專利名稱：棉花再生植株的栽培方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種棉花再生植株的栽培方法。
背景技術：
棉花是紡織工業(yè)、精細化工的重要原料，也是重要的戰(zhàn)略物資。轉(zhuǎn)基因棉花是最早實現(xiàn)商業(yè)化種植的作物之一。2011年，轉(zhuǎn)基因棉花在全球的種植面積達到2470萬公頃，占棉花總面積3000萬公頃的80%以上。
利用生物技術將優(yōu)良性狀基因轉(zhuǎn)入棉花中，可打破物種界限，擴大基因資源。
目前，通過生物技術培育轉(zhuǎn)基因棉花新品種常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導法、微彈轟擊法和花粉管通道法等。
農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法是借助于天然農(nóng)桿菌對植物傷口感染產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根的能力改進而成的一種生物學技術。棉花的遺傳轉(zhuǎn)化大都采用改進后的根癌農(nóng)桿菌(含有Ti質(zhì)粒)，但不同菌株對不同棉花品種的親和力也不一樣，直接影響轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化所適用的外植體非常廣泛，包括葉片、莖段、胚軸、葉柄、子葉、幼胚、愈傷組織或成熟種子，但在棉花上最常用的為下胚軸。
微彈轟擊法又叫基因槍轉(zhuǎn)化法，利用動力將包裹DNA的微粒加速后直接射入受體細胞中，使得外源DNA能與細胞遺傳物質(zhì)相接觸，進而整合到基因組中。微彈轟擊時常用的受體是莖尖分生組織、胚性愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞。
花粉管通道法最早是20世紀80年代初周光宇提出的。最初主要是通過注射將構建的重組基因或質(zhì)粒注入子房中。后來進一步發(fā)展成柱頭涂抹法和花粉攜帶法。
這些棉花轉(zhuǎn)化方法都獲得了成功。但是其中應用最為廣泛的仍是農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)發(fā)方法，獲得了多個生產(chǎn)中應用的轉(zhuǎn)化事件。它具有以下特點轉(zhuǎn)化機理較為清楚，轉(zhuǎn)化的外源DNA片段可長達50kb，外源基因以單拷貝或低拷貝形式整合到染色體上，遺傳穩(wěn)定性好。但應用該方法需要先建立完整的組織培養(yǎng)和植株再生體系，目前還只在珂字棉的部分品種上建立起來，并且耗時長，轉(zhuǎn)化效率較低。
提聞再生的抗性植株的移栽效率將有助于提聞棉花的遺傳轉(zhuǎn)化效率。目如主要是通過直接生根后煉苗移栽的方法，或者通過嫁接的方法進行移栽。嫁接的方法技術性強，對操作者的要求比較高。而通過直接生根后煉苗來移栽，容易造成大量抗性苗移栽不成功，因為在長時間的組織培養(yǎng)、抗性篩選和分化過程中，許多再生植株變得生長能力弱，根系不發(fā)達，甚至玻璃化。因此建立一種簡便可行的提高移栽效率的方法十分必要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種栽培目的棉花植株的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟
I)先去除目的棉花植株的莖尖、枝葉和須根，保留1-2根白色的須根或保留須根基部，得到主干；再沿所述主干靠近根部的第一個節(jié)處斷開，保留帶有根部的主干第一節(jié)，得到待繼代培養(yǎng)的植株；
2)將所述待繼代培養(yǎng)的植株在再生植株繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到再次繼代培養(yǎng)后再生植株；
3)將所述再次繼代培養(yǎng)后再生植株經(jīng)過煉苗、移栽，得到移栽后棉花植株；
所述目的棉花植株為經(jīng)過組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株。
上述方法中，步驟2)中，所述繼代培養(yǎng)為繼代培養(yǎng)1-2次。
上述方法中，步驟2)中，所述再生植株繼代培養(yǎng)基為含有終濃度為O. lmg/1 NAA 的MSB固體培養(yǎng)基。
MSB固體培養(yǎng)基配方如實施例中所示。
上述方法中，步驟2)中，所述培養(yǎng)條件為溫度33°C光培養(yǎng)16小時、溫度25°C暗培養(yǎng)8小時；上述光培養(yǎng)的光照強度具體為2000LUX。
上述方法中，所述移栽包括如下步驟
I)將經(jīng)過煉苗的植株移入裝有土壤的容器中，再套袋或者覆蓋保鮮膜保濕一周；
2)將經(jīng)過I)處理的植株去除袋或者保鮮膜，培養(yǎng)，得到移栽后棉花植株。
上述方法中，所述土壤為育苗基質(zhì)(潤坤牌，大森林花卉市場購買)與1/2體積蛭石混合而成。
上述方法中，所述經(jīng)過組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株為通過農(nóng)桿菌介導的組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株或者通過微彈轟擊法介導的組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株。
上述通過農(nóng)桿菌介導的組織培養(yǎng)的方法得到的再生棉花植株按照實施例I的一進行；
上述通過微彈轟擊法介導的組織培養(yǎng)得到的再生棉花植株按照實施例2的一進行。
本發(fā)明的實驗證明，采用本發(fā)明的方法移栽棉花再生植株，可大大提高棉花再生植株的移栽成活率。本發(fā)明操作簡單，實用性強，有助于提高棉花的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中MSB培養(yǎng)基中的組分如表I所示，液體MSB培養(yǎng)基為將表I的溶質(zhì)按所示的終濃度均溶于水，并添加葡萄糖至終濃度30克/I配制得到。固體MSB培養(yǎng)基是在液體MSB培養(yǎng)基中添加固化劑phytagel至終濃度2. 5g/l。
權利要求
1.一種栽培目的棉花植株的方法，包括如下步驟 1)先去除目的棉花植株的莖尖、枝葉和須根，保留1-2根白色的須根或保留須根基部，得到主干；再沿所述主干靠近根部的第一個節(jié)處斷開，保留帶有根部的主干第一節(jié)，得到待繼代培養(yǎng)的植株； 2)將所述待繼代培養(yǎng)的植株在再生植株繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，得到再次繼代培養(yǎng)后再生植株； 3)將所述再次繼代培養(yǎng)后再生植株經(jīng)過煉苗、移栽，得到移栽后棉花植株； 所述目的棉花植株為經(jīng)過組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于 步驟2)中，所述繼代培養(yǎng)為繼代培養(yǎng)1-2次。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟2)中，所述再生植株繼代培養(yǎng)基為含有終濃度為O. lmg/1 NAA的MSB固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步驟2)中，所述培養(yǎng)條件為溫度33°C光培養(yǎng)16小時、溫度25°C暗培養(yǎng)8小時。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述移栽包括如下步驟 1)將經(jīng)過煉苗的植株移入裝有土壤的容器中，再套袋或者覆蓋保鮮膜保濕一周； 2)將經(jīng)過I)處理的植株去除袋或者保鮮膜，培養(yǎng)，得到移栽后棉花植株。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于 所述土壤為育苗基質(zhì)與1/2體積蛭石混合的土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉花再生植株的栽培方法。本發(fā)明提供的一種栽培目的棉花植株的方法，包括如下步驟1)先去除目的棉花植株的莖尖、枝葉和須根，保留1-2根白色的須根或保留須根基部，得到主干；再沿所述主干靠近根部的第一個節(jié)處斷開，保留帶有根部的主干第一節(jié)，得到待繼代培養(yǎng)的植株；2)將待繼代培養(yǎng)的植株在再生植株繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到再次繼代培養(yǎng)后再生植株；3)將再次繼代培養(yǎng)后再生植株經(jīng)過煉苗、移栽，移栽后棉花植株；所述目的棉花植株為經(jīng)過組織培養(yǎng)后得到的再生棉花植株。實驗證明，采用本發(fā)明的方法栽培棉花再生植株的，可大大提高棉花再生植株的移栽成活率。本發(fā)明操作簡單，實用性強，有助于提高棉花的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號A01H4/00GK102972297SQ20121051852
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者王志興, 唐巧玲, 王旭靜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所