一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法
【專利摘要】一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法。本發(fā)明公開了一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液尿素增效劑的方法，應(yīng)用分子生物學(xué)手段提取光合菌、乳酸菌、放線菌中能使用海藻中不溶性大分子分解為可溶性小分子的遺傳基因分子，與酵母菌細(xì)胞質(zhì)連接重組DNA基因組，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，構(gòu)建出一株基因工程菌，提高了微生物的生物活性，增強(qiáng)了分解海藻大分子的能力。采用了高密度發(fā)酵工藝，提高了發(fā)酵強(qiáng)度，縮短了發(fā)酵時(shí)間。采用微濾膜和超濾膜分離技術(shù)，完整的保留了海藻中的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，使得海藻提取液與尿素結(jié)合成網(wǎng)絡(luò)載肥體系，延緩尿素的分解，并為農(nóng)作物提供多種養(yǎng)分，促進(jìn)農(nóng)作物的生長，達(dá)到尿素增效的目的。
【專利說明】一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到肥料增效劑的制備方法直接涉及到一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法。
技術(shù)背景
[0002]目前我國農(nóng)業(yè)普遍施肥量大，肥效利用率低，特別是以尿素為主的氮肥利用率在25%以下。大量氮肥分解揮發(fā)或隨水流失又對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染。近二十幾年來農(nóng)業(yè)和肥料專家研究了包膜控釋肥、抑制劑緩釋肥、添加多肽肥、對(duì)抑制尿素分解延長肥效期，節(jié)省肥料起到積極作用，但普遍存在成本高、增加營養(yǎng)少等缺點(diǎn)。
[0003]海藻提取液極大地保留了天然活性組分，含有大量的非含氮有機(jī)物，陸地植物無法比擬的豐富的K、Ca、Mg、Zn、I等40多種礦物質(zhì)和維生素，特別含有海藻中的海藻多糖、藻朊酸、高度不飽和脂肪酸和多種天然植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很高的生物活性，可刺激植物體內(nèi)非特異性因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素平衡。在尿素中添加海藻提取液，在氫鍵的作用下，海藻提取物和尿素形成α-螺旋或高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的載肥體，不僅能延緩尿素的分解，更重要的是為農(nóng)作物提供多種養(yǎng)分，促進(jìn)作物生長，因此說海藻提取液是當(dāng)今最好的尿素增效劑。國內(nèi)外曾采用化學(xué)水解法和菌群堆積發(fā)酵法。化學(xué)水解法嚴(yán)重破壞海藻內(nèi)源物質(zhì)的活性，營養(yǎng)成分損失嚴(yán)重；菌群堆積發(fā)酵法發(fā)酵時(shí)間長達(dá)10天左右，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，尋求一種高效簡便易 行的海藻提取液的制備方法，是亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是提供一種高效、簡便、完整保留海藻天然活性的海藻液提取方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑生產(chǎn)方法步驟如下:
基因工程菌的構(gòu)建:選擇對(duì)海藻發(fā)酵能降解海藻大分子為小分子的光合菌、乳酸菌為供體，提取其細(xì)胞中的遺傳基因組DNA，選擇酵母菌提取其細(xì)胞質(zhì)作為載體，連接重組質(zhì)粒DNA基因組，選擇大腸桿菌為宿主受體，將重組質(zhì)粒DNA基因植入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建基因工程菌。
[0006]基因工程菌的培育篩選:將構(gòu)建基因的工程菌細(xì)胞植入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每培養(yǎng)12h后篩選出生長態(tài)勢(shì)好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，如此培育篩選五代，篩選出的優(yōu)良菌種。
[0007]三級(jí)種子培養(yǎng):篩選出的優(yōu)良菌株在培養(yǎng)基培養(yǎng)后，移種到搖床培養(yǎng)8小時(shí)移種到200L —級(jí)種子罐培養(yǎng)10h，再移種到1000L 二級(jí)種子罐培養(yǎng)12h。
[0008]兩級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵:由1000L種子罐移種到IOt發(fā)酵罐發(fā)酵16小時(shí)，將IOt罐發(fā)酵液移植到20t發(fā)酵罐采用流加補(bǔ)料連續(xù)發(fā)酵30h。
[0009]微濾膜濾除固體雜質(zhì):將發(fā)酵液用泵打入微濾膜分離器濾除固體雜質(zhì)。
[0010]超濾膜濾除菌絲:除去固體雜質(zhì)的發(fā)酵液用泵打入超濾膜濾除菌絲。[0011]離子交換除鹽:將濾除菌絲的濾清液用泵打入離子交換器除鹽。
[0012]負(fù)壓蒸發(fā)濃縮:除鹽后的海藻液進(jìn)行負(fù)壓蒸發(fā)濃縮得到海藻液。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式:三級(jí)種子培養(yǎng)中培養(yǎng)基的配制比例為:純凈水800g/L、蛋白胨 2.6g/L、酵母粉 2g/L、KH2PO3 2g/L, K2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO42g/L。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式:兩級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵中發(fā)酵液配方為:海藻粉200目25質(zhì)量份，葡萄糖5質(zhì)量份，無機(jī)鹽1質(zhì)量份，豆質(zhì)蛋白2質(zhì)量份，水77質(zhì)量份。發(fā)酵溫度45°C，PH值為6，溶氧比:1:4.【專利附圖】

【附圖說明】:
附圖1示出了本發(fā)明一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法的工藝流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】 [0015]附圖1示出了本發(fā)明一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法的工藝流程圖。下面結(jié)合附圖做進(jìn)一步說明。
[0016]基因工程菌的構(gòu)建1:選擇對(duì)海藻發(fā)酵能分解海藻不溶性大分子為可溶性小分子的光合菌、乳酸菌、放線菌作為供體菌，將選擇的供體菌在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，從供體光合菌、乳酸菌、放線菌細(xì)胞中獲得具有分解海藻特性的遺傳基因分子，把酵母菌的細(xì)胞質(zhì)切割作為載體，將獲得的光合菌、乳酸菌遺傳基因與載體結(jié)合起來，將重組的遺傳基因組導(dǎo)入大腸桿菌的細(xì)胞中，遺傳基因在大腸桿菌中表達(dá)，這樣對(duì)構(gòu)建的新的微生物細(xì)胞稱之基因工程菌。
[0017]基因工程菌的培育篩選2:制備培養(yǎng)基:純凈水800g/L、蛋白胨2.6g/L、酵母粉2g/L,KH2PO3 2g/L,K2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO4 2g/L，攪拌均勻，然后將構(gòu)建的基因工程菌植入培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后取樣，選取長勢(shì)良好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，淘汰長勢(shì)弱的菌株，如此連續(xù)培養(yǎng)篩選五代，最后選出優(yōu)良菌株。
[0018]三級(jí)種子培養(yǎng)3:將選出的優(yōu)良菌株植入搖床培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)后，移種到200L種子罐培養(yǎng)10小時(shí)，再移種到1000L種子罐培養(yǎng)12小時(shí)，三級(jí)培養(yǎng)溫度45°C，PH值為6，溶氧比:1:4，移種時(shí)菌種生長繁殖期均處于對(duì)數(shù)期。
[0019]兩級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵4:發(fā)酵液的制備:海藻粉200目25質(zhì)量份，葡萄糖5質(zhì)量份，無機(jī)鹽I質(zhì)量份，豆質(zhì)蛋白2質(zhì)量份，水77質(zhì)量份。將發(fā)酵液分別裝入10t、20t發(fā)酵罐中，將種子液移種到IOt發(fā)酵罐，發(fā)酵16小時(shí)，菌種生長繁殖期仍處于對(duì)數(shù)期，種子量150g/L，將一級(jí)發(fā)酵液倒入二級(jí)發(fā)酵罐，采取流加補(bǔ)料，將發(fā)酵液濃度保持在30%，種子量保持150g/L，發(fā)酵溫度45 °C，PH值為6，溶氧比:1:4.，發(fā)酵時(shí)間30小時(shí)。
[0020]微濾膜濾除固體雜質(zhì)5:用泵將發(fā)酵液用泵打入微濾膜分離器，發(fā)酵液一微濾膜分離器上封頭進(jìn)入每根膜管清液透過膜孔在分離器圓筒內(nèi)富集后從清液出口排出，固體雜質(zhì)以下封頭雜質(zhì)出口排出。
[0021]超濾膜濾除菌體6:微濾膜濾除的清液用泵打入超濾膜分離器，液體從上封頭進(jìn)入每根超濾膜管，海藻提取液滲透膜壁，在筒體內(nèi)富集后從濾清液出口排出，大分子菌絲阻隔在管內(nèi)從下封頭菌絲出口排出。[0022]離子交換除鹽7:濾清液用泵打入陽離子交換器Ca、Mg、Na等陽離子被吸收，再通過陰離子交換器乳酸根、硫酸根等陰離子被吸收，達(dá)到除鹽的目的。
[0023]負(fù)壓蒸發(fā)濃縮8:除鹽后的濾清液用泵打入三效蒸發(fā)機(jī)組，在負(fù)壓-0.99MPa,溫度80°C下蒸發(fā)濃縮到90%的濃度，得到海藻提取液。
[0024]本發(fā)明的主要特點(diǎn)是:應(yīng)用分子生物學(xué)的手段構(gòu)建的基因工程菌集光合菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌在海藻中發(fā)酵能分解海藻不溶性大分子的特征于一體，在大腸桿菌中表達(dá)，大大提高了生物活性，增強(qiáng)了分解海藻大分子的能力，采用了高密度發(fā)酵工藝，提高了發(fā)酵強(qiáng)度，縮短了發(fā)酵時(shí)間，采用微濾膜和超濾膜分離技術(shù)，完整的保留了海藻中的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，使得海藻提取液與尿素結(jié)合成網(wǎng)絡(luò)載肥體系，延緩尿素的分解，并為農(nóng)作物提供多種養(yǎng)分，促進(jìn)農(nóng)作物的生長，達(dá)到尿素增效的目的。
【權(quán)利要求】
1.一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法，其特征在于該方法的步驟如下: 基因工程菌的構(gòu)建:選擇對(duì)海藻發(fā)酵能降解海藻大分子為小分子的光合菌、乳酸菌為供體，提取其細(xì)胞中的遺傳基因組DNA，選擇酵母菌提取其細(xì)胞質(zhì)作為載體，連接重組質(zhì)粒DNA基因組，選擇大腸桿菌為宿主受體，將重組質(zhì)粒DNA基因植入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建出基因工程菌； 基因工程菌的培育篩選:將構(gòu)建的基因工程菌細(xì)胞植入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每培養(yǎng)12h后篩選出生長態(tài)勢(shì)好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，如此培育篩選五代，篩選出的優(yōu)良菌種； 三級(jí)種子培養(yǎng):篩選出的優(yōu)良菌株在培養(yǎng)基培養(yǎng)后，移種到搖床培養(yǎng)8小時(shí)移種到200L —級(jí)種子罐培養(yǎng)10h，再移種到1000L 二級(jí)種子罐培養(yǎng)12h ； 兩級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵:由1000L種子罐移種到IOt發(fā)酵罐發(fā)酵16小時(shí)，將IOt罐發(fā)酵液移植到20t發(fā)酵罐采用流加補(bǔ)料連續(xù)發(fā)酵30h ； 微濾膜濾除固體雜質(zhì):將發(fā)酵液用泵打入微濾膜分離器濾除固體雜質(zhì)； 超濾膜濾除菌絲:除去固體雜質(zhì)的發(fā)酵液用泵打入超濾膜濾除菌絲； 離子交換除鹽:將濾除菌絲的濾清液用泵打入離子交換器除鹽； 負(fù)壓蒸發(fā)濃縮:除鹽后的海藻液進(jìn)行負(fù)壓蒸發(fā)濃縮得到海藻液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法，其特征在于:三級(jí)種子培養(yǎng)中培養(yǎng)基的配制:純凈水800g/L、蛋白胨2.6g/L、酵母粉2g/L、KH2P03 2g/UK2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO4 2g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基因工程菌發(fā)酵提取海藻液肥料增效劑的方法，其特征在于:兩級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵中發(fā)酵液配方為:海藻粉200目25質(zhì)量份，葡萄糖5質(zhì)量份，無機(jī)鹽I質(zhì)量份，豆質(zhì)蛋白2質(zhì)量份，水77質(zhì)量份，發(fā)酵溫度45°C，PH值為6，溶氧比:1:4。
【文檔編號(hào)】C05G3/00GK103833461SQ201310616623
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】王愛云, 陳吉強(qiáng), 劉云 申請(qǐng)人:山東潤銀生物化工股份有限公司