液氮直入式細胞程序降溫盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液氮直入式細胞程序降溫盒，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。該裝置包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個管槽，盒體外層主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000℃條件下對304不銹鋼進行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，防止液氮的滲入。本發(fā)明具有三大優(yōu)勢：（1）可以直接降溫到-196℃，不用轉(zhuǎn)移細胞，適合長期凍存細胞；（2）無需異丙醇，屬于無損耗永久使用品；（3）分層設(shè)計，即使短暫取(30min)出都可以保證細胞溫度低于-80℃。
【專利說明】液氮直入式細胞程序降溫盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種液氮直入式細胞程序降溫盒，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]在生物【技術(shù)領(lǐng)域】，在低于_70°C的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70°C的超低溫條件，_196°C可以長期保存)，并在此溫度下對其長期保存的過程。微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。
[0003]液氮溫度(_196°C)是目前最佳的冷凍保存溫度。在_196°C時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在_196°C下均可保存十年以上。
[0004]冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化:當(dāng)細胞被冷至_5°C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5~_15°C之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細胞內(nèi)水分子為了和細胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同:如果冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？?即超快速冷凍)，則細胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)(玻璃化冷凍)。Luyet (1973)證實液體的凝固可分為兩種形式:一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。
[0005]不同細胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的最適冷凍速率分別為1.60C min、7°C /min和200°C /min。細胞與細胞之間的最適冷凍速率可在1.6°C~3000C /min，故對一種細胞進行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。
[0006]目前，市場上已有的主流程序降溫盒，或稱細胞凍存盒或稱梯度降溫凍存盒，是由美國Nalgene公司生產(chǎn)的5100-0001，屬于進口品牌類產(chǎn)品。該程序降溫盒或稱細胞凍存盒為成功冷凍保存細胞提供精確和良好重復(fù)性的冷卻率:_1°C /min的冷凍率降溫到_80°C。屬于耗材類，需要加入藥品異丙醇，異丙醇屬于揮發(fā)耗材?？梢詢龃?8管細胞。且只能冷凍到-80°C，如轉(zhuǎn)移到液氮細胞會有一定影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種液氮直入式細胞程序降溫盒，以便采用合理的凍存盒材料和特殊的結(jié)構(gòu)，保證合適的降溫曲線。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0009]一種液氮直入式細胞程序降溫盒，包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個管槽，其中，盒體外層主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。
[0010]上述液氮直入式細胞程序降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，能有效的防止液氮的滲入。
[0011]該發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明具有三大優(yōu)勢:(I)可以直接降溫到-196°C，不用轉(zhuǎn)移，適合長期凍存細胞；(2)無需異丙醇，屬于無損耗永久使用品；(3)分層設(shè)計，即使短暫取(30min)出都可以保證細胞溫度低于_80°C。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明實施例中降溫盒結(jié)構(gòu)截面圖。
[0013]圖2是本發(fā)明實施例中降溫盒結(jié)構(gòu)俯視圖。
[0014]圖3是本發(fā)明實施例中降溫盒降溫曲線圖。
[0015]圖4是本發(fā)明實施例中使用本發(fā)明裝置細胞復(fù)蘇后Ins-1細胞系存活率對比圖。
[0016]圖5是本發(fā)明實施例中使用本發(fā)明裝置細胞復(fù)蘇后Cos-7細胞系存活率對比圖。
[0017]圖中標(biāo)記說明:1、盒蓋；2、盒身；3、盒體外層；4、管槽；5、螺紋?！揪唧w實施方式】[0018]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發(fā)明。
實施例[0019]如圖1、圖2所示的液氮直入式細胞程序降溫盒，包括盒身2和盒蓋1，盒身2內(nèi)設(shè)置有多個管槽4，盒體外層3主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽4采用白色高密度聚乙烯材料；填充物采用泡沫塑料。上述液氮直入式細胞程序降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層3為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進行抽真空和封焊而制成，盒身2與盒蓋I通過螺紋5密合，并在盒蓋I上加了硅膠密封圈，能有效的防止液氮的滲入。管槽4部分材料為白色高密度聚乙烯，內(nèi)部填充的泡沫塑料質(zhì)輕保溫性較好。[0020]圖3是采用本降溫盒測試所得的降溫曲線(重復(fù)了 5次的結(jié)果)。除了少數(shù)細胞凍存需要超速冷凍，大多數(shù)細胞凍存的關(guān)鍵在于細胞在20°C到-80°C下降呈線性關(guān)系，并且降溫速度在1-10°C /min。本實施例中，細胞在20°C到_80°C下降呈線性關(guān)系大約是2.6-2.7°C/min的降溫速度。符合多數(shù)細胞的凍存要求。采用用液氮低溫探頭在降溫盒子內(nèi)部測得的在液氮中，從室溫能降到液氮溫度(_196°C左右)，如圖3所示。[0021]下面可以繼續(xù)舉例采用本裝置所取得的試驗效果，具體試驗過程及結(jié)果如下:
(一)細胞培養(yǎng):
1、培養(yǎng)基(4°C保存，使用前在37°C水浴中溫育):
INS-1 細胞系:1) RPMI 1640 (含有 IlmM 的 D-glucose) ;2) Fetal Bovine Serum(滅活)+10ml ；3) Sodium Pyruvate (lOOmM,使細胞增加內(nèi)源性CO2的產(chǎn)生)加入1% ；4)β -Mercaptoethanol (自由基的清除劑)加入0.1% ；
C0S7細胞系:標(biāo)準(zhǔn)的DMEM完全培養(yǎng)基，加入10%血清及1%的青霉素-鏈霉素雙抗；
2、Poly-L-Lydine:0.01mg/ml ；
3、0.25% Trypsin-EDTA (胰酶)(一 20°C保存，使用前在室溫自然溶解)；
4、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(4°C保存，使用前在37°C水浴中溫育)；
137mmol/L NaCl (8g) ；2.7mmol/L KCl (0.2g) ; IOmmo 1/L Na2HPO4 (1.44g)；2mmol/L KH2PO4 (0.24g);在IL三蒸水中加入四種成分，調(diào)pH 7.4，滲透壓300m0sm,過濾保存。[0022](二)細胞凍存:
1、凍存液:7%DMS0；13% FBS血清；80%培養(yǎng)基；液氮直入式細胞程序降溫盒；Nalgene5100-0001程序降溫盒:加入250ml異丙醇；
2、材料:
(1)生長良好的培養(yǎng)細胞；
(2)新鮮培養(yǎng)基；
(3)DMSO (Sigma D-2650)；
(4)無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)；
(5)0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)；(6)血球計數(shù)盤與蓋玻片；
(7)等速降溫機(KRYO10 Series II)；
3、步驟:
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。
[0023](2)凍存開始將培養(yǎng)瓶中的原液倒掉，用5mlPBS洗2次。
[0024](3)加入Iml胰酶，放在37°C細胞培養(yǎng)箱里消化細胞，加入5ml細胞培養(yǎng)液終止消化，并將其完全吸入15ml離心管中；
(4) 15ml離心管離心1000rpm.5min.棄上清，加入IOml冷凍保存溶液，使細胞濃度控制為1-5 X 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，I ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
[0025](5)傳統(tǒng)冷凍保存方法:用Nalgene公司生產(chǎn)的5100-0001程序降溫盒降溫到_80°C，在手動轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
[0026](6)本實施例中的冷凍方法(新方法):用液氮直入式細胞程序降溫盒直接凍存。
[0027]如圖4、圖5所示的細胞復(fù)蘇后Ins-1和Cos-7細胞系存活率對比圖(重復(fù)了 5次的結(jié)果)，本發(fā)明所采用的方法比傳統(tǒng)的方法更有效率，存活率更高。
[0028]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種液氮直入式細胞程序降溫盒，包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個管槽，其特征在于:所述盒體外層主體材料采用304不銹鋼，所述盒體內(nèi)密封件采用硅膠，所述管槽采用白色高密度聚乙烯材料；所述管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液氮直入式細胞程序降溫盒，其特征在于:所述降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，防止液氮的滲入。
【文檔編號】A01N1/02GK103548815SQ201310576212
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】王意, 胡麗丹 申請人:王意