專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛又稱(chēng)黑節(jié)草，屬蘭科附生蘭類(lèi)，為多年生草本植物。鐵皮石斛是石斛中的極品，因其表皮呈鐵綠色而得名，是著名的觀賞兼藥用蘭花；現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)鐵皮石斛的培養(yǎng)階段中，大多對(duì)外植體原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖、分化、生根培養(yǎng)，得到小苗，但是對(duì)后期的試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的研究比較少；鐵皮石斛對(duì)生境條件要求苛刻，難開(kāi)花，在栽培條件下，從種子萌發(fā)到開(kāi)花通常需要3 4年；因此，對(duì)鐵皮石斛開(kāi)花的誘導(dǎo)對(duì)提高植物開(kāi)花機(jī)理研究具有非常重要的意義；而現(xiàn)有的應(yīng)用植物生物技術(shù)對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行誘導(dǎo)開(kāi)花時(shí)，雖可獲得一定的開(kāi)花誘導(dǎo)率，但是誘導(dǎo)率低，成本高，花朵小，且常出現(xiàn)不完整的花朵。并且，鐵皮石斛花屬蟲(chóng)媒花，自然條件下授粉率低，一般均為人工授粉，現(xiàn)有的授粉方法一般是:在晴天選擇直徑為0.8^1.2cm的健壯植株且具正常結(jié)構(gòu)的優(yōu)良花朵，拔出唇瓣用牙簽或者大頭針挑去花藥放入雌蕊腔，將授粉后花朵套袋。但是上述方法存在以下缺陷:受自然環(huán)境因素影響大，授粉成功率低；授粉后植株沒(méi)有得到單獨(dú)特殊的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)元素不充足，直接影響果實(shí)發(fā)育，造成果夾小，結(jié)實(shí)率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，誘導(dǎo)鐵皮石斛開(kāi)花及結(jié)實(shí)，從而提高鐵皮石斛開(kāi)花及結(jié)實(shí)率。為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:提供一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)
選取健壯的生長(zhǎng)良好的鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體，將外植體消毒后，接種于下列無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:MS+BA1.5 2.0mg/L+NAA0.2 0.6mg/L+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5 8g/L+ 土豆汁60 70ml/L+活性炭粉0.3 0.7g/L，在溫度為23 25°C、光照強(qiáng)度為1500 25001x、光照時(shí)間為9 11小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)45 60天，形成原球莖；
(2)原球莖增殖培養(yǎng)
將生長(zhǎng)良好的原球莖轉(zhuǎn)接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5 8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.1 0.8mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 紅薯汁 30 80ml/L+活性炭粉0.2 0.9g/L，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度25 27°C，光照強(qiáng)度1800 30001x，光照時(shí)間10 12小時(shí)/天，培養(yǎng)周期45 60天；
(3)原球莖生根培養(yǎng)
將原球莖轉(zhuǎn)入下列生根培養(yǎng)基中:MS+白糖20 50g/L+瓊脂粉5.5 IOg/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 紅薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉0.5 1.0g/L,在溫度為23 27°C、濕度為40 60%、光照強(qiáng)度為2000 30001x、光照時(shí)間為11 13小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)70 100天，得到生根苗；
(4)生根苗誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)
將生根苗接種于下列誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基中:MS+白糖30 60g/L+瓊脂粉5.5 llg/L+土 汁 30 50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.1 0.9mg/L+PPP3330.3 0.8mg/L+Spml.0
6.0mmol/L+ZTl.5 6mg/L，進(jìn)行誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度22 25°C，濕度30 50%，光照強(qiáng)度2300 26001x，光照時(shí)間11 13小時(shí)/天，培養(yǎng)周期60 85天；
(5)授粉過(guò)程及結(jié)實(shí)培養(yǎng)
在經(jīng)誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基培養(yǎng)后的植株中，選取具有完整花結(jié)構(gòu)的健壯植株，在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行人工授粉，再將授粉后的植株轉(zhuǎn)接到下列授粉后培養(yǎng)基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 瓊脂粉 5.5 10g/L+NAA0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 紅薯汁 30 50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在溫度為22 25°C，濕度為40 60%，光照強(qiáng)度為2500 32001x,光照時(shí)間為12 14小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)65 110天，得到鐵皮石斛蒴果；其中，改良MS培養(yǎng)基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量為MS培養(yǎng)基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余組分含量不變。每升MS培養(yǎng)基中含有的組分及各組分的重量如下:NH4N03 165mg, KNO3 1900mg、CaCl2.2Η20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg、KH2PO4 170mg、KI 0.83mg、H3BO3 6.2mg、MnSO4.H2O16.9mg、ZnSO4.7H20 8.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20
0.025mg、FeSO4.7Η20 27.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、煙酸 0.5 mg、鹽酸吡口多醇0.5 mg、鹽酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。所述鐵皮石斛為廣南紅桿軟腳鐵皮石斛；所選取的鐵皮石斛莖段的莖節(jié)間長(zhǎng)為
1.5^3cm ;所選取的鐵皮石斛蒴果的長(zhǎng)為1.0^2.5cm、寬為0.8 2cm。所述外植體為鐵皮石斛莖段，對(duì)該鐵皮石斛莖段進(jìn)行消毒的過(guò)程為:將選取好的鐵皮石斛莖段流水沖洗lOmin，用手術(shù)刀從鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無(wú)菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無(wú)菌水沖洗:Γ5次。所述外植體為鐵皮石斛蒴果，對(duì)該鐵皮石斛蒴果進(jìn)行消毒的過(guò)程為:將選取好的蒴果流水沖洗8min，用84消毒液擦拭果夾，放于無(wú)菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無(wú)菌水沖洗3飛次；將消毒后的蒴果切開(kāi)，取種子作為外植體備用。授粉時(shí)，選取高5cm以上、莖直徑為0.Γ0.8cm、具有至少八片葉子展開(kāi)且具有完整花結(jié)構(gòu)的健壯植株作為授粉體。本發(fā)明的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，可以準(zhǔn)確有效地調(diào)控鐵皮石斛試管開(kāi)花率；在鐵皮石斛花芽形成的關(guān)鍵階段，通過(guò)光照、溫度、濕度及PPP333、Spm、土豆汁和ZT的共同協(xié)同調(diào)節(jié)作用，顯著激活鐵皮石斛試管苗開(kāi)花的關(guān)鍵因子，從而提高鐵皮石斛成花率；并且，本發(fā)明采用在無(wú)菌環(huán)境中授粉及授粉后采用專(zhuān)用培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)實(shí)培養(yǎng)，從而為鐵皮石斛提供豐富的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，提高其結(jié)實(shí)率；本發(fā)明的方法可誘導(dǎo)植株健壯生長(zhǎng)，果夾直徑可達(dá)0.8 lcm，授粉結(jié)實(shí)率高達(dá)90%。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。實(shí)施例1
在5月份，選擇廣南紅桿軟腳鐵皮石斛，從該鐵皮石斛中選取生長(zhǎng)良好無(wú)明顯病蟲(chóng)害的莖節(jié)間長(zhǎng)為1.5cm的鐵皮石斛莖段作為外植體，剪掉葉子在自來(lái)水下沖洗lOmin，取出放于超凈工作臺(tái)上的滅菌盤(pán)中；將槍形鑷、手術(shù)刀放置于接種器械滅菌器中加熱至300°C滅菌；用手術(shù)刀從該鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無(wú)菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，倒出乙醇，再用手術(shù)刀切掉葉柄和葉鞘等多余組織，用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無(wú)菌水沖洗3飛次；該消毒后的外植體接種于下列無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:MS+BAL 5mg/L +NAA0.2 mg/L+ 白糖 30g/L+ 瓊脂粉 5.5g/L+ 土豆汁 60 ml/L+ 活性炭粉0.3g/L，在溫度為25°C、光照強(qiáng)度為20001x、光照時(shí)間為10小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)50天，形成原球莖；
原球莖增殖培養(yǎng)
將生長(zhǎng)良好的原球莖轉(zhuǎn)接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+土豆汁 30 ml/L+紅薯汁 30 ml/L+活性炭粉 0.2 g/L，在溫度為25°C，光照強(qiáng)度為25001x、光照為小時(shí)11/天，培養(yǎng)周期為55天的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
原球莖生根培養(yǎng)
將原球莖轉(zhuǎn)入下列生根培養(yǎng)基中:MS+白糖20g/L+瓊脂粉5.5g/L+NAA 0.4mg/L+IAA0.2mg/L+ 土豆汁20ml/L+紅薯汁60ml/L+活性炭粉0.5g/L，采用28瓦日光色燈管作為光源，光照強(qiáng)度為30001x，在溫度為24°C、濕度為40%、光照時(shí)間為12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)90天，得到生根苗；
生根苗誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)
將生根苗接種于下列誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基中:MS+白糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L+土豆汁30g/L+BA 0.2mg/L+NAA 0.lmg/L+PPP333 0.3mg/L+Spml.0mmoI/L+ ZT 1.5mg/L，采用 28 瓦日光色燈管作為光源，光照強(qiáng)度為25001x，在溫度為25°C，濕度為50%，光照時(shí)間12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)60天，進(jìn)行誘導(dǎo)開(kāi)花；其中，表I為采用誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基進(jìn)行開(kāi)花培養(yǎng)與采用生根培養(yǎng)基進(jìn)行開(kāi)花培養(yǎng)的植株生長(zhǎng)狀態(tài)的對(duì)照:
表I
權(quán)利要求
1.一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng) 選取健壯的生長(zhǎng)良好的鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體，將外植體消毒后，接種于下列無(wú)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:MS+BA1.5 2.0mg/L +NAA0.2 0.6 mg/L+白糖30 50g/L+瓊脂粉5.5^8g/L+ 土豆汁6(T70 ml/L+活性炭粉0.3^0.7g/L，在溫度為23 25°C、光照強(qiáng)度為150(Γ25001χ、光照時(shí)間為9 11小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)45 60天，形成原球莖； (2)原球莖增殖培養(yǎng) 將生長(zhǎng)良好的原球莖轉(zhuǎn)接入下列增殖培養(yǎng)基中:MS+白糖3(T50g/L+瓊脂粉5.5^8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.Γθ.8mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 紅薯汁 3(T80ml/L+ 活性炭粉0.2^0.9g/L，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度25 27°C，光照強(qiáng)度180(Γ30001χ，光照時(shí)間1(Γ12小時(shí)/天，培養(yǎng)周期45 60天； (3)原球莖生根培養(yǎng) 將原球莖轉(zhuǎn)入下列生根 培養(yǎng)基中:MS+白糖2(T50g/L+瓊脂粉5.5 10g/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA 0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 紅薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉 0.5 1.0g/L，在溫度為23 27°C、濕度為40 60%、光照強(qiáng)度為200(Γ30001χ、光照時(shí)間為11 13小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)7(Γ100天，得到生根苗； (4)生根苗誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng) 將生根苗接種于下列誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基中:MS+白糖3(T60g/L+瓊脂粉5.5 llg/L+ 土豆汁 3(T50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.Γθ.9mg/L+PPP333 0.3 0.8mg/L+Spml.0 6.0mmoI/L+ZT1.5 6mg/L，進(jìn)行誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境條件為:溫度22 25°C，濕度30 50%，光照強(qiáng)度230(Γ26001χ，光照時(shí)間11 13小時(shí)/天，培養(yǎng)周期60 85天； (5)授粉過(guò)程及結(jié)實(shí)培養(yǎng) 在經(jīng)誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)基培養(yǎng)后的植株中，選取具有完整花結(jié)構(gòu)的健壯植株，在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行人工授粉，再將授粉后的植株轉(zhuǎn)接到下列授粉后培養(yǎng)基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 瓊脂粉 5.5 10g/L+NAA 0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 紅薯汁 3(T50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在溫度為22 25°C，濕度為40 60%，光照強(qiáng)度為250(Γ32001χ，光照時(shí)間為12 14小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)65 110天，得到鐵皮石斛蒴果；其中，改良MS培養(yǎng)基中ΚΝ03、KH2PO4和H3BO3用量為MS培養(yǎng)基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余組分含量不變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于:每升MS培養(yǎng)基中含有的組分及各組分的重量如下=NH4NO3 165mg、KNO3 1900mg、CaCl2.2H20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg, KH2PO4 170mg、KI 0.83mg, H3BO3 6.2mg、MnS04.H2O 16.9mg、ZnSO4.7H208.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20 0.025mg、FeSO4.7H2027.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、煙酸 0.5 mg、鹽酸吡哆醇 0.5 mg、鹽酸硫胺素0.I mg、甘氨酸2 mg ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于，所述鐵皮石斛為廣南紅桿軟腳鐵皮石斛；所選取的鐵皮石斛莖段的莖節(jié)間長(zhǎng)為1.5^3cm ;所選取的鐵皮石斛蒴果的長(zhǎng)為1.0^2.5cm、寬為0.8 2cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于，所述外植體為鐵皮石斛莖段，對(duì)該鐵皮石斛莖段進(jìn)行消毒的過(guò)程為:將選取好的鐵皮石斛莖段流水沖洗lOmin，用手術(shù)刀從鐵皮石斛莖段的節(jié)間切割，得到帶有葉芽的莖段，并將該莖段置于無(wú)菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒Imin,再用0.1%的升萊浸泡6min,然后用無(wú)菌水沖洗3 5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于，所述外植體為鐵皮石斛蒴果，對(duì)該鐵皮石斛蒴果進(jìn)行消毒的過(guò)程為:將選取好的蒴果流水沖洗8min，用84消毒液擦拭果夾,放于無(wú)菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用無(wú)菌水沖洗3飛次；將消毒后的蒴果切開(kāi)，取種子作為外植體備用。
6.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，其特征在于:授粉時(shí)，選取高5cm以上、莖直徑為0.4^0.8cm、具有至少八片葉子展開(kāi)且具有完整花結(jié)構(gòu)的健壯植株作為授粉體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鐵皮石斛試管開(kāi)花及結(jié)實(shí)的方法，該方法包括以下步驟采用鐵皮石斛莖段或蒴果作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，再經(jīng)原球莖增殖培養(yǎng)、原球莖生根培養(yǎng)、生根苗誘導(dǎo)開(kāi)花培養(yǎng)及授粉過(guò)程及結(jié)實(shí)培養(yǎng)后，形成試管花及試管果實(shí)；該方法可以準(zhǔn)確有效地調(diào)控鐵皮石斛試管開(kāi)花率；并且，本發(fā)明采用在無(wú)菌環(huán)境中授粉及授粉后采用專(zhuān)用培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)實(shí)培養(yǎng)，提高其結(jié)實(shí)率；所結(jié)果實(shí)的果夾直徑可達(dá)0.8～1cm，授粉結(jié)實(shí)率高達(dá)90%。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103210842SQ201310041790
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者林忠全 申請(qǐng)人:四川深達(dá)生物科技有限公司