專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法，尤其是涉及一種以稻殼加工產(chǎn)物為吸附劑生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能將葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，將其加入飼料中，能消耗氧而有利于厭氧乳酸菌的增殖，迅速產(chǎn)生大量乳酸，使飼料中的PH值下降，抑制有害細(xì)菌繁殖，避免異常發(fā)酵，從而保證飼料的質(zhì)量，利于禽畜育肥。因此，作為一種新型的抗生素替代物，葡萄糖氧化酶在飼料工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前飼用葡萄糖氧化酶由青酶、黑曲酶、酵母液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)。游離的葡萄糖氧化酶由于穩(wěn)定性差，保存和使用受到一定限制，經(jīng)固定化后，其穩(wěn)定性可以顯著增強(qiáng)。葡萄糖氧化酶的固定化方法有吸附法、共價(jià)法、交聯(lián)法、包埋法等，固定化載體有氨基化硅膠、殼聚糖微球、瓊脂糖凝膠、尼龍膜、HEC/Si02凝膠等，但這些載體材料價(jià)格昂貴，且大多數(shù)不符合食品級(jí)或飼用級(jí)要求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種原料來(lái)源廣，成本低廉，工藝簡(jiǎn)單的生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法，所得固定化葡萄糖氧化酶活力高，穩(wěn)定性好，安全性好。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是，一種生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步驟:
(1)稻殼吸附劑的制備:將稻殼粉碎，過(guò)20目篩，經(jīng)102°C 108°c烘箱干燥后，取30g 35g置于瓷坩堝內(nèi)，將瓷坩堝于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行炭化，炭化溫度350°C 450°C，保溫時(shí)間30 60min,以控制炭化稻殼水分含量0.5wt% 1.0wt%,碳含量40wt% 60wt%, 二氧化硅含量40wt% 60wt%，其它金屬氧化物A1203、Fe203、CaO, MgO, Na2O, K2O總含量2.0wt%
3.0wt% (保證炭化不過(guò)度)，冷卻后得到炭化稻殼；
取炭化稻殼15g 20g，加入50mL IOOmL 4mol/L的NaOH溶液，95 105°C反應(yīng)2 4小時(shí)，抽濾去除溶液，并用蒸餾水將濾渣洗滌至中性，然后將濾渣置于102 108°C烘箱中烘干備用；取88 IOg干燥濾渣，加入16g 20g固體磷酸，于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行活化，溫度350°C 450°C，活化時(shí)間在60min 90min，冷卻后用蒸餾水洗滌至中性，在102 108°C烘箱中烘干，然后粉碎，過(guò)40目篩，得多孔稻殼吸附劑；所得多孔稻殼吸附劑水分含量0.5wt% 1.0wt%,碳含量70wt% 85wt%, 二氧化娃含量15wt% 30wt% ；
(2)葡萄糖氧化酶的吸附:取5mg 6mg葡萄糖氧化酶溶解于50mL 60mL磷酸緩沖液(pH5.6)中，加入0.5g 0.6g稻殼吸附劑,室溫下攪拌2h 3h,然后放入4°C 6°C冰箱中靜置過(guò)夜，離心棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽濾，濾渣即為吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑；
(3)葡萄糖氧化酶的包埋:將步驟(2)吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑加入到IOOmL 120mL 2wt%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，將海藻酸鈉懸浮液滴入lwt%的氯化鈣溶液中，制成直徑為3mm 4mm的固定化凝膠珠，將固定化凝膠珠在4°C 6°C冰箱中靜置過(guò)夜，用蒸餾水洗滌3次，過(guò)濾，濾渣即為固定化葡萄糖氧化酶。固定化葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定:
采用酸堿滴定法測(cè)定固定化葡萄氧化酶的活力:稱(chēng)取固定化葡萄糖氧化酶20mg 40mg于250mL錐形瓶中，加入25mL含有2wt%葡萄糖的0.lmol/L磷酸緩沖液(pH5.6)中，于30°C恒溫振蕩反應(yīng)Ih,立即加入20mL0.lmol/L的氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),用0.lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定；并做空白試驗(yàn)，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力單位(U)定義為每分鐘催化葡萄糖氧化生成I μ mo I葡萄糖酸所需的酶量。5mg游離葡萄糖氧化酶活力為150U，經(jīng)測(cè)定，用稻殼吸附劑固定化后，固定化葡萄糖氧化酶活力為114 126U，酶活力回收率可達(dá)75%以上。固定化葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性的測(cè)定:
將0.5g 0.6g的固定化葡萄糖氧化酶和游離葡萄糖氧化酶分別于4 6°C冰箱中保存，用酸堿滴定法測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，保存30天時(shí)，游離葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到40%以下，而固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍保持在70%以上，其穩(wěn)定性較游離葡萄糖氧化酶顯著提高。稻殼是一種來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生的稻谷加工副產(chǎn)物，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和二氧化硅，是生產(chǎn)大宗飼料的原材料，也是制備活性炭、白炭黑、碳硅復(fù)合物等稻殼吸附劑的最佳材料。研究表明，稻殼吸附劑可吸附真菌毒素，作為飼料添加齊U，還可作為β_葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶等多種酶制劑的固定化載體，增強(qiáng)酶分子的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性。本發(fā)明采用稻殼為原料，通過(guò)炭化、活化等工藝制成富含活性炭和白炭黑的稻殼吸附劑，以稻殼吸附劑為載體固定`化葡萄糖氧化酶，制備具有吸附真菌毒素、抑制有害細(xì)菌生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率等多種功能的飼料添加劑。葡萄糖氧化酶經(jīng)稻殼吸附劑固定化后，酶活力回收率可達(dá)75%以上,保存30天后酶活力回收率仍在70%以上,其穩(wěn)定性較游離葡萄糖氧化酶顯著提高。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、易操作，降低了固定化葡萄糖氧化酶的原料成本和生產(chǎn)成本，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)稻谷加工副產(chǎn)物的高值利用。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
本實(shí)施例包括以下步驟:
(I)稻殼吸附劑的制備
將稻殼粉碎，過(guò)20目篩，經(jīng)105°C烘箱干燥后，取30g置于瓷坩堝內(nèi)，將瓷坩堝于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行炭化，炭化溫度350°C，保溫時(shí)間30min，冷卻后得到炭化稻殼；
炭化稻殼水分含量0.9wt%,碳含量54wt%，二氧化硅含量41wt%，其它金屬氧化物A1203、Fe2O3、CaO、MgO、Na2O> K2O 含量 2.3wt% ；
取炭化稻殼20g，加入75mL 4mol/L NaOH溶液，100°C反應(yīng)3小時(shí)，抽濾去除溶液，并用蒸餾水將濾渣洗滌至中性，然后將濾渣置于105°C烘箱中烘干備用；取IOg干燥濾渣，加入20g固體磷酸，于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行活化，溫度400°C，活化時(shí)間60min，冷卻后用蒸餾水洗滌至中性，在105°C烘箱中烘干，粉碎。過(guò)40目篩，得多孔稻殼吸附劑；稻殼吸附劑水分含量
0.8wt%,碳含量79wt%, 二氧化娃含量17wt% ；
(2)葡萄糖氧化酶的吸附
取5mg葡萄糖氧化酶(酶活力30000U/g)溶解于50mL磷酸緩沖液(pH5.6)中，加入0.5g稻殼吸附劑，室溫下攪拌2h，然后放入4°C冰箱中靜置過(guò)夜，離心棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽濾，濾渣即為吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑；
(3)葡萄糖氧化酶的包埋
將步驟(2)吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑加入到IOOmL 2wt%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，用注射器將海藻酸鈉懸浮液滴入lwt%的氯化鈣溶液中，制成直徑為3_ 4_的固定化凝膠珠，將固定化凝膠珠在4°C冰箱中靜置過(guò)夜，用蒸餾水洗滌3次，過(guò)濾，濾渣即為固定化葡萄糖氧化酶。本實(shí)施例之固定化葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定:
采用酸堿滴定法測(cè)定固定化葡萄氧化酶活力:稱(chēng)取固定化葡萄糖氧化酶20mg于250mL錐形瓶中，加入25mL含有2wt%葡萄糖的0.lmol/L磷酸緩沖液(pH5.6)中，于30°C恒溫振蕩反應(yīng)Ih,立即加入20mL 0.lmol/L氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),用0.lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，并做空白試驗(yàn)，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力單位(U)定義為每分鐘催化葡萄糖氧化生成I μ mo I葡萄糖酸所需的酶量；經(jīng)測(cè)定，5mg游離葡萄糖氧化酶活力為150U，用稻殼吸附劑固定化后，葡萄糖氧化酶活力為114U，酶活力回收率為76.0%。本實(shí)施例 之固定化葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性的測(cè)定:
將0.5g的固定化葡萄糖氧化酶和游離葡萄糖氧化酶分別于4°C冰箱中保存10、20、30天，用酸堿滴定法測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，保存20天時(shí)，游離葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到54.3%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率為75.2% ;保存30天時(shí)，游離葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到32.2%,固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍為73.3%，其穩(wěn)定性較游離葡萄糖氧化酶顯著提高。實(shí)施例2
本實(shí)施例包括以下步驟:
(1)稻殼吸附劑的制備
將稻殼粉碎，過(guò)20目篩，經(jīng)105 °C烘箱干燥后，取30g置于瓷坩堝內(nèi)，將瓷坩堝于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行炭化，炭化溫度450°C，保溫時(shí)間60min，冷卻后得到炭化稻殼；
炭化稻殼水分含量0.6wt%,碳含量4lwt%, 二氧化硅含量55wt%，其它金屬氧化物
2.7wt% ；
取炭化稻殼20g，加入75mL 4mol/L NaOH溶液，100°C反應(yīng)3小時(shí)，抽濾去除溶液，并用蒸餾水將濾渣洗滌至中性，然后將濾渣置于105°C烘箱中烘干備用；取IOg干燥濾渣，加入20g磷酸，于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行活化，溫度450°C，活化時(shí)間在90min，冷卻后用蒸餾水洗滌至中性，在105°C烘箱中烘干，然后粉碎，過(guò)40目篩，得多孔稻殼吸附劑；稻殼吸附劑水分含量
0.7%，碳含量69%，二氧化硅含量26% ；
(2)葡萄糖氧化酶的吸附
取5mg葡萄糖氧化酶(酶活力30000U/g)溶解于50mL磷酸緩沖液(pH5.6)中，加入0.5g稻殼吸附劑，室溫下攪拌2h，然后放入4°C冰箱中靜置過(guò)夜，離心棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽濾，濾渣即為吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑；
(3)葡萄糖氧化酶的包埋
將步驟(2)吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑加入到IOOmL 2wt%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后用注射器將海藻酸鈉懸浮液滴入lwt%的氯化鈣溶液中，制成直徑為3_ 4_的固定化凝膠珠，將固定化凝膠珠在4°C冰箱中靜置過(guò)夜，用蒸餾水反復(fù)洗滌，濾干即得固定化葡萄糖氧化酶。本實(shí)施例固定化葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定:
采用酸堿滴定法測(cè)定固定化葡萄氧化酶活力:稱(chēng)取固定化葡萄糖氧化酶20mg于250mL錐形瓶中，加入25mL含有2wt%葡萄糖的0.lmol/L磷酸緩沖液(pH5.6)中，于30°C恒溫振蕩反應(yīng)Ih,立即加入20mL 0.lmol/L氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),用0.lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，并做空白試驗(yàn)，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力單位(U)定義為每分鐘催化葡萄糖氧化生成I μ mo I葡萄糖酸所需的酶量。經(jīng)測(cè)定，5mg游離葡萄糖氧化酶活力為150U，用
0.5g稻殼吸附劑固定化后，葡萄糖氧化酶活力為119U，酶活力回收率為79%。本實(shí)施例之固定化葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性的測(cè)定
將0.5g的固定化葡萄糖氧化酶和游離葡萄糖氧化酶分別于4°C冰箱中保存10、20、30天，用酸堿滴定法測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，保存20天時(shí)，游離葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到56.2%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率為77.6% ;保存30天時(shí)，游離葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到37.3%,固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍為71.7%，其穩(wěn)定性較游離葡萄糖氧化酶 顯著提高。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)稻殼吸附劑的制備:將稻殼粉碎，過(guò)20目篩，經(jīng)102°C 108°c烘箱干燥后，取30g 35g置于瓷坩堝內(nèi)，將瓷坩堝于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行炭化，炭化溫度350°C 450°C，保溫時(shí)間30 60min,冷卻后得到炭化稻殼； 取炭化稻殼15g 20g，加入50mL IOOmL 4mol/L的NaOH溶液，95 105°C反應(yīng)2 4小時(shí)，抽濾去除溶液，并用蒸餾水將濾渣洗滌至中性，然后將濾渣置于102 108°C烘箱中烘干備用；取88 IOg干燥濾渣，加入16g 20g固體磷酸，于馬弗爐內(nèi)進(jìn)行活化，溫度350°C 450°C，活化時(shí)間在60min 90min，冷卻后用蒸餾水洗滌至中性，在102 108°C烘箱中烘干，然后粉碎，過(guò)40目篩，得多孔稻殼吸附劑； (2)葡萄糖氧化酶的吸附:取5mg 6mg葡萄糖氧化酶溶解于50mL 60mL磷酸緩沖液中，加入0.5g 0.6g稻殼吸附劑,室溫下攪拌2h 3h,然后放入4°C 6°C冰箱中靜置過(guò)夜，離心棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，抽濾，濾渣即為吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑； (3)葡萄糖氧化酶的包埋:將步驟(2)吸附了葡萄糖氧化酶的稻殼吸附劑加入到IOOmL 120mL 2wt%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，將海藻酸鈉懸浮液滴入lwt%的氯化鈣溶液中，制成直徑為3mm 4mm的固定化凝膠珠，將固定化凝膠珠在4°C 6°C冰箱中靜置過(guò)夜，用蒸餾水洗滌3次，過(guò)濾，濾渣即`為固定化葡萄糖氧化酶。
全文摘要
一種生產(chǎn)飼用固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步驟(1)稻殼吸附劑的制備；(2)葡萄糖氧化酶的吸附；(3)葡萄糖氧化酶的包埋。本發(fā)明采用稻殼為原料，制成富含活性炭和白炭黑的稻殼吸附劑，以稻殼吸附劑為載體固定化葡萄糖氧化酶，制備具有吸附真菌毒素、抑制有害細(xì)菌生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率等多種功能的飼料添加劑。葡萄糖氧化酶經(jīng)稻殼吸附劑固定化后，酶活力回收率可達(dá)75%以上，保存30天后酶活力回收率仍在70%以上，其穩(wěn)定性較游離葡萄糖氧化酶顯著提高。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、易操作，降低了固定化葡萄糖氧化酶的原料成本和生產(chǎn)成本，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)稻谷加工副產(chǎn)物的高值利用。
文檔編號(hào)A23K1/165GK103146676SQ20131010427
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者吳偉, 林親錄, 吳躍, 付湘晉, 梁盈, 王青云, 楊濤 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)