:Z0RBAX-C18反相柱(4.6X 250mmX 5 μ m);流動(dòng)相:Η20(+0.5%HC00H)-HCN，梯度洗脫:[time(min): D(HCN)] = [0.0: 20% ]-[20.0: 40%]-[21.0: 80%]-[40.0: 90%]-[45.0: 20%];柱溫:30°C;流速:0.8ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
[0043]標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 :(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取二氫丹參酮I 2mg溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為2.5、5、10、20、40ng/ml的二氫丹參酮I標(biāo)準(zhǔn)品HPLC進(jìn)樣溶液。(2)準(zhǔn)確稱(chēng)取丹參酮I Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為2、4、6、8、10ng/ml的丹參酮I標(biāo)準(zhǔn)品HPLC進(jìn)樣溶液。(3)準(zhǔn)確稱(chēng)取隱丹參酮Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為1、5、25、50、100ng/ml的隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC進(jìn)樣溶液。(4)準(zhǔn)確稱(chēng)取丹參酮II A Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為0.5、1.0,2.0,4.0,8.0ng/ml的丹參酮II A標(biāo)準(zhǔn)品HPLC進(jìn)樣溶液。將所有標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣分析。以HPLC的峰面積為Y，以進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(mg/ml)為X，獲得4種丹參酮線性回歸方程(見(jiàn)表1)。
[0044]丹參毛狀根樣品中丹參酮的含量測(cè)定:取上述制備的樣品溶液20ul進(jìn)樣，按上述H PLC色譜條件進(jìn)行丹參酮類(lèi)成分的分析，根據(jù)回歸方程進(jìn)行定量計(jì)算。
[0045]表1四種丹參酮的線性回歸方程
【權(quán)利要求】
1.一種丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物，其特征是，它是收集發(fā)酵培養(yǎng)9-14天的丹參內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，110-130°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液。
2.一種丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位，其特征是，減壓濃縮權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物，加入4-7倍體積量體積濃度為70-95%的乙醇，在2-8°C靜置24-72小時(shí)，以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，用無(wú)水乙醇洗脫3-5次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內(nèi)生真菌菌絲多糖水溶性提取物蛋白部位。
3.一種丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位，其特征是，將權(quán)利要求2所述的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位溶于蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍體積量體積濃度為70-95%的乙醇，在2-8°C靜置24-72小時(shí)，以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，用無(wú)水乙醇洗脫3-5次后收集沉淀；將沉淀用蒸餾水溶解，室溫下在蒸餾水中透析24-72h，截留分子量為1000-10000Da，以2000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位。
4.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物用于促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30天。
6.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位用于促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30 天。
8.丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位用于促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類(lèi)成分含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30 天。
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK103798293SQ201210441649
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月7日
【發(fā)明者】明乾良, 秦路平, 韓婷, 張巧艷, 鄭承劍, 張宏, 賈敏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)