一種抗奶牛熱應激的飼料添加劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種抗奶牛熱應激的飼料添加劑。釀酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae,Sc)NAU‐ZH‐GY1可在制備抗奶牛熱應激的飼料添加劑中的應用。本發(fā)明在高滲條件下通過連續(xù)補料方式發(fā)酵生產出富含甘油、酵母活菌，以及豐富的氨基酸、維生素等微生物代謝產物的抗奶牛熱應激的飼料添加劑，能協(xié)同發(fā)揮甘油和酵母菌的雙重功效，可顯著提高熱應激條件下奶牛的泌乳量、4%乳脂校正乳產量和乳脂率，提高血糖濃度，降低乳中體細胞數、非酯化脂肪酸和尿素氮的濃度，為奶牛補充能量，減緩體重的降低，增強抗氧化能力，降低HSP70mRNA水平，有效緩解了奶牛的熱應激。
【專利說明】一種抗奶牛熱應激的飼料添加劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗奶牛熱應激的飼料添加劑，屬于飼料添加劑應用領域。
技術背景
[0002]我國飼養(yǎng)的奶牛以源于北歐的荷斯坦奶牛為主，經過風土馴化和長期選育形成中國荷斯坦奶牛。荷蘭氣候溫和，全年溫度在2?17°C之間，這樣的氣候使得荷斯坦奶牛耐寒，但耐熱性較差；再加上荷斯坦奶牛體型較大，單位體重的散熱面積小，被毛和體組織保溫性能好，汗腺機能不發(fā)達，皮膚蒸發(fā)散熱量少。此外，奶牛采食量大，粗飼料經過瘤胃發(fā)酵，產生大量的代謝熱，而且產奶量高，新陳代謝旺盛，增加了散熱負擔。因此中國荷斯坦奶牛是耐寒而不耐熱的動物。而我國大部分地區(qū)，尤其是長江流域及以南地區(qū)夏季不僅氣溫高，而且濕度大，持續(xù)時間長，奶牛極易發(fā)生熱應激，從而嚴重影響了荷斯坦奶牛高產性能的發(fā)揮。
[0003]奶牛的最佳產奶環(huán)境溫度為5?25°C，即溫度適中區(qū)。當氣溫高于26°C時，即表現熱應激。處于熱應激的奶牛排汗增加，體溫升高，呼吸頻率加快，體內代謝減慢，采食量下降，進而造成泌乳量和乳品質顯著降低。熱應激使機體物質代謝紊亂，內分泌改變，還會顯著降低奶牛的免疫力和繁殖性能，給奶牛造成了極大的負面影響。另外，有研究表明熱應激條件下的奶牛因能量攝入不足及維持需求增加，常會處于能量負平衡狀態(tài)。產奶量越高的奶牛，受熱應激的影響就會越大。每年夏季的高溫天氣都會給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失，我國南方地區(qū)尤其明顯。
[0004]國外主要是通過調整日糧組成、選育耐熱品種、改善環(huán)境及管理來防控奶牛熱應激綜合癥。但環(huán)境的控制和品種選育需要高額投入，費力耗時；使用高營養(yǎng)性、高品質的奶牛飼料會增加飼養(yǎng)成本，這在國內奶牛養(yǎng)殖場，特別是小型養(yǎng)殖場很難達到。而抗熱應激添加劑可直接添加到動物飼料和飲水中，操作簡便，效果突出，成為現在國內外的研究熱點。目前用于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的抗熱應激添加劑主要包括酵母培養(yǎng)物、鉻制劑、復合酶制劑、礦物質緩沖鹽類、β_胡蘿卜素、瘤胃素、脂肪酸鈣等一些化學合成類物質，都有一定效果，但某些化學藥物尤其是瘤胃素等長期使用會對奶牛產生副作用，且易殘留，給人類健康帶來潛在的危害。而酵母培養(yǎng)物是酵母菌在特定的培養(yǎng)基上經過充分發(fā)酵后形成的含酵母菌、胞外代謝產物及其殘留培養(yǎng)基的微生態(tài)制品，具有安全、無污染、無殘留，來源廣泛、成本低廉等特點，在畜牧業(yè)中具有良好的應用前景。
[0005]目前養(yǎng)殖業(yè)中所應用的甘油主要來源于生物柴油過程的副產品或工業(yè)合成，在加工過程中會引入一些重金屬或甲醇等有害物質，對奶牛食欲產生不良影響或對機體產生有害刺激。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種簡單、低成本生產的奶牛抗熱應激的飼料添加劑。[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現:
[0008]保藏號為CGMCC N0.4551 的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl在制備抗奶牛熱應激的飼料添加劑中的應用。
[0009]—種抗奶牛熱應激的飼料添加劑的生產方法，包括:
[0010]I)菌種:
[0011]保藏號為CGMCC N0.4551 的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl，為農業(yè)部允許使用的飼料級益生菌菌種；
[0012]2)培養(yǎng)基:
[0013]斜面活化培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、瓊脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；
[0014]種子培養(yǎng)基:1.5%?2.5%葡萄糖、0.5%?1.5%酵母浸膏、1.5%?2.5%蛋白胨，自然pH, 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；
[0015]生產培養(yǎng)基:25%?35%葡萄糖、0.1%?0.3%蛋白胨、0.2%?0.4%尿素、0.5%?
1.5% 玉米漿干粉、3.5% ?4% 氯化鈉、0.03% ?0.07%MgS04.7Η20、0.005% ?0.015% 氯化鈣，0.03%?0.07%硫胺素(單獨添加)，其余為水。
[0016]3)菌種的活化與種子液的獲得:
[0017]將保存在4°C的釀酒酵母菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，于20?30°C恒溫培養(yǎng)36?48h ;如此連續(xù)傳代活化2?5次后，再接種到種子培養(yǎng)基中，于28?32°C、150r/min恒溫搖床培養(yǎng)12?24h，得到釀酒酵母菌種子液。
[0018]4)生產:
[0019]將除硫胺素以外的生產培養(yǎng)基配料溶解于水中加到不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐中，115°C，高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至28?32°C，接入已過濾除菌的硫胺素溶液，然后按5?15% (v/v)的接種量接入釀酒酵母菌種子液，在罐溫為28?32°C，pH為恒定5.0?5.5，轉速為200?400r/min，通氣量為0.5m3/h，罐壓為0.02Mpa的條件下發(fā)酵，于發(fā)酵24和48h分別補料一次，共發(fā)酵72?96h，得到抗奶牛熱應激的飼料添加劑。
[0020]上述獲得的抗奶牛熱應激的飼料添加劑中含釀酒酵母菌的活菌數達到IO9CFU/mL，甘油含量為67?80g/L。
[0021]有益效果:
[0022]酵母培養(yǎng)物可以調整菌群結構，刺激瘤胃微生物生長，改變胃腸內揮發(fā)性脂肪酸的比例，增加采食量，提高飼料利用率和生產性能等。另一方面，甘油作為一種能量補充物已應用到圍產期、泌乳早期及泌乳中期的奶牛。在產前與產后添加甘油可以提高能量利用率，改善奶牛能量平衡，減輕或預防奶牛能量代謝病。因此，甘油可以緩解奶牛熱應激中的能量不足。本發(fā)明利用酵母菌可將糖轉化為甘油的原理，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，在高滲條件下通過連續(xù)補料方式發(fā)酵生產出富含甘油、酵母活菌，以及豐富的氨基酸、維生素等微生物代謝產物的發(fā)酵制品，能協(xié)同發(fā)揮甘油和酵母菌的雙重功效，可顯著提高熱應激條件下奶牛的泌乳量、4%乳脂校正乳產量和乳脂率，提高血糖濃度，降低乳中體細胞數、非酯化脂肪酸和尿素氮的濃度，為奶牛補充能量，減緩體重的降低，在一定程度上增強抗氧化能力，降低熱休克蛋白HSP70mRNA水平，有效緩解了奶牛的熱應激。
[0023]本發(fā)明中涉及的甘油是由釀酒酵母菌而來，真正實現了安全、無污染和成本低廉；并且省卻了普通甘油的提純過程。目前，國內外關于甘油和直接飼喂微生物聯(lián)合應用對奶牛熱應激的影響的研究報道較少，而對富甘油酵母菌發(fā)酵制品緩解奶牛熱應激的研究，在國內外均未見報道。
[0024]本發(fā)明在已公開專利201110057770.6生產含甘油酵母培養(yǎng)物方法的基礎上，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，且通過連續(xù)補料發(fā)酵的方式，使生產等量的甘油所需的部分原料減少，發(fā)酵時間縮減了一半，尤其是產物中甘油濃度增加了一倍，更重要的是首次通過動物試驗發(fā)現富甘油酵母菌發(fā)酵制品具有顯著緩解奶牛熱應激的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1.試驗期間奶牛泌乳量隨THI變化圖。C為對照組，Y為酵母菌組，G為甘油組，GY為抗奶牛熱應激的飼料添加劑組。
[0026]圖2.富甘油酵母菌對泌乳早期奶牛外周血淋巴細胞熱休克蛋白HSP70mRNA表達的影響。C為對照組，Y為酵母菌組，G為甘油組，GY為抗奶牛熱應激的飼料添加劑組。柱形圖代表平均數土標準誤，標有不同小寫字母表示差異顯著(P〈0.05)。
[0027]圖3.試驗期間牛舍平均溫度、濕度和溫濕度指數(THI)變化圖。
[0028]圖4.富甘油酵母菌對泌乳中期奶牛的直腸溫度(A)和呼吸頻率(B)的影響。C為對照組，Y為酵母菌組，G為甘油組，GY為抗奶牛熱應激的飼料添加劑組。柱形圖代表平均數土標準誤，標有不同小寫字母表示差異顯著(P〈0.05)。
[0029]生物材料保藏信息
[0030]NAU-ZH-GY1,分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2011 -1 - 13，保藏編號為CGMCC N0.4551。
具體實施方案
[0031]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0032]實施例1南京某奶牛場
[0033]1.抗奶牛熱應激的飼料添加劑的生產
[0034]I)菌種:
[0035]釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae, Sc)NAU -ZH- GYl,由本實驗室提供，已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號CGMCC N0.4551。
[0036]2)培養(yǎng)基:
[0037]斜面活化培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、瓊脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；
[0038]種子培養(yǎng)基:葡萄糖28g、酵母浸膏Hg、蛋白胨28g，水1.4L，自然pH，115°C，高壓蒸汽滅菌15min，備用；
[0039]生產培養(yǎng)基配料:葡萄糖42kg、蛋白胨280g、尿素420g、玉米漿干粉1.4kg，氯化鈉
5.6kg、MgSO4.7H2070g、氯化鈣14g，硫胺素70g (單獨添加)。
[0040]3)菌種的活化與種子液的獲得:
[0041]將保存在4°C的釀酒酵母菌NAU - ZH - GYl (CGMCC N0.4551)接種于斜面活化培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)36h ;如此連續(xù)傳代活化4次后，再接種到1.4L種子培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min恒溫搖床培養(yǎng)15h,得到釀酒酵母菌初級種子液。
[0042]將種子培養(yǎng)基配料葡萄糖280g、酵母浸膏140g、蛋白胨280g放入30L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐中，用水溶解至12.6L，115°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至30°C，然后將1.4L初級種子液接入罐中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:30°C ；pH:恒定5.0 ;轉速:200r/min ;通氣量:0.5mVh ;罐壓:0.02Mpa ;培養(yǎng)時間:15h，得到釀酒酵母菌次級種子液。
[0043]4)發(fā)酵:
[0044]將上述生產培養(yǎng)基配料(除硫胺素)放入300L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐中，用水溶解至124.5L，115°C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至30°C，接入已過濾除菌的硫胺素溶液1.5L，然后接入14L釀酒酵母菌次級種子液。發(fā)酵溫度:30°C ；pH:恒定5.0 ;轉速:350r/min ;通氣量:0.5mVh ;罐壓:0.02Mpa ;發(fā)酵時間:72h。在發(fā)酵24和48h各補料一次，每次加入35L已滅菌的生產培養(yǎng)基溶液(含70L溶質配料，但氯化鈉仍為35L量即1.4kg)，發(fā)酵結束，得到抗奶牛熱應激的飼料添加劑。
[0045]按上述系列方法連續(xù)發(fā)酵6次，每次發(fā)酵結束后都進行分裝，室溫20°C保存，備用。
[0046]上述獲得的抗奶牛熱應激的飼料添加劑中所含釀酒酵母菌干重15.8g/L (含活菌數 2.42X 109CFU/mL);甘油含量為 76.6g/L。
[0047]2.酵母菌飼料添加劑的生產[0048]按照生產富甘油酵母菌飼料添加劑的方法生產酵母菌飼料添加劑，與之不同的是生產酵母菌添加劑時所用的生產培養(yǎng)基配料為(200L):葡萄糖10kg、酵母浸膏500g、蛋白胨500g、尿素1kg、玉米漿干粉1.5kg，轉速為200r/min，發(fā)酵24h結束；連續(xù)發(fā)酵3次，室溫20°C保存，備用。最終得到的酵母菌飼料添加劑中所含釀酒酵母菌干重33.lg/L(含活菌數
5.31 X 109CFU/mL,不含甘油)。
[0049]3.抗奶牛熱應激的飼料添加劑飼喂高溫環(huán)境下的泌乳奶牛
[0050](I)實施動物與分組
[0051]試驗選擇40頭健康、2~4胎、體重為648±57kg、泌乳早期(60± 13天)的中國荷斯坦奶牛，根據胎次、泌乳天數和試驗前10天平均泌乳量，并考慮奶牛位置，將奶牛隨機均分為對照組C和試驗組G、Y、GY四個處理組，每組5個重復，每個重復2頭牛。對照組C飼喂基礎日糧，試驗組G、Y和GY，在此基礎上分別添加食品級甘油150g/頭?天(0.998g/g)、酵母菌添加劑IL/頭.天(相當于酵母菌33.1g/頭.天)和實施例1制備的抗奶牛熱應激的飼料添加劑2L/頭.天(相當于甘油153.2g/頭.天，酵母菌31.6g/頭.天)。試驗時間為2012年6月3日-8月8日，其中預飼期7d，正式試驗期60d。
[0052](2)日糧組成與飼養(yǎng)管理
[0053]試驗奶牛飼養(yǎng)在夏天自然高溫環(huán)境下的牛舍，飼養(yǎng)模式為雙列對尾栓系式飼養(yǎng)，自由飲水。每日早、中、晚擠奶3次(7:30，14:30和21:00 )，采用管道式擠奶。試驗采用TMR基礎日糧，每頭奶牛定欄定位飼喂，每日于擠奶后各飼喂一次。根據試驗奶牛的體況和泌乳量，參照NRC (2001)奶牛營養(yǎng)需要并結合生產實踐統(tǒng)一配制TMR基礎日糧(如表1)。每次飼喂量均保證奶牛有5%采食量的殘留，并分別按所需劑量將食品級甘油、酵母菌添加劑和實施例1制備的抗奶牛熱應激的飼料添加劑拌于晨飼中，單獨投喂。[0054]奶牛散熱方式為間歇噴淋結合吹風。每三天記錄牛舍溫度、濕度(7:00~21:00 )，計算溫濕度指數(THI)結果均高于72 (如圖1)，說明奶牛已處于熱應激條件下，其他管理按奶牛場日常管理進行。
[0055]表1試驗奶牛的基礎日糧配方和營養(yǎng)水平
【權利要求】
1.保藏號為CGMCC N0.4551 的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl在制備抗奶牛熱應激的飼料添加劑中的應用。
2.一種抗奶牛熱應激的飼料添加劑的生產方法，其特征在于包括: 1)菌種: 保藏號為 CGMCC N0.4551 的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl，為農業(yè)部允許使用的飼料級益生菌菌種； 2)培養(yǎng)基: 斜面活化培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、瓊脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； 種子培養(yǎng)基:1.5%?2.5%葡萄糖、0.5%?1.5%酵母浸膏、1.5%?2.5%蛋白胨，自然pH, 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； 生產培養(yǎng)基:25%?35%葡萄糖、0.1%?0.3%蛋白胨、0.2%?0.4%尿素、0.5%?1.5%玉米漿干粉、3.5% ?4%氯化鈉、0.03% ?0.07%MgS04.7Η20、0.005% ?0.015%氯化鈣，0.03% ?0.07%硫胺素，其余為水，其中硫胺素單獨添加； 3)菌種的活化與種子液的獲得: 將保存在4°C的釀酒酵母菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，于20?30°C恒溫培養(yǎng)36?48h ;如此連續(xù)傳代活化2?5次后，再接種到種子培養(yǎng)基中，于28?32°C、150r/min恒溫搖床培養(yǎng)12?24h，得到釀酒酵母菌種子液； 4)生產: 將除硫胺素以外的所有生產培養(yǎng)基配料溶解于水中加到不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐中，115°C，高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至28?32°C，接入已過濾除菌的硫胺素溶液，然后按5?15% (v/v)的接種量接入釀酒酵母菌種子液，在罐溫為28?32°C，pH為恒定5.0?5.5，轉速為200?400r/min，通氣量為0.5m3/h，罐壓為0.02Mpa的條件下發(fā)酵，于發(fā)酵24和48h分別補料一次，共發(fā)酵72?96h，得到抗奶牛熱應激的飼料添加劑； 上述獲得的抗奶牛熱應激的飼料添加劑中含釀酒酵母菌的活菌數達到109CFU/mL，甘油含量為67?80g/L。
3.用權利要求2所述的生產方法獲得的抗奶牛熱應激的飼料添加劑。
【文檔編號】A23K1/18GK103734497SQ201310632843
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權日:2013年11月29日
【發(fā)明者】黃克和, 劉瑾, 葉耿坪, 陳興祥, 劉永杰, 劉云歡, 甘芳 申請人:南京農業(yè)大學