具有改進的營養(yǎng)價值的甘藍植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供涉及與標準甘藍品種相比蘿卜硫苷增加的組合物和方法。本發(fā)明也涉及具有所需硫代葡萄糖苷含量的雜交品種的生產(chǎn)。本發(fā)明進一步提供包含這種性狀并包含來自甘藍麥的不與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖的Myb28等位基因的植物、植物部分和種子。
【專利說明】具有改進的營養(yǎng)價值的甘藍植物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年9月13日提交的美國臨時申請第61 / 700，762號的權益，其以引用方式全部合并于此。
[0003]序列表的合并
[0004]包含在名稱為“SEMB008US_ST25”、在微軟Windows操作系統(tǒng)中計量為8000字節(jié)并創(chuàng)建于2012年9月13日的序列表在此以電子形式提交并通過引用方式合并于此。
發(fā)明領域
[0005]本發(fā)明涉及開發(fā)和使用具有重組染色體片斷的甘藍(Brassica oleracea)植物?！颈尘凹夹g】
[0006]硫代葡萄糖苷是存在于16個科的植物品種特別是十字花科(Brassicaceae)中的化感物質，在這些植物品種中花椰菜是一個著名的例子。盡管在性質上存在超過120種鑒別的硫代葡萄糖苷，但密切相關的分類組通常僅包含少數(shù)的這類化合物。在花椰菜中占優(yōu)勢的硫代葡萄糖苷例如蘿卜硫苷和屈曲花苷在生物化學上是衍生自氨基酸蛋氨酸。在該硫代葡萄糖苷途徑中，蛋氨酸通過ELONG (延伸)基因座的活性通過每次將單個碳單元添加至尾部而轉化為同型蛋氨酸和二同型蛋氨酸。同型蛋氨酸最終轉化為3-甲基硫代丙基硫代葡萄糖苷(屈曲花苷；“MSP”)而二同型蛋氨酸轉化為4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷(蘿卜硫苷。這些硫代葡萄糖苷(屈曲花苷和蘿卜硫苷)是促進潛在致癌物的代謝和
排泄的II期解毒酶例如谷胱甘肽-S-轉移酶和醌還原酶的有效誘導劑。
[0007]發(fā)明簡述
[0008]—個方面，本發(fā)明提供一種甘藍植物，其包含來自甘藍麥(Brassica villosa)的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中當與缺乏Myb28等位基因的植物相比時，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷。
[0009]在一個實施方式中，所述植物是花椰菜植物。在其他實施方式中，所述植物是近交或雜交的。在另一個實施方式中，所述植物對于來自甘藍麥的所述Myb28等位基因是純合的。在又另一個實施方式中，所述植物對于來自甘藍麥的所述Myb28等位基因是雜合的。在再另一個實施方式中，所述ELONG等位基因來自甘藍。
[0010]另一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的植物部分。在一些實施方式中，所述植物部分可以進一步定義為葉、胚珠、小花、花粉、頭部(head)或細胞。
[0011]又另一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明植物的種子。
[0012]再另一個方面，本發(fā)明提供一種包含染色體片斷的甘藍植物，所述染色體片斷包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中相對于缺乏Myb28等位基因的植物，所述片斷賦予增加的硫代葡萄糖苷，且其中包含該染色體片斷的種子樣品以ATCC登錄號PTA-13165保藏。在一個實施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生這種植物的種子。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供植物部分，其中所述部分是葉、胚珠、小花、花粉、頭部或細胞。在另一個實施方式中，所述植物是甘藍植物。
[0013]在本發(fā)明的另一個方 面中，提供了包含來自甘藍麥的Myb28等位基因和來自甘藍的ELONG等位基因的重組DNA片斷。在一個實施方式中，所述DNA片斷進一步定義為包含于細胞內。在另一個實施方式中，所述DNA片斷進一步定義為包含于種子內。在又另一個實施方式中，所述DNA片斷進一步定義為包含于植物內。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供用于獲得包含所需的硫代葡萄糖苷組成的蕓苔屬植物的方法，包括:a)獲得對于來自甘藍麥的Myb28等位基因為雜合的蕓苔屬植物，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷且在植物中與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖；(b)獲得該植物的后代；和(c)選擇其中發(fā)生重組以使得所述后代包含所述Myb28等位基因但不包含來自甘藍麥的ELONG等位基因的至少第一后代植物，其中由于存在Myb28等位基因但不存在來自甘藍麥的ELONG等位基因，所述后代植物具有所需的硫代葡萄糖苷組成。
[0015]在一個實施方式中，后代植物的選擇包括鑒別后代植物，所述后代植物(I)包含與甘藍麥中的Myb28等位基因遺傳連鎖的遺傳標志物和/或缺乏存在于所述蕓苔屬植物中相應基因座上的遺傳標志物，和(2)缺乏與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖的遺傳標志物和/或包含存在于來自所述蕓苔屬植物的相應基因座上的遺傳標志物。
[0016]在另一個實施方式中，后代植物的選擇包括檢測補體SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的互補序列側鄰的所述植物的基因組中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性。在進一步的實施方式中，這類等位基因通過基于PCR的方法采用寡核苷酸引物對來檢測。在另一個實施方式中，后代植物的選擇包括檢測圖5所示的所述后代植物中的多態(tài)性。在進一步的實施方式中，所述蕓苔屬植物可以是甘藍植物。
[0017]在再進一步的方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物或其后代，其包含Myb28等位基因但不包含來自甘藍麥的ELONG等位基因。在一個實施方式中，本發(fā)明提供這種植物的部分。在另一個實施方式中，所述植物部分選自細胞、種子、根、莖、葉、頭部、花和花粉。
[0018]在另一方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)具有增加的硫代葡萄糖苷含量的雜交甘藍植物的方法，包括將第一甘藍親本植物與不同基因型的第二甘藍植物雜交，其中所述第一親本植物包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中相對于缺乏Myb28等位基因的植物，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷。在一個實施方式中，所述方法進一步包括產(chǎn)生多種雜交甘藍植物，包括將第一甘藍親本植物與不同基因型的多種第二甘藍植物雜交。
[0019]在又另一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有所需增加的硫代葡萄糖苷含量的甘藍植物的方法，包括將包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因的染色體片斷滲入所述植物中，其中相對于缺乏所述片段的植物，片斷賦予所需的硫代葡萄糖苷含量，其中包含所述染色體片段的種子樣品以ATCC登錄號PTA-13165保藏。
[0020]術語“約”用于表示值包括用于測定該值的裝置或方法的誤差的標準偏差。權利要求書中使用的術語“或”用于表示“和/或”，除非明確指明僅指可選物或所述可選物是互斥的，盡管本公開支持僅指可選物和“和/或”的定義。權利要求書中，當與單詞“包含”或其他開放式術語結合使用時，單詞“一(a)”和“一個(an)”表示“一個或多個”，除非特定指明。術語“包含”、“具有”和“包括”為開放式聯(lián)系動詞。這些動詞中一個或多個的任何形式或時態(tài)例如“包含”、“具有”、“含有”和“包括”也是開放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一個或多個步驟的任何方法不局限于僅具有這些一個或多個步驟，且還覆蓋其他未列出的步驟。類似地，“包含”、“具有”或“包括”一種或多種性狀的任何植物不局限于僅具有這樣的一種或多種性狀，且還覆蓋其他未列出的性狀。
[0021]本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將從以下詳細說明中變得明顯。然而，應理解，盡管表明了本發(fā)明的【具體實施方式】，所提供的詳細說明和任何具體的實施例僅以舉例方式給出，因為在本發(fā)明精神和范圍內的多種變化和改變對于閱讀所述詳細說明的本領域技術人員而言將是明顯的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1描繪了來自雜交花椰菜品種Ironman(左)和RX05991199(右)的頭部。品種在夏天以50x50cm的間隔生長。
[0023]圖2顯示來自雜交花椰菜品種Ironman (左)和RX05991199 (右)的莖的水平截面。品種在秋天以50x50cm的間隔生長。
[0024]圖3顯示來自雜交花椰菜品種Ironman (左)和RX05991199(右)的頭部和莖的輪廓。品種在秋天以50x50cm的間隔生長。
[0025]圖4顯示具有QTLl-BoGLS-ELONG標志物的不同ELONG等位基因的分析結果。V等位基因是與Myb28關聯(lián)的甘藍麥等位基因，其導致高的3-MSP / 4-MSB比率和高的總硫代葡萄糖苷。A、B和C等位基 因是在不含甘藍麥ELONG等位基因的花椰菜中發(fā)現(xiàn)的等位基因的實例。
[0026]圖5顯示花椰菜品種FT69中包含的來自甘藍麥的Myb28基因座的共有序列和來自不具有增加水平的硫代葡萄糖苷的花椰菜例如甘藍(Oleracea)的相應基因座的共有序列之間的比對(SEQ ID NO:8-9)。
[0027]發(fā)明詳述
[0028]本發(fā)明提供與甘藍植物的植株、種子和衍生物有關的方法和組合物，該甘藍植物包含能夠賦予增加的4-甲基亞磺酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)(又名蘿卜硫苷)的來自甘藍麥的新的重組基因滲入。還意外地發(fā)現(xiàn)，包含所述基因滲入的植物能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生相對于屈曲花苷具有增加的蘿卜硫苷含量的雜種，而當使用包含非重組基因滲入的親本品系時，例如在包含來自甘藍麥的Myb28和ELONG等位基因的雜種PS05151639的Myb28供體親體(美國專利申請公布號2011/0055945)的情況下，結果顯著更易變。從單一近交親本生產(chǎn)多種具有增加的硫代葡萄糖苷含量和/或蘿卜硫苷與屈曲花苷比率的優(yōu)良雜種后代的能力的重要之處在于可用于產(chǎn)生雜交品種的優(yōu)良甘藍親本品系是有限的。因此降低的基因滲入實際上增加了給定近交系的效用并且例如允許產(chǎn)生有可能適應不同的生長環(huán)境、最終用途或其他標準的多種雜種，其各自具有所需的蘿卜硫苷含量。
[0029]包含來自甘藍麥的Myb28基因座且缺乏來自甘藍麥的迄今與其遺傳連鎖的ELONG基因座的新的“降低的基因滲入”能夠穩(wěn)定地賦予源自包含所述基因滲入的植物的雜種相對于屈曲花苷增加的蘿卜硫苷。因此本發(fā)明的一個方面涉及用于獲得包含至少一種這種降低的基因滲入的甘藍植物的方法，其中所形成的甘藍植物和/或源自其的后代相對于缺乏所述基因滲入的對照植物具有所需的蘿卜硫苷含量。因此本發(fā)明提供具有由本發(fā)明的降低的基因滲入所賦予的所需的蘿卜硫苷含量的植物。在某些實施方式中，用于獲得這種植物的方法包括獲得對于來自甘藍麥的Myb28等位基因為雜合的甘藍植物，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷且在植物中與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖；獲得這種植物的后代；和選擇一種或多種這種后代植物，其中發(fā)生遺傳重組以使得所述后代包含來自甘藍麥的Myb28等位基因但不包含來自甘藍麥的ELONG等位基因。由于存在Myb28等位基因而不存在來自甘藍麥的ELONG等位基因，這種后代或其進一步的后代也可以具有所需的蘿卜硫苷含量。在具體的實施方式中，所述方法可以包括通過鑒別一種或多種與Myb28和/或ELONG等位基因遺傳連鎖的遺傳標志物來獲得包含這種等位基因的后代植物。鑒別遺傳標志物可以包括表型、遺傳或生物化學試驗，且可包括篩選親本和/或后代植物中例如一種或多種本文描述的等位基因，例如包括來自甘藍麥的Myb28等位基因、來自甘藍麥的ELONG等位基因和來自甘藍的ELONG等位基因的存在。
[0030]據(jù)發(fā)現(xiàn)對于甘藍麥Myb28等位基因雜合的雜種后代中某些性狀例如相對于屈曲花苷含量的蘿卜硫苷含量或者硫代葡萄糖苷種類的不可預測性與來自甘藍麥的Myb28等位基因和來自甘藍麥基因滲入的ELONG等位基因中的硫代葡萄糖苷性狀共定位(co-locate)。因此，“降低”的基因滲入的形成理解為由在Myb28和ELONG QTL附近的重組事件引起。包含降低的基因滲入，即，經(jīng)歷了具有增加的硫代葡萄糖苷的接近于該QTL的重組事件的品系可以通過利用分子和/或表型標志物來有效地篩選。因此，相對于由Myb28和ELONG基因滲入指定的QTL而言分離的(即雜合的)植物群體或這種群體的后代可以篩選具有重組表型例如相對于屈曲花苷水平增加的蘿卜硫苷水平的植物。
[0031]在其他的實施方式中，本發(fā)明的方法可以包括鑒別包含源自于甘藍麥的降低的基因滲入，并包含本文所描述的Myb28和ELONG等位基因之間的減數(shù)分裂重組的甘藍植物。在特定的實施方式中，鑒別基因滲入可以包括采用標準方案測量蘿卜硫苷和/或屈曲花苷。在某些實施方式中，與包含來自 甘藍麥的Myb28和ELONG等位基因的植物或缺乏來自甘藍麥的Myb28等位基因的植物相比，包含如本文公開的降低的基因滲入的本發(fā)明植物包含增加的相對于屈曲花苷的平均蘿卜硫苷比例。在一個實施方式中，包含增加的相對于屈曲花苷的平均蘿卜硫苷比例的這種植物是近交系，以及在另一個實施方式中定義為以包含本發(fā)明的降低的基因滲入的植物作為一種或多種親本的雜種Fl。在特定的實施方式中，提供本發(fā)明的植物，其包含的蘿卜硫苷與屈曲花苷的比率為約10: 1、12: 1、15: 1、18: 1、20: 1、23: 1、25: 1、28: 1,30: 1、35: I和約40: I。在一個方面，蘿卜硫苷含量的增加可以參照標準甘藍品種例如花椰菜品種Ironman來計算。
[0032]A.具有增加的蘿卜硫苷的甘藍品系的培育
[0033]本發(fā)明的一個方面涉及使本文提供的包含降低的Myb28 / ELONG基因滲入的植物與其本身或第二植物雜交的方法，以及由這種方法生產(chǎn)的種子和植物。這些方法可用于生產(chǎn)和繁殖栽植的甘藍植物，其具有所需的硫代葡萄糖苷組成，包括MSB和/或MSP含量。然而進一步地，本發(fā)明的具有增加的硫代葡萄糖苷含量的植物相對于不含增加的硫代葡萄糖苷的植物包含改進的植物營養(yǎng)價值。該方法也可用于生產(chǎn)雜種甘藍種子和由其生長的植物。通過將這種品系與第二甘藍親本品系雜交產(chǎn)生雜種種子。所述雜種對于降低的基因滲入可以是雜合的或純合的。[0034]甘藍麥是西西里西北部和中部的地方性野生品種，因此Myb28等位基因可以通過本領域技術人員從選自野外的植物獲得?；蛘?，Myb28等位基因是本領域已知的且可從用于本發(fā)明的其他來源獲得，包括SNR347(FT69 ;在Mithen等，Theor Appl Genet, 106:727-734 ；2003 中稱為 428-11-69)、BR384-014、SNP13 (580333)、SNP88 (BRM51-1210)、BR384-020、B1639(ATCC 登錄號 PTA-9676)、BRM51-1162 (ATCC 登錄號 PTA-9675)和RX05991199(ATCC登錄號PTA-13165)。根據(jù)本發(fā)明，本文提供的植物通常將缺乏來自甘藍麥的與Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因。這可以根據(jù)本發(fā)明通過將包含Myb28和來自甘藍麥的ELONG等位基因的植物與不包含Myb28和來自甘藍麥的ELONG等位基因的蕓苔屬植物，包括標準甘藍品種，雜交而實現(xiàn)。這尤其包括本領域熟知的許多花椰菜品種。
[0035]蔬菜育種的目標是在單個品種/雜種中組合各種所需性狀。這種所需性狀可以包括任何種植者和/或消費者認為有益的性狀，包括高產(chǎn)量、抗蟲性或抗病性、對環(huán)境應力的耐受性和營養(yǎng)價值。用于嘗試獲得所需性狀的育種技術利用了植物的授粉方法。存在兩種常規(guī)的授粉方法:如果來自一朵花的花粉傳遞到相同植物的同一朵花或另一朵花，則為植物自花授粉，如果花粉從不同植物的花到達它，則為植物異花授粉。
[0036]開發(fā)均一的品種需要產(chǎn)生純合近交植物、這些近交植物的雜交和雜交的評價。系譜育種和輪回選擇是已用于從育種群體產(chǎn)生近交植物的育種方法的實例。那些育種方法將來自兩種或更多種植物或各種其他廣泛來源的遺傳背景結合入育種池中，通過近交和所需表型的選擇來從育種池產(chǎn)生新品系和源自該新品系的雜種。
[0037]根據(jù)本發(fā)明，新品種可以通過雜交本發(fā)明植物然后按照所需選擇代并近交以產(chǎn)生均一品系而建立。新品種也可以通過與任何第二植物雜交來建立。在選擇這種第二植物用于雜交而開發(fā)新品系的目的時，可能需要選擇其本身表現(xiàn)出一種或多種選定的所需特性或在雜種組合時顯示所需特性的那些植物。一旦進行初次雜交，進行近交和選擇以產(chǎn)生新品種。為了開發(fā)均一品系，通常包括五代或更多代的自交和選擇。
[0038]新品種的均一品系 也可通過單倍體加倍的方式來開發(fā)。該技術允許建立真實育種品系(true breeding line)而不需要多代的自交和選擇。以這種方式，真實育種品系可以在少至一代的情況下產(chǎn)生。單倍體胚可從小孢子、花粉、花藥培養(yǎng)或子房培養(yǎng)產(chǎn)生。然后單倍體胚可以自發(fā)地或通過化學處理(例如秋水仙堿處理)來加倍?；蛘?，單倍體胚可以生長成單倍體植物并經(jīng)處理以誘導染色體加倍。在任何一種情況下，獲得能繁殖的純合植物。根據(jù)本發(fā)明，任何一種這種技術可用于與本發(fā)明植物及其后代結合以獲得純合品系。
[0039]回交也可以用于改良近交植物?；亟粚⑻囟ǖ乃栊誀?，例如增加的蘿卜硫苷，從一種近交或非近交來源轉移到缺乏該性狀的品種。這可以例如通過首先將親本(A)(輪回親本)與攜帶用于所討論的性狀的一個或多個適當?shù)幕蜃墓w近交系(非輪回親本)雜交。然后這一雜交的后代與輪回親本(A)回配，然后在生成的后代中選擇待從非輪回親本轉移的所需性狀。在選擇所需性狀的五個或更多個的回交世代之后，后代對于控制所轉移的特性的基因座是雜合的，但是對于大部分或幾乎所有的其他基因座而言，其類似于第一親本。最后的回交世代將自交以提供所轉移性狀的純育種后代。
[0040]適當?shù)妮喕赜H本的選擇對于成功的回交程序而言是重要的步驟?；亟环桨傅哪繕耸歉淖兓虼嬖贩N的單一性狀或特性。為實現(xiàn)該目標，用來自非輪回親本的所需基因座改良或替代輪回品種的單個基因座，同時基本上保持原品種的所有其余的所需遺傳組成，并因此保持所需生理和形態(tài)學構成。具體的非輪回親本的選擇將取決于回交的目的；主要目的之一是將一些商業(yè)所需的性狀添加至該植物。精確的回交方案將取決于待改變的特性或性狀以確定適當?shù)臏y試方案。盡管當所轉移的特性是顯性等位基因時回交方法簡化，然而也可以轉移隱性等位基因?？赡苡斜匾牒蟠鷾y試以確定所需特性是否已經(jīng)成功轉移。
[0041]甘藍品種也可從兩種以上的親本開發(fā)。稱為改良回交的該技術在回交期間使用不同的輪回親本。改良回交可用于以具有某些更期望的特性的品種代替原始輪回親本或多個親本可用于獲得來自各親本的不同的所需特性。
[0042]許多單個基因座性狀已被鑒別，其在開發(fā)新的近交體系的過程中并非有規(guī)律地選擇，但可以通過回交技術改進。單個基因座性狀可以是或不是轉基因的；這些性狀的實例包括但不限于，雄性不育性、除草劑抗性、對細菌、真菌或病毒疾病的抗性、抗蟲性、雄性能育性的恢復、改良的脂肪酸或碳水化合物代謝和提高的營養(yǎng)質量。這些包含通常通過細胞核遺傳的基因。
[0043]可以應用直接選擇，其中單個基因座作為顯性性狀發(fā)揮作用。選擇用于育種的甘藍植物不一定取決于植物的表型，而可以相反地基于遺傳研究。例如，可以利用與目標性狀緊密遺傳連鎖的適當?shù)倪z傳標志物。這些標志物之一可用于鑒別特定雜交的后代中某性狀的存在或不存在，以及可用于選擇用于繼續(xù)育種的后代。該技術通常稱為標志物輔助育種。能夠鑒別植物中目標性狀的相對存在或不存在的任何其他種類的遺傳標志物或其他試驗也可以用于育種目的。
[0044]標志物輔助選擇的程序對于給定性狀的滲入特別有用。根據(jù)本發(fā)明可用的公知的遺傳標志物類型包括但不是必定限于，簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)、酶切擴增多態(tài)性序列(CAP)、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)、DNA擴增指紋(DAF)、序列特征性擴增區(qū)域(SCAR)、任意引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0045]B.通過遺傳工程而源自本發(fā)明植物的植物
[0046]可通過回交引入以及直接引入植物中的許多有用的性狀是可通過遺傳轉化技術引入的那些。因此遺傳轉化可用于將選定的轉基因插入本發(fā)明的蕓苔屬植物中，或者，可用于制備可通過回交引入的轉基因。轉化植物(包括蕓苔屬)的方法是本領域技術人員所熟知的。
[0047]用于轉化植物細胞的載體不受限制，只要所述載體可以在細胞中表達插入的DNA。例如，可以使用包含用于在蕓苔屬細胞中組成型基因表達的啟動子(例如花椰菜花葉病毒35S啟動子)和可通過外部刺激誘導的啟動子的載體。適當?shù)妮d體的實例包括PBI 二元載體。載體待引入其中的“蕓苔屬細胞”包括各種形式的蕓苔屬細胞，例如培養(yǎng)的細胞懸液、原生質體、葉切片和愈傷組織。
[0048]可將載體通過已知方法引入蕓苔屬細胞中，例如聚乙二醇法、聚陽離子法、電穿孔法、土壤桿菌介導的轉移、粒子轟擊和原生質體DNA直接攝取。
[0049]為通過電穿孔法實現(xiàn)轉化，可以使用易碎組織例如細胞的懸浮培養(yǎng)物或胚胎發(fā)生愈傷組織，或可以直接轉化未成熟胚或其他組織化的組織。在該技術中，可以通過將細胞暴露于果膠降解酶(果膠裂解酶)或以受控方式機械損傷組織來部分降解所選細胞的細胞壁。[0050]將轉化DNA片斷遞送到植物細胞的一種有效方法是微粒轟擊。在該方法中，將顆粒用核酸包被并通過推進力遞送入細胞中。示例性的顆粒包括由鎢、鉬和優(yōu)選金組成的那些。對于轟擊，懸浮中的細胞在過濾器或固體培養(yǎng)基上濃縮?；蛘?，可以將未成熟胚胎或其他靶細胞設置在固體培養(yǎng)基上。待轟擊的細胞可以以適當?shù)木嚯x定位在微粒停止板(macroprojectile stopping plate)下。微粒轟擊技術是可廣泛應用的，且可用于有效地轉化任何植物品種。
[0051]農桿菌介導的轉移是用于將基因座引入植物細胞的另一種能廣泛應用的系統(tǒng)。該技術的優(yōu)點是可以將DNA引入整個植物組織中，從而不需要從原生質體再生完整植物?，F(xiàn)代的農桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌(及其他根瘤菌)中復制，從而允許方便的操作。此外，用于農桿菌介導的基因轉移的載體中的最新技術進步改進了載體中基因和限制性位點的布置以促進能夠表達各種多肽編碼基因的載體的構建。所描述的載體具有用于所插入的多肽編碼基因的直接表達的側鄰啟動子和聚腺苷酸化位點的方便的多接頭區(qū)域。另外，包含武裝和解除武裝的Ti基因的農桿菌可用于轉化。
[0052]在其中農桿菌介導的轉化是有效的那些植物株系中，其由于基因座轉移的易實現(xiàn)和限定的性質而是特別選擇的方法。使用農桿菌介導的植物整合型載體來將DNA引入植物細胞中是本領域熟知的(美國專利第5，563,055號)。例如，美國專利第5，349，124描述了采用農桿菌介導的轉化來轉化植物細胞的方法。通過插入具有編碼全長B.t.毒素蛋白質的DNA編碼序列(其表達對于鱗翅目幼蟲毒性的蛋白質)的嵌合基因，該方法使得植物具有對這種昆蟲的抗性。
[0053]許多啟動子能用于任何目標基因的植物基因表達，所述目標基因包括但不限于，選擇標記、可評分標志物(scorable marker)、用于害蟲耐受、疾病抗性、營養(yǎng)增強的基因和任何其他的具有農藝學意義的基因。用于蕓苔屬植物基因表達的組成型啟動子的實例包括但不限于，花椰菜花葉 病毒(CaMV) P-35S啟動子(其在大多數(shù)植物組織(包括單子葉植物)中賦予組成型的高水平表達)、CaMV35S啟動子的連續(xù)重復形式、增強的35S啟動子(P-e35S)、胭脂堿合酶啟動子、章魚堿合酶啟動子；和如美國專利第5，378，619號描述的玄參花葉病毒(P-FMV)啟動子和增強型FMV啟動子(P-eFMV)(其中P-FMV的啟動子序列串聯(lián)重復)、花椰菜花葉病毒19S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃斑駁病毒啟動子和已知在植物細胞中表達的其他植物DNA病毒啟動子。
[0054]示例性的可引入本發(fā)明植物中的核酸包括例如，來自另一物種的DNA序列或基因，或甚至來源于或存在于相同物種中但通過遺傳工程方法而不是傳統(tǒng)的繁殖或育種技術引入受體細胞中的基因或序列。然而，術語“外源”也用來指通常不存在于正轉化的細胞中或也許僅僅不是以如在轉化DNA片斷或基因中發(fā)現(xiàn)的形式、結構等存在的基因，或者正常存在的且期望以不同于天然表達模式表達(例如過表達)的基因。因此，術語“外源”基因或DNA用來指引入受體細胞中的任何基因或DNA片斷，不管類似的基因是否可能已經(jīng)存在于這種細胞中。外源DNA中所包含的DNA的種類可以包括已經(jīng)存在于植物細胞中的DNA、來自另一種植物的DNA、來自不同生物體的DNA或外部產(chǎn)生的DNA，例如包含基因的反義信使的DNA序列，或編碼合成或修飾形式的基因的DNA序列。
[0055]成百上千的不同基因是已知的且可潛在地引入根據(jù)本發(fā)明的蕓苔屬植物中?？梢赃x擇以引入蕓苔屬植物可的特定基因和相應的表型的非限制性實例包括用于昆蟲耐受性(如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis (B.t.))基因)，害蟲耐受性(例如用于真菌疾病控制的基因)，除草劑耐受性(例如賦予草甘磷耐受性的基因)，和用于品質改進例如產(chǎn)量、營養(yǎng)增強、環(huán)境或應激耐受性、或任何植物生理、生長、發(fā)育、形態(tài)學或植物產(chǎn)品中的期望變化的一種或多種基因。例如，結構基因將包括賦予昆蟲耐受性的任何基因，包括但不限于芽胞桿菌昆蟲控制蛋白質基因，如W099 / 31248所描述，其通過引用方式全部合并于此；如美國專利第5，689，052所描述，其通過引用方式全部合并于此；如美國專利5，500，365和5，880，275所描述，其通過引用方式全部合并于此。在另一個實施方式中，所述結構基因可以賦予除草劑草甘磷耐受性，如通過包括但不限于如美國專利第5，633，435 (其通過引用方式全部合并于此)所描述的農桿菌菌株CP4草甘磷抗性EPSPS基因(aroA:CP4)或如美國專利第5，463，175 (其通過引用方式全部合并于此)所描述的草甘磷氧化還原酶基因(GOX)的基因所賦予的。
[0056]或者，DNA編碼序列可以通過編碼例如經(jīng)由反義或共抑制介導的機制引起內源基因表達的靶向抑制的非翻譯RNA分子來影響這些表型。RNA也可以是經(jīng)工程化以切割所需內源mRNA產(chǎn)物的催化性RNA分子(即核酶)。因此，產(chǎn)生表達目標表型或形態(tài)學改變的蛋白質或mRNA的任何基因能用于實施本發(fā)明。
[0057]D.定義
[0058]在說明書和本文的表格中使用了許多術語。為了提供對說明書和權利要求書的明確和一致的理解，提供以下定義:
[0059]等位基因:基因座的任何一種或多種可選形式，所有該等位基因與一種性狀或特性有關。在二倍體細胞或生物體中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體上的相應基因座。
[0060]回交:育種者將 雜種后代(例如第一代雜種(Fl))與雜種后代的親本之一重復雜交的過程?；亟豢捎糜趯碜砸环N遺傳背景的一種或多種單基因座轉化引入另一種遺傳背景中。
[0061]栽培品種:適于消費并滿足商業(yè)栽培要求的甘藍品種。一個實例是花椰菜品種。除植物本身和適于消費的其部分例如頭部或葉之外，本發(fā)明包括適于繁殖的植物部分或衍生物。適于繁殖的部分的實例是器官組織，例如葉、莖、根、芽等、原生質體、體細胞胚、花粉囊、葉柄、培養(yǎng)中的細胞等。適于繁殖的衍生物例如為種子。根據(jù)本發(fā)明的植物可以以常規(guī)方式栽培或繁殖，但也可以從植物部分通過組織培養(yǎng)技術栽培或繁殖。
[0062]雜交:兩種親本植物的交配。
[0063]異花授粉:通過來自不同植物的兩個配子的結合來受精。
[0064]二倍體:具有兩套染色體的細胞或生物體。
[0065]酶:可以用作生物反應中的催化劑的分子。
[0066]Fl雜種:兩個非同基因植物雜交的第一代后代。
[0067]基因型:細胞或生物體的遺傳組成。
[0068]單倍體:具有二倍體的兩套染色體中的一套的細胞或生物體。
[0069]連鎖:其中相同染色體上的等位基因比它們的轉移是獨立的情況下所預期的隨機情況趨于更頻繁地一起分離的現(xiàn)象。
[0070]標志物:可容易檢測的表型，優(yōu)選以共顯性形式(二倍體雜合體中基因座上的兩個等位基因可容易地檢測)遺傳，沒有環(huán)境變異成分，即，遺傳力為I。
[0071]表型:細胞或生物體的可檢測特征，該特征是基因表達的表現(xiàn)。
[0072]數(shù)量性狀位點(QTL):數(shù)量性狀位點(QTL)是指在某種程度上控制通常連續(xù)分布的可用數(shù)字表示的性狀的基因位點。
[0073]重組事件理解為是指減數(shù)分裂交換。
[0074]再生:從組織培養(yǎng)發(fā)育成植物。
[0075]自花授粉:花粉從花粉囊轉移至同一植物的柱頭。
[0076]單基因座轉化的(轉化)植物:通過稱為回交的植物育種技術開發(fā)的植物，其中恢復了花椰菜品種基本上所有所需的形態(tài)學和生理特征，除經(jīng)由回交技術和/或通過遺傳轉化轉移入該品種中的單基因座的特征之外。
[0077]實質上等同:當比較時，未顯示與平均值的統(tǒng)計學顯著差異(例如，P=0.05)的特征。
[0078]組織培養(yǎng)物:包含相同或不同種類的分離細胞或組織化為植物部分的這種細胞的集合的組合物。
[0079]轉基因:包含已通過轉化引入花椰菜植物的基因組中的序列的基因位點。
[0080]盡管前述發(fā)明已經(jīng)為明確和理解目的較詳細地通過例證和實例的方式進行了描述，但很明顯，可在本發(fā)明范圍內實施某些變化和改變，本發(fā)明僅由所附的權利要求的范圍限制。
[0081]本文引用的所有參考文獻以引用方式明確地合并于此。
[0082]E.保藏信息
[0083]保藏由花椰菜雜種RX05991199的至少2500粒種子組成，其包括本文所述的來自甘藍麥的Myb28等位基因和來自甘藍的ELONG等位基因的降低的基因滲入。該保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209USA進行。該保藏指定ATCC登錄號PTA-13165。保藏日期是2012年8月24日。在本申請未決期間按要求向有資格的人提供獲得該保藏的權利。該保藏將在ATCC保藏機構(其是公共保藏機構)保藏30年或最新要求之后的5年的時間，或對于本專利的可實施期限，以較長者為準，且如果在該時期期間為非存活的，則將進行替換。 申請人:不豁免對本專利或任何其他形式的品種保護授予的其權利的任何侵犯，包括植物品種保護條例(7U.S.C.2321etseq.)。
實施例
[0084]實施例1
[0085]具有改進的MSB特征的親本品系的開發(fā)
[0086]本發(fā)明的一種益處是可以產(chǎn)生包含本發(fā)明的降低的基因滲入的親本品系，其中所述品系和由其衍生的雜種具有增加的MSB / MSP比例和/或MSB表達的較高穩(wěn)定性。這種包含Myb28 / ELONG降低的基因滲入的花椰菜品系的開發(fā)可概括如下:
[0087]將由于存在來自甘藍麥的Myb28和ELONG基因座而具有增加的植物化學MSP(屈曲花苷)水平的品系 FT69 (Mithen 等，2003 ；Theor.Appl.Genet.，106:727-734)與稱為 BR9的育種品系雜交。將所形成的后代與來自Ironman(BRM56-3905SI)的雄性親本雜交。Fl子代在Wageningen選擇試驗中重復生長。從稱為408、409、410、411和412的地塊中，選擇89株植物分析屈曲花苷(MSP)和蘿卜硫苷(MSB)。選擇具有最高MSB的六株植物。
[0088]將所有6株植物自交并與輪回親本BRM56-3905SI回交。6個自交和6個BCl在Wageningen的的重復選擇試驗中種植。每個BCl (其中BC=回交)具有2個地塊，其中24株植物/地塊。從這12個地塊中，選擇大部分與輪回親本類似的總共84株植物。來自這些選擇的頭部用于MSP和MSB分析。留下七株具有最高MSB的植物用于進一步的自交和BC。將所有7株BCl植物自交并與輪回親本(BRM56-3905SI)回交。播種自交和5個BC2群體并在Wageningen秋季重復選擇試驗中選擇。選擇大部分與輪回親本類似的總共73株植物，并用于MSP / MSB分析。留下八株具有最高MSB水平的BC2植物用于進一步的自交和BC。
[0089]將所有8株BC2植物自交并與輪回親本(BRM56-3905SI)回交。獲得四株BC3并在Wageningen以1-4復制種植。最接近輪回親本的47株植物用于MSP / MSB分析。留下7株具有最高MSB水平的BC3植物用于進一步的自交和BC。將所有7株BC3植物自交并與輪回親本(BRM56-3905SI)回交。獲得6株BC4，這些在選擇試驗中種植。最接近輪回親本的54株植物用于MSP / MSB分析。留下8株具有最高MSB水平的BC4植物用于進一步的自交和BC。
[0090]將所有8株BC4植物自交。7株BC4植物產(chǎn)生自交種子且BC4F2在未重復Wageningen選擇試驗中種植。選擇最接近輪回親本的37株BC4F2植物,且這些用于MSP /MSB分析。留下4株具有最高MSB水平的BC4F2植物用于進一步的自交和BC。
[0091]將所有4株BC4F2植物自交。所有4株產(chǎn)生自交種子且BC4F3在未重復選擇試驗中種植。選擇最接近輪回親本的12株BC4F3植物并用于MSP / MSB分析。留下4株具有最高MSB水平的BC4F2植物用于進一步的自交和BC。來自地塊1169 (570114)的所有選擇的植物具有同樣高的平均2.3mmo l / kg的MSB水平,或約5x標準參照品種的水平(General)。這顯示該來源具有固定用于高MSB的等位基因。
[0092]將來自1169 (BC4F3)的所有3種選擇自交。所有3株產(chǎn)生種子且它們在選擇試驗中種植。SNP13-580333(1169-1，A75-1)在類型上是最均一的，并選擇5株植物用于MSB檢查。所有5株具有同樣高的約3.2mmol / kg的MSB水平。將1169-1，也稱為BRM53-3934SI，放在組織培養(yǎng)物上用于增長和用作RX_1199(RX05991199)的雄性親本。BRM53-3934SI分析顯示它包含Myb28的降低的基因滲入，這導致能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生包含硫代葡萄糖苷的后代的親本品系，相對于具有甘藍麥ELONG基因座的植物，所述硫代葡萄糖苷包含增加的MSB /MSP比例,如下所示。
[0093]實施例2
[0094]具有增加的蘿卜硫苷的雜種花椰菜品系的分析
[0095]如表1中所示，雜交中使用不同的標準花椰菜品系作為雌性親本進行自交和與以下品種進行遠交:(1)FT69(具有來自甘藍麥的ELONG和Myb28的高屈曲花苷品系)，(2)SNP13-580333(具有來自甘藍的ELONG和來自甘藍麥的Myb28的高蘿卜硫苷品系，如上所述)，和(3) SNP88-BRM51-1210 (具有來自甘藍麥的ELONG和Myb28的高屈曲花苷品系)。如可見的，常規(guī)花椰菜品系具有相對低含量的總硫代葡萄糖苷。尤其在FT69 (428-11-69)的情況中MSB與MSP之間的比率顯示為取決于常規(guī)花椰菜雌性品系，其包含來自甘藍麥的ELONG和Myb28等位基因。相反，在所有與SNP13-580333的雜交中，大部分硫代葡萄糖苷是蘿卜硫苷。這表明降低的基因滲入在與多種不同的第二親本的雜交中穩(wěn)定地產(chǎn)生包含增加 的蘿卜硫苷的雜交品種中的益處。
[0096]
【權利要求】
1.一種甘藍植物，包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中當與缺乏Myb28等位基因的植物相比時，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷。
2.權利要求1所述的植物，其中所述植物是花椰菜植物。
3.權利要求1所述的植物，其中所述植物是近交的。
4.權利要求1所述的植物，其中所述植物是雜交的。
5.權利要求1所述的植物，其中所述植物對于來自甘藍麥的所述Myb28等位基因是純合的。
6.權利要求1所述的植物，其中所述植物對于來自甘藍麥的所述Myb28等位基因是雜合的。
7.權利要求1所述的植物，其中所述ELONG等位基因來自甘藍。
8.權利要求1所述的植物的植物部分。
9.權利要求8所述的植物部分，其中所述部分是葉、胚珠、小花、花粉、頭部或細胞。
10.產(chǎn)生權利要求1所述的植物的種子。
11.一種甘藍植物，包含染色體片斷，所述染色體片斷包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中相對于缺乏Myb28等位基因的植 物，所述片斷賦予增加的硫代葡萄糖苷，且其中包含染色體片斷的種子樣品以ATCC登錄 號PTA-13165保藏。
12.產(chǎn)生權利要求11所述的植物的種子。
13.權利要求11所述的植物的植物部分。
14.權利要求13所述的植物部分，其中所述部分是葉、胚珠、小花、花粉、頭部或細胞。
15.一種重組DNA片斷，包含來自甘藍麥的Myb28等位基因和來自甘藍的ELONG等位基因
16.權利要求15所述的DNA片斷，進一步定義為包含于細胞內。
17.權利要求15所述的DNA片斷，進一步定義為包含于種子內。
18.權利要求15所述的DNA片斷，進一步定義為包含于植物內。
19.一種用于獲得包含所需的硫代葡萄糖苷組成的蕓苔屬植物的方法，包括: (a)獲得對于來自甘藍麥的Myb28等位基因為雜合的蕓苔屬植物，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷且在植物中與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖； (b)獲得所述植物的后代；和 (c)選擇發(fā)生重組以使得所述后代包含該Myb28等位基因但不包含來自甘藍麥的ELONG等位基因的至少第一后代植物，其中由于存在Myb28等位基因而不存在來自甘藍麥的ELONG等位基因，所述后代植物具有所需的硫代葡萄糖苷組成。
20.權利要求19所述的方法，其中后代植物的選擇包括鑒別后代植物，所述后代植物(I)包含與甘藍麥中的Myb28等位基因遺傳連鎖的遺傳標志物和/或缺乏存在于所述蕓苔屬植物中相應基因座上的遺傳標志物，和(2)缺乏與來自甘藍麥的ELONG等位基因遺傳連鎖的遺傳標志物和/或包含存在于來自所述蕓苔屬植物的相應基因座上的遺傳標志物。
21.權利要求20所述的方法，其中后代植物的選擇包括檢測與SEQID NO:1和SEQ IDNO:2的互補序列側鄰的所述植物基因組中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性。
22.權利要求21所述的方法，其中(a)所述等位基因通過基于PCR的方法采用寡核苷酸引物對來檢測。
23.權利要求20所述的方法，其中后代植物的選擇包括檢測圖5所示的所述后代植物中的多態(tài)性。
24.權利要求19所述的方法，其中所述蕓苔屬植物是甘藍植物。
25.通過權利要求19所述的方法生產(chǎn)的植物或其后代，包含所述Myb28等位基因但不包含來自甘藍麥的ELONG等位基因。
26.權利要求25所述植物的部分，所述部分選自細胞、種子、根、莖、葉、頭部、花和花粉。
27.一種用于生產(chǎn)具有增加的硫代葡萄糖苷含量的雜交甘藍植物的方法，包括將第一甘藍親本植物與不同基因型的第二甘藍植物雜交，其中所述第一親本植物包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因，其中相對于缺乏Myb28等位基因的植物，所述Myb28等位基因賦予增加的硫代葡萄糖苷。
28.權利要求27所述的方法，進一步包括產(chǎn)生多種雜交甘藍植物，包括將第一甘藍親本植物與不同基因型的多種第二甘藍植物雜交。
29.—種生產(chǎn)具有所需的增加的硫代葡萄糖苷含量的甘藍植物的方法，包括將包含來自甘藍麥的Myb28等位基因且缺乏來自甘藍麥的與所述Myb28等位基因遺傳連鎖的ELONG等位基因的染色體片斷滲入所述植物中，其中相對于缺乏所述片段的植物，片斷賦予所需的硫代葡萄糖苷含量，其中包含所述染色體片段的種子樣品以ATCC登錄號PTA-13165保藏。
【文檔編號】A01H1/02GK103704143SQ201310429742
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權日:2012年9月13日
【發(fā)明者】F·G·范登博施, G·N·科里瓦爾, R·F·米森 申請人:塞米尼斯蔬菜種子公司, 植物生物科學有限公司