一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物兩步成苗組培快速繁殖的方法，具體是一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]心葉小花苣笞(Chiritopsiscordifolia D.Fang et W.T.Wang)，為苦苣笞科小花苣苔屬草本植物。多數(shù)苦苣苔科植物具有清熱解毒、祛痰、止咳、平喘、活血散結(jié)、消腫止痛、除濕等功效，全草可用于治療跌打損傷，燙傷，瘡癤，對于各種炎癥、咳喘、瘡癤、風(fēng)濕、跌打、燙傷、蛇蟲咬傷及婦科疾病有較好的療效。主要分布于我國廣西柳江、融安等縣，為廣西特有植物，既可觀賞，又是民間草藥。生于海拔100?260米的石灰?guī)r山陡崖上，分布范圍小、繁殖困難，資源量極少，再加上近年來南方喀斯特地貌地區(qū)石漠化日益嚴(yán)重，全球變暖導(dǎo)致很多地區(qū)長期干旱，以及洞穴旅游的不合理開發(fā)使得苦苣苔植物賴以生存的環(huán)境嚴(yán)重受到破壞，地方種已處于瀕危狀態(tài)，甚至已經(jīng)滅絕，對小花苣苔屬植物資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用已刻不容緩。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)心葉小花苣苔的兩步成苗和快速繁殖，縮短心葉小花苣苔種苗生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高種苗質(zhì)量，為心葉小花苣苔大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持，對進(jìn)一步保護(hù)和利用苦苣苔科植物資源、拯救物種具有十分重要的意義。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，包括以下步驟:
[0005](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0006](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7?12d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽，所述外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.1?2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.05?1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0007](3)不定芽的增殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的不定芽或芽叢置于MS增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/m2.s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)50d，長出更多的叢生芽，所述增殖培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.3?2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0008](4)不定芽的生根:將步驟(3)中得到的叢生芽剪切為單芽置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)10?15d便開始生根，所述1/2MS生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.1?1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.05?1.0mg/L的吲哚丁酸IBA,0.5?1.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0009]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0010](I)利用組織培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)了心葉小花苣苔的兩步成苗和快速繁殖。縮短了心葉小花苣苔種苗生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高種苗質(zhì)量，為心葉小花苣苔大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
[0011](2)采用本發(fā)明所述的兩步成苗及組培快速繁殖的方法，外植體消毒培養(yǎng)7d便開始長出不定芽，30d出芽率為86.9%，生根率為89.5%，培養(yǎng)50d增殖系數(shù)為6.1。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明。
[0013]實(shí)施例1
[0014]本發(fā)明所述的心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法一個(gè)實(shí)例，包括如下步驟:
[0015](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0016](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 ymol/m2.S，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)12d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.lmg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8，培養(yǎng)30d誘導(dǎo)率為68.4%。
[0017](3)不定芽的增殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的不定芽置于MS增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/m2.s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)50d，長出更多的叢生芽。所述增殖培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.3mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)50d增殖系數(shù)為 3.8o
[0018](4)不定芽的生根:將步驟(3)中得到的叢生芽剪切為單芽置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15d便開始生根。所述1/2MS生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.lmg/L的萘乙酸NAA、0.05mg/L的吲哚丁酸IBA，0.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d生根率為76.3%0
[0019]實(shí)施例2
[0020]本發(fā)明所述的心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法另一個(gè)實(shí)例，包括如下步驟:
[0021](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0022](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)Sd開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.8mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d誘導(dǎo)率為84.2%。
[0023](3)不定芽的增殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的不定芽置于MS增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30 μmol/m2 *s，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)50d，長出更多的叢生芽。所述增殖培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.8mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.lmg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)50d增殖