專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其在防治小麥禾谷孢囊線蟲病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株短小芽孢桿菌及其在防治小麥禾谷孢囊線蟲病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禾谷抱囊線蟲又名燕麥抱囊線蟲(Heterodera avenae Wollen-weber 1924,Cereal Cyst Nematodes,簡稱CCN),為世界性禾谷類作物的病原線蟲,現(xiàn)已對(duì)我國11個(gè)省市(自治區(qū)、直轄市)的小麥造成危害，而且逐年加重，成為小麥生產(chǎn)上的主要病害。目前對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲病的防治主要是化學(xué)防治和抗病品種的利用。具有較好防效的化學(xué)殺線劑，如鐵滅克(Temik)、呋喃丹(Furadan)等，屬于高毒農(nóng)藥，存在毒性大、成本高、污染環(huán)境、危害人類健康等問題，在生產(chǎn)上不能得到推廣應(yīng)用。選育抗禾谷孢囊線蟲新品種是防治根線蟲病最為有效的方法，但是已鑒定的抗禾谷孢囊線蟲基因普遍存在于小麥近源屬(如大麥屬、燕麥屬、山羊草屬等)中，來源于六倍體小麥的抗禾谷孢囊線蟲基因十分有限，使得抗病育種進(jìn)展緩慢。禾谷孢囊線蟲種內(nèi)存在嚴(yán)重致病型分化現(xiàn)象，抗性基因?qū)Σ煌虏⌒偷暮坦孺吣揖€蟲具有不同抗性，導(dǎo)致品種抗性分布不穩(wěn)定，很容易造成抗性品種抗性的丟失。目前我國種植的小麥品種中還沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)禾谷孢囊線蟲完全免疫的品種。源于對(duì)環(huán)境友好、綠色無公害、有利于人類健康，生物防治在植物病害防治研究中一直處于熱點(diǎn)。雖然國內(nèi)外在植物寄生線蟲生防細(xì)菌的種類、篩選、防治效果和土壤添加劑等方面也有了一些研究，但生產(chǎn)上還沒有應(yīng)用效果穩(wěn)定的生防制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株短小芽孢桿菌及其在防治小麥禾谷孢囊線蟲病中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的菌株屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),命名為B202,已于2012年03月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC N0.5838。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) B202 CGMCC N0.5838 簡稱短小芽孢桿菌 B202。本發(fā)明還保護(hù)短小芽孢桿菌B202在制備小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑，其活性成分為如下(a)、(b)、(C)和(d)中的至少一種:(a)短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵培養(yǎng)物(包括發(fā)酵上清和菌體);(b)短小芽孢桿菌B202 ; (c)短小芽孢桿菌B202的芽孢；(d)短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵上清。本發(fā)明還保護(hù)一種防治植物發(fā)生小麥禾谷孢囊線蟲病的方法，包括在播種前將待測(cè)植物種子進(jìn)行如下處理的步驟:用短小芽孢桿菌B202的芽孢懸浮液對(duì)待測(cè)植物的種子進(jìn)行浸種處理。所述待測(cè)植物具體可為小麥(小麥品種“溫麥19”)。所述短小芽孢桿菌B202的芽孢懸浮液的具體制備方法如下:將短小芽孢桿菌B202的芽孢懸浮于無菌水，得到芽孢濃度為8X IO8個(gè)/ml的芽孢懸浮液。所述浸種的時(shí)間具體可為I小時(shí)。
本發(fā)明還保護(hù)另一種防治植物發(fā)生小麥禾谷孢囊線蟲病的方法，包括將待測(cè)種子進(jìn)行如下處理的步驟:(I)將待測(cè)植物種子用短小芽孢桿菌B202的菌體浸種；(2)將完成步驟(I)的種子催芽，得到幼苗；(3)將步驟(2)得到的幼苗用短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵上
清灌根。所述待測(cè)植物具體可為小麥(小麥品種“溫麥19”)。所述短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵培養(yǎng)物具體按照如下方法制備:將短小芽孢桿菌B202接種到NA改良培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)得到0D6(l(lmi=4.0的發(fā)酵培養(yǎng)物。所述短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵上清具體按照如下方法制備:將所述發(fā)酵培養(yǎng)物4000rpm離心30min,收集上清液。NA改良培養(yǎng)基(pH7.0)由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下:3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、3g/L葡萄糖。
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采用芽孢桿菌(Bacillus spp.)進(jìn)行生物防治具有如下優(yōu)勢(shì):適應(yīng)性廣；作用機(jī)制多樣，不易產(chǎn)生抗藥性；發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低；形成芽孢、易儲(chǔ)運(yùn)；環(huán)境友好，對(duì)人畜安全。本發(fā)明提供了一株短小芽孢桿菌B202，通過室內(nèi)殺線活性、溫室盆栽和田間試驗(yàn)篩選證明其對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲病具有穩(wěn)定防治效果，為小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


圖1為B202菌株的形態(tài)(10倍放大的照片)。圖2為B202菌株的形態(tài)(40倍放大的照片)。圖3為B202菌株的形態(tài)(100倍放大的照片)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。小麥禾谷抱囊線蟲(Heteroderaavenae):Yuan, H.X., Sun, J.ff., Yang, ff.X.，Xing, X，P.，Wang, Z.Y.，Riley, L.T.，and Li，H.L.New pathotypes of Heteroderaavenae (cereal cyst nematode)from winter wheat in Zhengzhou, Henan, China.[J].Australasian Plant Pathology 2010，39:107-111。小麥品種“溫麥19”(小麥禾谷孢囊線蟲病感病品種):由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所提供；袁虹霞，年高磊，邢小萍，付博，張鵬，李洪連.魯豫皖交界地區(qū)四個(gè)小麥禾谷孢囊線蟲群體致病型鑒定.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011, 38(5):408-412。實(shí)施例1、短小芽孢桿菌B202菌株的獲得和鑒定一、短小芽孢桿菌B202菌株的獲得從中國中部平原小麥主產(chǎn)區(qū)河南省、河北省和陜西省地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲發(fā)病嚴(yán)重的地塊挖取重病小麥和健康小麥，保留根部土壤。小心去掉小麥植株根部土壤，隨機(jī)剪取新生主根和毛細(xì)根，置于50ml含玻璃珠的無菌水中，充分搖動(dòng)。將根取出，獲得土壤懸液。取出的根系先用無菌水沖洗，然后用1%次氯酸鈉消毒8分鐘，再用無菌水漂洗4次，沖凈殘余次氯酸鈉，將2克根和IOml無菌水并適當(dāng)加少量石英砂于無菌研缽中研磨，獲得根系懸液。將各個(gè)懸液搖勻，取Iml加入裝有9ml無菌水的試管中，混合均勻后梯度稀釋至1(Γ6濃度，將10'10'Kr6濃度的稀釋液在80°C的水浴中保持30min以殺死大部分的非芽孢細(xì)菌，取100 μ I涂布牛肉膏平板，每個(gè)稀釋度涂平板3個(gè)，30°C保存培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，挑取不同的單菌落，進(jìn)行轉(zhuǎn)管并在4°C下保存?zhèn)溆谩９搏@得293株芽孢桿菌，其中根內(nèi)生芽孢桿菌74株，根際土壤芽孢桿菌219株，根際土壤的芽孢桿菌數(shù)量明顯多于根內(nèi)生芽孢桿菌數(shù)量。將其中I個(gè)純培養(yǎng)的菌株命名為B202菌株。二、B202菌株的形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果B202菌株的 形態(tài)見圖1 (10倍放大的照片)、圖2 (40倍放大的照片)和圖3(100倍放大的照片)。B202菌株的菌株形態(tài)為呈短桿狀，菌體大小0.54X2.3um，具內(nèi)生芽孢。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上37 °C培養(yǎng)48小時(shí)后，菌落突起，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣光滑細(xì)膩，菌落不透明，顏色為乳白色，直徑1.3mm 2.1mm。革蘭氏染色陽性。提取B202菌株的總DNA，對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(見序列表的序列I )，將測(cè)序結(jié)果在NCBI的GENBANK比對(duì)，結(jié)論如下:菌株B202和Bacillus pumilus相似度最高，為99%。通過Biolog GEN III系統(tǒng)鑒定，SIM等于0.674，大于0.5。根據(jù)以上鑒定結(jié)果,菌株B202屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)B202已于2012年03月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJias:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院 3 號(hào))，保藏號(hào)為 CGMCC N0.5838。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)B202CGMCC N0.5838簡稱短小芽孢桿菌B202。實(shí)施例2、短小芽孢桿菌B202的培養(yǎng)1、將短小芽孢桿菌B202單菌落接種到NA改良培養(yǎng)基(溶劑為水，含有3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、3g/L葡萄糖；pH7.0)中，30°C、180rpm/min振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，得到OD600nm=4.0的發(fā)酵體系懸液。2、將步驟I得到的發(fā)酵體系懸液4000rpm離心30min，分別收集上清液和菌體沉淀。3、將步驟2得到的菌體沉淀懸浮于無菌水，得到芽孢濃度為8X IO8個(gè)/ml的芽孢
懸浮液。實(shí)施例3、室內(nèi)條件下短小芽孢桿菌B202對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲活性影響1、將小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲用無菌水懸浮。2、分組處理如下:實(shí)驗(yàn)組:將250 μ I步驟I得到的懸浮液(含100±5條小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲)與250 μ I實(shí)施例2得到的發(fā)酵體系懸液混合,常溫培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)照組:將250 μ I步驟I得到的懸浮液(含100±5條小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲)與250 μ I無菌水混合，常溫培養(yǎng)24小時(shí)。3、在步驟2的各個(gè)培養(yǎng)體系中各加入lmol/L NaOH水溶液(在堿性刺激下存活的幼蟲會(huì)動(dòng),不動(dòng)的幼蟲計(jì)為死亡幼蟲),統(tǒng)計(jì)小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲的死亡率。死亡率(％)=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)X 100%。校正死亡率(％)=(實(shí)驗(yàn)組的死亡率-對(duì)照組的死亡率)/(1-對(duì)照組的死亡率)X 100%O進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)組的死亡率為100%，對(duì)照組的死亡率為0%，校正死亡率為100%。結(jié)果表明，短小芽孢桿菌B202可以使小麥禾谷孢囊線蟲幼蟲死亡。實(shí)施例4、溫室盆栽條件下短小芽孢桿菌B202對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲病的防治1、從北京地區(qū)延慶縣玉米田中取表層土，將10體積份表層土、3體積份蛭石、2體積份草炭和I體積份腐熟雞糞混合，然后180°C干熱滅菌3小時(shí)，得到培養(yǎng)基質(zhì)。2、將小麥品種“溫麥19”的種子用實(shí)施例2得到的菌體沉淀浸種I小時(shí)，然后進(jìn)行催芽。3、取IOcmX IOcm的培養(yǎng)缽，每個(gè)培 養(yǎng)缽放入450g培養(yǎng)基質(zhì)，輕輕壓實(shí)，然后放置完成步驟2的種子，每個(gè)培養(yǎng)缽5粒種子，然后在種子上覆蓋l_2cm的培養(yǎng)基質(zhì)，將培養(yǎng)缽放在塑料托盤中，從盤中澆透水后放在15_20°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)，種子出苗后，用實(shí)施例2得到的上清液灌根，每株IOml。4、步驟3中的種子出苗7天后，用玻璃棒在培養(yǎng)缽中的小麥幼苗的根部附近插入3-6cm深的小洞，灌注用無菌水制備的小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲的懸浮液(200條幼蟲/株)，用培養(yǎng)基質(zhì)封上小洞，每隔3天采用相同的步驟接種小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲一次，共接種3次。設(shè)置不用菌體沉淀浸種且不用上清液灌根的空白對(duì)照。設(shè)置不用菌體沉淀浸種，而改用1.8%阿維菌素乳油的1000倍稀釋液代替實(shí)施例2的上清液進(jìn)行灌根的陽性對(duì)照。從第一次接種小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲開始計(jì)天數(shù)，60天后調(diào)查小麥根部根結(jié)形成情況，將植株連根挖出(盡可能保持根系完整)，用自來水洗干凈，放在盛有清水的塑料盤中進(jìn)行病情調(diào)查，計(jì)算防治效果。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:O級(jí):根部無根結(jié)；I級(jí):每株根部有1-5個(gè)根結(jié)；2級(jí):每株根部有6-10個(gè)根結(jié)；3級(jí):大部分根上有根結(jié)，單株10個(gè)根結(jié)以上；4級(jí):根結(jié)相連成須根團(tuán)，難以計(jì)數(shù)。病情指數(shù)(％) = Σ (級(jí)數(shù)X同級(jí)株數(shù))/ (總株數(shù)X4) X 100%。防治效果(％)=(空白對(duì)照組病情指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組或陽性對(duì)照組病情指數(shù))/空白對(duì)照組病情指數(shù)X100%。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置30株植株作為重復(fù)處理，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)組的病情指數(shù)為37.50%,空白對(duì)照組的病情指數(shù)為91.67%，陽性對(duì)照組的病情指數(shù)為50%。實(shí)驗(yàn)組的防治效果為59.09%,陽性對(duì)照組的防治效果為45.45%。
實(shí)施例5、田間條件下短小芽孢桿菌B202對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲病的防治2010年試驗(yàn):地點(diǎn)為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站，播種時(shí)間為2010年10月22日。2011年實(shí)驗(yàn):地點(diǎn)為河南省許昌市河街鄉(xiāng)黃莊村，播種時(shí)間為2011年10月21日。一、實(shí)驗(yàn)方法1、將短小芽孢桿菌B202接種于NA改良培養(yǎng)基，30°C、180rpm/min振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，4000rpm離心30min，收集菌體，懸浮于無菌水，得到芽孢濃度為8 X IO8個(gè)/ml的芽孢懸浮液。2、分組處理如下:實(shí)驗(yàn)組:將小麥品種“溫麥19”的種子用步驟I得到的芽孢懸浮液浸種I小時(shí)；空白對(duì)照組:將小麥品種“溫麥19”的種子用無菌水浸種I小時(shí)；陽性對(duì)照組:將小麥品種“溫麥19”的種子用1.8%阿維菌素乳油的1000倍稀釋液浸種I小時(shí)。3、將農(nóng)田中，隨機(jī)劃分9個(gè)區(qū)域(每個(gè)區(qū)域60m2)，將完成步驟2的種子每組種子播種3個(gè)區(qū)域，各區(qū)域四周設(shè)置保護(hù)行。小麥灌漿期調(diào)查小麥孢囊線蟲發(fā)病情況。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)三點(diǎn)取樣調(diào)查，每點(diǎn)取10株，用鐵鍬連同植株根系土壤挖出，帶回室內(nèi)調(diào)查小麥根部調(diào)查孢囊數(shù)，進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。對(duì)病情指數(shù)使用SPSS進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):O級(jí):根部無孢囊,無??；I級(jí):感染極輕微(1-5個(gè)孢囊/單株)；2級(jí):輕度發(fā)生(6-20個(gè)孢囊/單株)；3級(jí):中度發(fā)生(20-40個(gè)孢囊/單株)；4級(jí):嚴(yán)重發(fā)生(單株孢囊在40個(gè)以上)。病情指數(shù)(％) = Σ (級(jí)數(shù)X同級(jí)株數(shù))/ (總株數(shù)X4) X 100%。防治效果(％)=(空白對(duì)照組病情指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組或陽性對(duì)照組病情指數(shù))/空白對(duì)照組病情指數(shù)X100%。結(jié)果見表I和表2。表12010年菌株B202對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲田間防治效果
權(quán)利要求
1.短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) B202，其保藏編號(hào)為 CGMCC N0.5838。
2.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌在制備小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑中的應(yīng)用。
3.一種小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑，其活性成分為如下(a)、(b)、(c)和(d)中的至少一種: Ca)權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物； (b)權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌； (c)權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的芽孢； Cd)權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的發(fā)酵上清。
4.一種防治植物發(fā)生小麥禾谷孢囊線蟲病的方法，包括在播種前將待測(cè)植物種子進(jìn)行如下處理的步驟:用權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的芽孢懸浮液對(duì)待測(cè)植物的種子進(jìn)行浸種處理。
5.一種防治植物發(fā)生小麥禾谷孢囊線蟲病的方法，包括將待測(cè)種子進(jìn)行如下處理的步驟: (1)將待測(cè)植物種子用權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的菌體浸種； (2)將完成步驟(I)的種子催芽，得到幼苗； (3)將步驟(2)得到的幼苗用`權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌的發(fā)酵上清灌根。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株短小芽孢桿菌及其在防治小麥禾谷孢囊線蟲病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，命名為B202，保藏號(hào)為CGMCCNo.5838。本發(fā)明還保護(hù)短小芽孢桿菌B202在制備小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑，其活性成分為如下(a)或(b)或(c)或(d)中的至少一種(a)短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵體系；(b)短小芽孢桿菌B202；(c)短小芽孢桿菌B202的芽孢；(d)短小芽孢桿菌B202的發(fā)酵體系的上清液。本發(fā)明提供法人短小芽孢桿菌B202對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲病具有穩(wěn)定防治效果，為小麥禾谷孢囊線蟲生防制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01P5/00GK103103155SQ20131004605
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者王 琦, 李洪濤, 李燕 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)