一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，主要是對(duì)白刺種子發(fā)芽之后的實(shí)生苗，運(yùn)用適宜的方法進(jìn)行消毒和在簡(jiǎn)易的培養(yǎng)基上進(jìn)行單芽莖段直接生根生長(zhǎng)快繁，從而建立起來(lái)的一套簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)、快速的白刺組培苗培養(yǎng)方法。該方法首先找到適宜幼嫩白刺實(shí)生苗消毒的藥劑和方法；其次是以單芽莖段直接生根成苗的方式增殖，在短時(shí)間內(nèi)即可穩(wěn)定獲得完整植株，植株葉綠根壯，生長(zhǎng)健康；最后培養(yǎng)基用自來(lái)水代替蒸餾水配置，白糖代替蔗糖作為碳源加入，同時(shí)避免了太多額外植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用，這在成本和操作上得到了大大的節(jié)約和簡(jiǎn)化，為白刺的快速繁殖提供了一條新的實(shí)用途徑，也為后期實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培育種領(lǐng)域，具體涉及一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白刺別名沙櫻桃，俗稱地棗，根系發(fā)達(dá)，具有抗鹽堿、耐干旱、固沙改土的優(yōu)良特性，是典型的沙旱生植物，在防風(fēng)固沙、穩(wěn)定沙漠、保護(hù)沙區(qū)綠洲中發(fā)揮著重要作用。白刺根寄生的鎖陽(yáng)，為傳統(tǒng)名貴的溫補(bǔ)藥材。近年來(lái)，從野生植物資源中尋找新的、潛在的藥食同源植物，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而沙旱生植物白刺則是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然篩選而保留下來(lái)的優(yōu)勝者之一，白刺因其頑強(qiáng)的生命力和優(yōu)良的遺傳基因而受到沙區(qū)人民的喜愛(ài)。白刺果含多種營(yíng)養(yǎng)成分和豐富的微量元素，有調(diào)節(jié)血糖、血脂、降血壓，顯著提高人體免疫力、抗疲勞、抗寒冷、增進(jìn)睡眠等功效，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。以它為優(yōu)勢(shì)種和建群種構(gòu)成的草地還是我國(guó)風(fēng)沙干旱地區(qū)家畜重要的天然牧場(chǎng)。然而據(jù)調(diào)查表明，白刺有雄性不育現(xiàn)象，種間雜交混亂，變異大，種子繁殖品質(zhì)退化相當(dāng)嚴(yán)重，同時(shí)白刺種子存在高度休眠問(wèn)題，栽培化程度低，這為人工大面積栽培和良種選育帶來(lái)了很大的困難。
[0003]采用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可能是獲得優(yōu)質(zhì)、整齊白刺苗木的一條有效途徑，這對(duì)于合理開(kāi)發(fā)和持續(xù)利用白刺資源有積極意義。目前，較多學(xué)者何正倫、孫雪新、郭曉紅等都進(jìn)行過(guò)白刺的組培研究，所形成的再生體系中消毒劑用的是升汞。升汞對(duì)外植體的傷害較大，時(shí)間稍有不當(dāng)就會(huì)造成消毒失敗，或者對(duì)外植體致死現(xiàn)象嚴(yán)重，這給后期工作造成困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種適宜白刺組培苗的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的培養(yǎng)方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)外植體消毒:將白刺種子發(fā)芽得到的實(shí)生苗，剪取幼嫩莖段，消毒后用無(wú)菌水沖洗4-5次，得到消毒好的白刺莖段；
2)將步驟I)中消毒好的白刺莖段接種于MS培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)室培養(yǎng)，待其生根并拔節(jié)長(zhǎng)高得到白刺無(wú)菌苗；
3)莖段快繁:將步驟2)得到的長(zhǎng)高至4-5cm的白刺無(wú)菌苗切取帶芽莖段，接于生根培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)室培養(yǎng)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；生根誘導(dǎo)過(guò)程為:將帶有頂芽的白刺無(wú)菌苗莖段直接接于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，其余白刺無(wú)菌苗莖段接于1/2MS培養(yǎng)基+0.5mg/L吲哚乙酸上進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為溫度25±1°C，光照強(qiáng)度2000Lx，光照16h/d。
[0006]進(jìn)一步的，上述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，所述步驟I)中，消毒過(guò)程為用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸鈉消毒15min-18min。
[0007]進(jìn)一步的，上述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，所述步驟2)和步驟3)中，培養(yǎng)基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培養(yǎng)基所用均為常用自來(lái)水。[0008]進(jìn)一步的，上述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，所用白刺為野生白刺。
[0009]進(jìn)一步的，上述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，所述MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基的配置組成為:
MS培養(yǎng)基:MS母液成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g瓊脂粉，自來(lái)水定容配置；
1/2MS培養(yǎng)基:MS母液成分劑量減半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g瓊脂粉，自來(lái)水定容配置；
所述MS母液的組成成分以質(zhì)量濃度計(jì)為:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/
L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ；維生素:煙酸10 mg/L,鹽酸批P多醇I mg/L,鹽酸硫胺素I mg/L ；
鈣鹽=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
鐵鹽:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
[0010]外植體培養(yǎng)是再生的第一步，無(wú)菌苗的生長(zhǎng)狀態(tài)直接關(guān)系到后期工作的開(kāi)展。因此，本方法反復(fù)進(jìn)行了不同消毒劑、不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒的影響試驗(yàn)，以期解決0.1%升汞消毒時(shí)，消毒時(shí)間短導(dǎo)致外植體消毒不徹底，或者消毒時(shí)間稍長(zhǎng)，外植體就褐化死亡，抑或消毒率太低等問(wèn)題。本方法最后確定采用的消毒劑10%次氯酸鈉，性質(zhì)比較溫和，對(duì)外植體傷害力不大，同時(shí)消毒時(shí)間確定在15-18min，不但外植體依然能保持健康綠色和活力，消毒率也達(dá)到90%-100%，這大大節(jié)省了外植體取材工作，也為后期試驗(yàn)提供充足無(wú)菌苗做了可靠保障。
[0011]本發(fā)明提供的白刺單芽莖段直接在培養(yǎng)基上生根成苗，逐節(jié)剪取作為增生的組培途徑，整個(gè)過(guò)程不經(jīng)歷愈傷組織的誘導(dǎo)和分化階段，這一增殖途徑對(duì)保持白刺組培苗遺傳性狀穩(wěn)定十分有利。同時(shí)提供的培養(yǎng)基用自來(lái)水配置和白糖代替蔗糖作為碳源加入這一方法，不但沒(méi)有影響到組培苗的正常生根生長(zhǎng)，而且在成本上也有所降低。
[0012]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，為白刺的快速繁殖提供了一條切實(shí)可行的新途徑。該方法首先研究出適宜于幼嫩白刺外植體消毒的方案，提出適宜的消毒劑以及消毒時(shí)間；其次試驗(yàn)出在短時(shí)間內(nèi)即可穩(wěn)定獲得完整植株的一系列措施，整個(gè)過(guò)程以單芽莖段直接生根成苗的方式增殖；同時(shí)也提出了所用培養(yǎng)基是用自來(lái)水代替蒸餾水配置，白糖代替蔗糖作為碳源加入，克服了現(xiàn)有技術(shù)中太多植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用，獲得了一個(gè)適于白刺組培苗簡(jiǎn)便培養(yǎng)的成熟方法，在成本和操作上得到了大大的節(jié)約和簡(jiǎn)化，對(duì)白刺生物育種和工廠化生產(chǎn)具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1:
(1)供試材料:野生白刺；
(2)外植體消毒:將種子發(fā)芽得到的實(shí)生苗，剪取幼嫩莖段，用75%酒精消毒30s，隨后分別用兩種消毒劑對(duì)莖段進(jìn)行不同時(shí)間的處理比較，0.1%氯化汞處理4、6、8、IOmin ;10%的次氯酸鈉處理7、10、12、15、18min，無(wú)菌水沖洗4_5次，接于MS培養(yǎng)基(自來(lái)水配置)上，每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強(qiáng)度2000LX，光照16h/d的條件下培養(yǎng)，幾天后統(tǒng)計(jì)消毒情況；
(3)莖段誘導(dǎo):待消毒好的白刺莖段在MS培養(yǎng)基(自來(lái)水配置)上生根并且拔節(jié)長(zhǎng)高至4-5cm，即可切取單芽莖段，分兩種方式進(jìn)行培養(yǎng):一種是接于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖誘導(dǎo)，分化培養(yǎng)基設(shè)置兩種:MS+0.5mg/LBA+l.0mg/LNAA+2.0mg/LGA 和 MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIBA ;一種是直接進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強(qiáng)度2000Lx，光照16h/d的條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各自結(jié)果；
(4)生根誘導(dǎo):切取的單芽莖段，接于生根培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)室培養(yǎng)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置兩種:MS培養(yǎng)基(自來(lái)水配置)和1/2MS+0.5mg/LIBA培養(yǎng)基。每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強(qiáng)度2000LX，光照16h/d的條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)生根情況；
結(jié)果表明，0.1%升汞作為消毒劑，其殺傷力極大，在處理8min和IOmin時(shí)，外植體全部褐化死亡；在處理4min時(shí)，外植體受傷害雖輕，但是漸漸菌絲就會(huì)長(zhǎng)出，消毒不徹底；在處理6min時(shí)，外植體的狀態(tài)表現(xiàn)不同，有褐化死亡的，有消毒不徹底的，也有消毒干凈的，消毒率僅13.33%，且發(fā)現(xiàn)莖段后期生長(zhǎng)緩慢或停滯。10%次氯酸鈉作為消毒劑，其性質(zhì)比較溫和，在各處理當(dāng)中外植體均未發(fā)現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象。在處理7min時(shí)，雜菌會(huì)有很多，消毒不徹底；在處理IOmin和12min時(shí)，消毒率可達(dá)60%以上，在處理15min和18min時(shí)，消毒率可達(dá)90%到100%，且外植體均健康，且在適宜培養(yǎng)基上即能生根生長(zhǎng)。
[0014]從莖段分化和生根誘導(dǎo)的處理結(jié)果表明，采用的單芽莖段增殖誘導(dǎo)途徑，在選用的已經(jīng)公開(kāi)的野生白刺分化增殖培養(yǎng)基上，未見(jiàn)芽點(diǎn)分化增殖，僅略微的膨大，隨后葉片黃化死亡。這可能是白刺基因型依賴的問(wèn)題，這一途徑可以再進(jìn)行激素調(diào)整繼續(xù)研究。采用的單芽莖段直接生根誘導(dǎo)途徑，在MS培養(yǎng)基(自來(lái)水配置)中僅有帶頂芽的莖段可以生根，在1/2MS+0.5mg/LIBA培養(yǎng)基中幼嫩帶芽莖段生根良好，老化的帶芽莖段生根較困難。后面將1/2MS+0.5mg/LIBA培養(yǎng)基也改用自來(lái)水配置，對(duì)生根誘導(dǎo)與之前比較沒(méi)有差別。
[0015]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)`明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)外植體消毒:將白刺種子發(fā)芽得到的實(shí)生苗，剪取幼嫩莖段，消毒后用無(wú)菌水沖洗4-5次，得到消毒好的白刺莖段； 2)將步驟I)中消毒好的白刺莖段接種于MS培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)室培養(yǎng)，待其生根并拔節(jié)長(zhǎng)高得到白刺無(wú)菌無(wú)菌苗； 3)莖段快繁:將步驟2)得到的長(zhǎng)高至4-5cm的白刺無(wú)菌苗切取帶芽莖段，接于生根培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)室培養(yǎng)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；生根誘導(dǎo)過(guò)程為:將帶有頂芽的白刺無(wú)菌苗莖段直接接于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，其余白刺無(wú)菌苗莖段接于1/2MS培養(yǎng)基+0.5mg/L吲哚乙酸上進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為溫度25±1°C，光照強(qiáng)度2000Lx，光照16h/d。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I)中，消毒過(guò)程為用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸鈉消毒15min-18min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟3)中，培養(yǎng)基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培養(yǎng)基所用均為常用自來(lái)水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:所用白刺為野生白刺。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種白刺組培苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基的配置組成為: MS培養(yǎng)基:MS母液 成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g瓊脂粉，自來(lái)水定容配置； 1/2MS培養(yǎng)基:MS母液成分劑量減半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g瓊脂粉，自來(lái)水定容配置； 所述MS母液的組成成分以質(zhì)量濃度計(jì)為:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ； 維生素:煙酸10 mg/L,鹽酸批P多醇I mg/L,鹽酸硫胺素I mg/L ；
鈣鹽=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
鐵鹽:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103651143SQ201310697008
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】張艷萍, 趙瑋, 羅俊杰, 陳玉梁, 羅萬(wàn)銀, 董治寶 申請(qǐng)人:甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所