一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的培養(yǎng)基及組培方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的培養(yǎng)基系列及組培方法。所述培養(yǎng)基系列包括萌發(fā)培養(yǎng)基A、增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基B、分化培養(yǎng)基C、壯苗培養(yǎng)基D或E、和生根培養(yǎng)基F，本發(fā)明組培方法，首先將種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子萌發(fā)形成原球莖后，在原球莖增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織進(jìn)一步形成類原球莖；類原球莖經(jīng)過分化形成小苗；將小苗移至壯苗培養(yǎng)基中，小苗長成大苗后；大苗在生根培養(yǎng)基中經(jīng)過培養(yǎng)成為至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯根系，株高達(dá)到6-8cm的鐵皮石斛成苗。本發(fā)明可以縮短鐵皮石斛的培育時(shí)間，不僅操作簡單，且不受時(shí)間地點(diǎn)的限制，類原球莖的不斷分裂增殖可以保證周年生產(chǎn)，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的培養(yǎng)基及組培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種藥用植物種苗的繁殖方法，具體來說涉及一種鐵皮石斛快速繁殖的組培方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛又稱黑節(jié)草，是一種珍稀的藥用植物和名貴的室內(nèi)觀賞植物。屬國家一級(jí)保護(hù)的貴重瀕危藥材，歷代醫(yī)學(xué)經(jīng)典均奉其為“藥中之上品”。明代李時(shí)珍的《本草綱目》中記載:石斛除痹下氣、補(bǔ)內(nèi)臟虛勞贏瘦，強(qiáng)陰益精。久服，厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足。來胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年。道教醫(yī)學(xué)經(jīng)典《道藏》中，鐵皮石斛名列中華“九大仙草”之首。鐵皮石斛的藥用部分是新鮮或干燥莖，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明:鐵皮石斛能顯著提高機(jī)體免疫功能，抗衰老，抗疲勞，耐缺氧，具有輔助抑制腫瘤等功效。
[0003]鐵皮石斛種子細(xì)如粉塵，一個(gè)蒴果內(nèi)所含種子達(dá)100萬粒之多。由于缺乏胚乳，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，自然條件下萌發(fā)率非常低(不足5%)。鐵皮石斛自然繁殖力極低，常規(guī)繁殖又較困難，且多年來對(duì)鐵皮石斛的采集量遠(yuǎn)大于其生長量，野生鐵皮石斛自然繁殖已瀕臨絕跡。為發(fā)展人工栽培滿足市場需求，藥用石斛中的一些珍貴品種已成為目前組織快繁研究的重點(diǎn)。
[0004]目前關(guān)于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，但是組織培養(yǎng)所需的成本過高和試管成苗周期長的問題是制約鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)的瓶頸。因此亟需一種能快速繁殖鐵皮石斛的組織培養(yǎng)體系，為推廣人工培植技術(shù)和大規(guī)模工廠化育苗奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)目前鐵皮石斛的組織培養(yǎng)成本較高，從無菌撒種到獲得成苗的過程較長的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)一種能快速繁殖鐵皮石斛且能夠周年生產(chǎn)的組織培養(yǎng)體系，為工廠化育苗提供技術(shù)支撐。
[0006]本發(fā)明所述的一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的專用培養(yǎng)基系列，包括萌發(fā)培養(yǎng)基A、增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基B、分化培養(yǎng)基C、壯苗培養(yǎng)基D或E、和生根培養(yǎng)基F，各培養(yǎng)基各組分在IL培養(yǎng)基中的含量分別為:
[0007](I)培養(yǎng)基 A =NH4NO3:1600_2000mg、KNO3:1800_2300mg、MgSO4.7H20:330_380mg、KH2PO4: 150_180mg、CaCl2: 330_360mg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20:8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20:0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、瓊脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0008](2)培養(yǎng)基 B: (NH4)2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA: 37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.2-1.0mg、土豆80_150g、瓊脂6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0009](3)培養(yǎng)基 C: (NH4)2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA: 37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.1-0.5mg、土豆80_150g、瓊脂6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0010](4)培養(yǎng)基D:l-5g花寶二號(hào)、0.1-0.8g水解酪蛋白、萘乙酸0.1-0.5mg、6_芐氨基嘌呤 0.1-0.5mg、土豆 80-150g、瓊脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0011](5)培養(yǎng)基 E: (NH4)2SO4:128-135mg、KNO3:1800_2500mg、MgSO4.7H20:250_300mg、NaH2PO4.H20: 130_160mg、CaCl2: 150-17Omg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3:2.3-3.0mg、MnSO4.4H20: 9.5-11.0mg、ZnSO4.7H20: 1.6-2.2mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.9-1.6mg、鹽酸吡哆醇 1.0-1.8mg、鹽酸硫胺素9.6-10.5mg、萘乙酸0.3-0.8mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.4-1.0mg、土豆80_150g、瓊脂
6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0012](6)培養(yǎng)基 F:NH4N03:800-8 30mg、KN03:9 50-1000mg、MgSO4.7H20:175-190mg、KH2PO4: 60_85mg、CaCl2: 160_250mg、K1:0.6 5-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素0.08-0.15mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.8mg、吲哚乙酸0.2-1.0mg、活性炭0.5-1.5mg、香蕉 100-150g、瓊脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0013]上述鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的專用培養(yǎng)基系列配方，該配方配制過程如下(IL培養(yǎng)基):
[0014](I)量取約500ml水放入熱水鍋中并加熱；
[0015](2)稱取 6.5-7.5g 瓊脂粉；
[0016](3)待水溫達(dá)到80°C時(shí)加入瓊脂粉，攪拌均勻，加熱至沸騰；
[0017](4)加入每種培養(yǎng)基所需要的藥品；
[0018](5)配制培養(yǎng)基B、C、D、E、F時(shí)稱取80_150g 土豆或香蕉，將其切成小塊并用榨汁機(jī)榨汁；
[0019](6)將榨好的土豆汁或香蕉汁過濾至熱水鍋中；
[0020](7)配制培養(yǎng)基F時(shí)加入活性炭0.5-1.5mg ；
[0021](8)加入白砂糖 20_30g ;
[0022](9)待藥品和白砂糖全部溶解后加水定容至IL并攪拌均勻；[0023](10)用 pH 試紙調(diào) pH 值為 5.8-6.2 ；
[0024](11)分裝，將配制好的培養(yǎng)基倒入組培瓶，倒入量視組培瓶容量大小而定，一般為容器的1/5左右；
[0025](12)高壓蒸汽滅菌，121°C，1.5Mpa，20min ；
[0026](13)滅完菌的培養(yǎng)基放入接種室內(nèi)靜置，讓其降溫后凝固。
[0027]本發(fā)明還公開了使用上述培養(yǎng)基系列由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的組培方法，其步驟如下:
[0028](I)鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā)
[0029]將成熟的種子用自來水沖洗干凈以后放入超凈工作臺(tái)中，在超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將種子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸鈉溶液中浸泡20min，再用無菌水漂洗3次，每次lmin。將處理好的種子用解剖刀在一端切開一小口，用鑷子夾住種子的另一端將粉末狀胚均勻播撒于培養(yǎng)基A中。將組培瓶置于溫度為25°C，無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)并每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。大約30天左右，種子萌發(fā)，此時(shí)將組培瓶置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。45天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖。
[0030]( 2 )鐵皮石斛原球莖的增殖
[0031]在超凈工作臺(tái)上用勺子將種子萌發(fā)形成的原球莖均勻的轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基B上。將組培瓶置于溫度為25°C，光照 20001χ，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)并每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。可觀察到組培瓶中的原球莖長出淡黃色愈傷組織，45天左右愈傷組織不斷分裂增殖形成類原球莖(如圖2所示)。
[0032](3)鐵皮石斛類原球莖的分化
[0033]在超凈工作臺(tái)上用勺子將類原球莖挑出并均勻的轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C上。將組培瓶置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)并每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。60-90天左右可以觀察到組培瓶中的類原球莖經(jīng)過分化形成高約l_2cm的小苗(如圖3所示)。
[0034](4)鐵皮石斛小苗的壯苗
[0035]在超凈工作臺(tái)上用鑷子小心的夾出類原球莖分化形成的小苗放置在事先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把小苗插入培養(yǎng)基D中。將組培瓶置于溫度為25°C,光照20001x,每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)并每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。60-90天左右可以觀察到組培瓶中的小苗經(jīng)過壯苗形成整齊度基本一致高約3-4cm的大苗(如圖4所示)。
[0036](5)鐵皮石斛大苗的生根
[0037]在超凈工作臺(tái)上用鑷子小心的夾出鐵皮石斛大苗放置在事先消毒過的大培養(yǎng)皿上，將大苗一根一根的挑出并插入培養(yǎng)基F中。將組培瓶置于溫度為25°C,光照20001x,每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)并每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌lh。60-90天左右可以觀察到組培瓶中的大苗長勢良好，整齊度相當(dāng)，葉片大而厚，呈長橢圓形，葉色深綠，每棵苗至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯的根系,株高達(dá)到6-8cm (如圖5所示)。
[0038](6)鐵皮石斛組培苗的煉苗與移栽
[0039]將組培瓶里的成苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。[0040]為了在生產(chǎn)過程中保證獲得更多的種苗同時(shí)為了能夠?qū)崿F(xiàn)周年生產(chǎn)，步驟(2)可以重復(fù)進(jìn)行，類原球莖在繼代培養(yǎng)過程中可以不斷分裂增殖產(chǎn)生新的類原球莖。
[0041]步驟(4)中，為了在生產(chǎn)過程中獲得更多的種苗，可以選擇將步驟(3)中類原球莖分化形成的小苗插入培養(yǎng)基E中。該培養(yǎng)基可以顯著促進(jìn)小苗叢生芽的產(chǎn)生，從而獲得更多的大苗。
[0042]上述的一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的組培方法，設(shè)計(jì)目標(biāo)明確，提高了鐵皮石斛克隆苗的增殖率和移栽成活率。本發(fā)明的方法不僅縮短了鐵皮石斛的培養(yǎng)周期，而且操作簡單，能不受時(shí)間地點(diǎn)的限制周年生產(chǎn)，對(duì)發(fā)展鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1是組培流程圖。
[0044]圖2是鐵皮石斛類原球莖照片。
[0045]圖3是鐵皮石斛苗(壯苗前)照片。
[0046]圖4是鐵皮石斛苗(壯苗后)照片。
[0047]圖5是鐵皮石斛成苗照片。
【具體實(shí)施方式】
[0048]以下通過實(shí)驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0049]實(shí)驗(yàn)一:
[0050]1、配制培養(yǎng)基么、8、(:、03、卩。
[0051]2、選取野生鐵皮石斛成熟種子，將種子用自來水沖洗干凈以后放入超凈工作臺(tái)中，在超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將種子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸鈉溶液中浸泡20min，再用無菌水漂洗3次，每次lmin。將處理好的種子用解剖刀切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:330mg、KH2PO4: 150mg λ CaCl2:330mg、K1: 0.65mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeS04.7Η20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡哆醇 0.2mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、瓊脂6.5g、白砂糖30g的培養(yǎng)基A中。置于溫度為25O,無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。一段時(shí)間后，種子萌發(fā)，此時(shí)將培養(yǎng)基置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。70天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖。
[0052]3、將種子萌發(fā)形成的原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡卩多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.6mg、土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的增殖培養(yǎng)基B中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。20天左右觀察到組培瓶中的原球莖產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織不斷分裂增殖， 70天左右原球莖成倍增殖為類原球莖。
[0053]4、將由原球莖愈傷組織形成的類原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4.4Η20:4.0mg、ZnS04.7Η20:1.3mg,Na2-EDTA:37.0mg、FeSO4.7Η20:27.5mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡卩多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.lmg、6_節(jié)氨基嘌呤0.1mg>土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的分化培養(yǎng)基C中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。90天左右觀察到組培瓶中的類原球莖經(jīng)過分化形成高約l-2cm的小苗。
[0054]5、將分化的小苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入含2g花寶二號(hào)、0.2g水解酪蛋白、萘乙酸
0.lmg、6-節(jié)氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖20g的壯苗培養(yǎng)基D中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。90天左右觀察到組培瓶中的小苗經(jīng)過壯苗形成整齊度基本一致高約3-4cm的大苗。
[0055]6、將經(jīng)過壯苗形成的大苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.2mg、鹽酸批卩多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的生根培養(yǎng)基F中。置于溫度為25O,光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。90天左右觀察到組培瓶中的大苗長勢良好，整齊度相當(dāng)，葉片大而厚，呈長橢圓形，葉色深綠，每棵苗至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯的根系，株高達(dá)到 6_8cm。
[0056]7、將組培瓶里的成苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。
[0057]實(shí)驗(yàn)二:
[0058]1、配制培養(yǎng)基么、8、(:、03、卩。
[0059]2、選取人工培育的鐵皮石斛成熟種子，將種子用自來水沖洗干凈以后放入超凈工作臺(tái)中，在超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將種子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸鈉溶液中浸泡20min，再用無菌水漂洗3次，每次lmin。將處理好的種子用解剖刀切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:330mg、KH2PO4: 150mg λ CaCl2:330mg、K1: 0.65mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeS04.7Η20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡哆醇 0.2mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、瓊脂6.5g、白砂糖30g的培養(yǎng)基A中。置于溫度為25O,無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。一段時(shí)間后，種子萌發(fā)，此時(shí)將培養(yǎng)基置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。70天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖。
[0060]3、將種子萌發(fā)形成的原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡卩多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.6mg、土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的增殖培養(yǎng)基B中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。20天左右觀察到組培瓶中的原球莖產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織不斷分裂增殖，70天左右原球莖成倍增殖為類原球莖。[0061]4、將由原球莖愈傷組織形成的類原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、煙酸 0.2mg、鹽酸吡卩多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.lmg、6_節(jié)氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的分化培養(yǎng)基C中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。90天左右觀察到組培瓶中的類原球莖經(jīng)過分化形成高約l-2cm的小苗。
[0062]5、將分化的小苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2SO4:120mg、KNO3:1800mg、MgSO4.7H20: 23Omg、NaH2PO4.H20: 15Omg、CaCl2: 15Omg、K1: 0.65mg、H3BO3: 2.3mg、MnSO4.4H20:9.5mg、ZnSO4.7H20:1.6mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2 *6H20:0.015mg,Na2-EDTA: 37.0Omg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.9mg、鹽酸批口多醇1.0mg、鹽酸硫胺素9.6mg、萘乙酸0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的壯苗培養(yǎng)基E中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。90天左右觀察到組培瓶中的小苗經(jīng)過壯苗形成整齊度基本一致高約3-4cm的大苗，且每株大苗至少產(chǎn)生2-3個(gè)叢生芽分化出來的苗。
[0063]6、將經(jīng)過壯苗形成的大苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.2mg、鹽酸批口多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基E中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。900天左右觀察到組培瓶中的大苗長勢良好，整齊度相當(dāng)，葉片大而厚，呈長橢圓形，葉色深綠，每棵苗至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯的根系，株高達(dá)至Ij 6_8cm。
[0064]7、將組培瓶里的成苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。
[0065]實(shí)驗(yàn)三:
[0066]1、配制培養(yǎng)基么、8、(:、03、卩。
[0067]2、選取人工培養(yǎng)的鐵皮石斛成熟種子，將種子用自來水沖洗干凈以后放入超凈工作臺(tái)中，在超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將種子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸鈉溶液中浸泡20min，再用無菌水漂洗3次，每次lmin。將處理好的種子用解剖刀切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:370mg、KH2PO4: 180mg、CaCl2: 330mg> K1: 0.85mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡哆醇 0.5mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、瓊脂6.5g、白砂糖30g的培養(yǎng)基A中。置于溫度為25°C,無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。一段時(shí)間后，種子萌發(fā)，此時(shí)將培養(yǎng)基置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。50天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖。
[0068]3、將種子萌發(fā)形成的原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡卩多醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.6mg、土豆100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的增殖培養(yǎng)基B中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。15天左右觀察到組培瓶中的原球莖產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織不斷分裂增殖，60天左右原球莖成倍增殖為類原球莖。
[0069]4、將由原球莖愈傷組織形成的類原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡卩多醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的分化培養(yǎng)基C中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。60天左右觀察到組培瓶中的類原球莖經(jīng)過分化形成高約l-2cm的小苗。
[0070]5、將分化的小苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入含3g花寶二號(hào)、0.4g水解酪蛋白、萘乙酸0.2mg、6-芐氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、瓊脂6.5g、白砂糖20g的壯苗培養(yǎng)基D中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。70天左右觀察到組培瓶中的小苗經(jīng)過壯苗形成整齊度基本一致高約3-4cm的大苗。
[0071]6、將經(jīng)過壯苗形成的大苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入到含NH4N03:815mg、KNO3:950mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:85mg、CaCl2:165mg、K1: 0.85mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025-mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡卩多醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.4mg、吲哚乙酸0.4mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的生根培養(yǎng)基F中。置于溫度為25°C,光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。60天左右觀察到組培瓶中的大苗長勢良好，整齊度相當(dāng)，葉片大而厚，呈長橢圓形，葉色深綠，每棵苗至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯的根系，株高達(dá)到 6_8cm。`
[0072]7、將組培瓶里的成苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。
[0073]實(shí)驗(yàn)四:
[0074]1、配制培養(yǎng)基八、8、(:、03、卩。
[0075]2、選取野生鐵皮石斛成熟種子，將種子用自來水沖洗干凈以后放入超凈工作臺(tái)中，在超凈工作臺(tái)的無菌條件下，將種子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸鈉溶液中浸泡20min，再用無菌水漂洗3次，每次lmin。將處理好的種子用解剖刀切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:370mg、KH2PO4: 180mg、CaCl2: 330mg> K1: 0.85mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡哆醇 0.5mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、瓊脂6.5g、白砂糖30g的培養(yǎng)基A中。置于溫度為25°C,無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。一段時(shí)間后，種子萌發(fā)，此時(shí)將培養(yǎng)基置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。50天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖。
[0076]3、將種子萌發(fā)形成的原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡卩多醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.6mg、土豆100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的增殖培養(yǎng)基B中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。15天左右觀察到組培瓶中的原球莖產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織不斷分裂增殖，60天左右原球莖成倍增殖為類原球莖。
[0077]4、將由原球莖愈傷組織形成的類原球莖在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、煙酸 0.5mg、鹽酸吡卩多醇0.5mg、鹽酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的分化培養(yǎng)基C中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。60天左右觀察到組培瓶中的類原球莖經(jīng)過分化形成高約l-2cm的小苗。
[0078]5、將分化的小苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入含(NH4)2SO4:130mg、KN03:2 5 00mg、MgSO4.7H20: 25Omg、NaH2PO4.H20: 15Omg、CaCl2: 15Omg、K1: 0.65mg、H3BO3: 2.8mg、MnSO4.4H20:9.5mg、ZnSO4.7H20:1.8mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、煙酸 1.0mg、鹽酸批卩多醇1.0mg、鹽酸硫胺素9.6mg、萘乙酸0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.5mg、土豆100g、瓊脂
6.5g、白砂糖30g的壯苗培養(yǎng)基E中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。70天左右觀`察到組培瓶中的小苗經(jīng)過壯苗形成整齊度基本一致高約3-4cm的大苗，且每株大苗至少產(chǎn)生2-3個(gè)叢生芽分化出來的苗。
[0079]6、將經(jīng)過壯苗形成的大苗在無菌條件下轉(zhuǎn)入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、煙酸 0.2mg、鹽酸批口多醇0.2mg、鹽酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭
0.5mg、香蕉100g、瓊脂6.5g、白砂糖30g的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基F中。置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。70天左右觀察到組培瓶中的大苗長勢良好，整齊度相當(dāng)，葉片大而厚，呈長橢圓形，葉色深綠，每棵苗至少有3-4條發(fā)達(dá)健壯的根系，株高達(dá)到6_8cm。
[0080]7、將組培瓶里的成苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的專用培養(yǎng)基系列，其特征在于該培養(yǎng)基系列包括萌發(fā)培養(yǎng)基A、增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基B、分化培養(yǎng)基C、壯苗培養(yǎng)基D或E、和生根培養(yǎng)基F，所述各培養(yǎng)基中組分以IL培養(yǎng)基計(jì)，含量分別為: a.培養(yǎng)基A =NH4NO3:1600_2000mg、KNO3:1800_2300mg、MgSO4.7H20:330_380mg、KH2PO4: 150_180mg、CaCl2: 330_360mg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg> ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、瓊脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g ；
b.培養(yǎng)基B:(NH4)2S04:460-480mg、KN03:28 00-28 50mg、MgSO4.7H20:175-185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.2-1.0mg、土豆80_150g、瓊脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ；
c.培養(yǎng)基C: (NH4) 2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.1-0.5mg、土豆80_150g、瓊脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ； d.培養(yǎng)基D:l-5g花寶二號(hào)、0.1-0.Sg水解酪蛋白、萘乙酸0.1-0.5mg、6-芐氨基嘌呤.0.1-0.5mg、土豆 80-150g、瓊脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g ；
e.培養(yǎng)基E: (NH4)2SO4:128-135mg、KNO3:1800_2500mg、MgSO4.7H20:250_300mg、NaH2PO4.H20: 130_160mg、CaCl2: 150-17Omg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3:2.3-3.0mg、MnSO4.4H20: 9.5-11.0mg、ZnSO4.7H20: 1.6-2.2mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.9-1.6mg、鹽酸吡哆醇 1.0-1.8mg、鹽酸硫胺素9.6-10.5mg、萘乙酸0.3-0.8mg、6_節(jié)氨基嘌呤0.4-1.0mg、土豆80_150g、瓊脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ； f.培養(yǎng)基F:NH4N03:800-830mg、KN03:950-1000mg、MgSO4.7H20:175-190mg、KH2PO4: 60_85mg、CaCl2: 160_250mg、K1:0.6 5-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、煙酸 0.2-0.6mg、鹽酸吡哆醇 0.2-0.5mg、鹽酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、 萘乙酸0.1-0.8mg、吲哚乙酸0.2-1.0mg、活性炭0.5-1.5mg、香蕉100_150g、瓊脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
2.—種權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基系列的配制方法，其特征在于配制過程以IL培養(yǎng)基計(jì)，步驟如下: a.量取約500ml水放入熱水鍋中并加熱； b.稱取6.5-7.5g瓊脂粉； c.待水溫 達(dá)到80°C時(shí)加入瓊脂粉，攪拌均勻，加熱至沸騰； d.加入權(quán) 利要求1中各培養(yǎng)基所述藥品； e.稱取80-150g土豆或香蕉，將其切成小塊并用榨汁機(jī)榨汁； f.將榨好的土豆汁或香蕉汁過濾至熱水鍋中； g.加入活性炭0.5-1.5mg ； h.加入白砂糖20-30g;i.待藥品和白砂糖全部溶解后加水定容至IL并攪拌均勻； j.用pH試紙調(diào)pH值為5.8-6.2 ； k.分裝，將配制好的培養(yǎng)基倒入組培瓶，倒入量視組培瓶容量大小而定，一般為容器的1/5左右；1.高壓蒸汽滅菌，121°C, 1.5Mpa, 20min ; m.滅完菌的培養(yǎng)基放入接種室內(nèi)靜置，讓其降溫后凝固； 在配制培養(yǎng)基A、B、C、D、E、F時(shí)步驟d所加入的藥品分別對(duì)應(yīng)為權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基么、8、(:、03、？時(shí)中的成分； 在配制培養(yǎng)基B、C、D、E、F時(shí)要進(jìn)行步驟e、f ; 在配制培養(yǎng)基F時(shí)要進(jìn)行步驟g。
3.一種使用權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基系列由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的組培方法，其特征包括以下的步驟: (1)鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā) a.在超凈工作臺(tái)上將鐵皮石斛種子依次用酒精浸泡lmin，次氯酸鈉溶液消毒20min，無菌水漂洗3次，每次Imin ； b.將徹底消毒并漂洗后的種子取出，從種子的一端將其切開，切開后，將粉末狀胚均勻的播撒到培養(yǎng)基A上； c.置于溫度為25°C，無光照的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)； d.每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih； e.30天左右種子萌發(fā)之后，將組培瓶置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih ； f.45天左右，萌發(fā)的種子形成原球莖； (2)鐵皮石斛原球莖的增殖 a.在超凈工作臺(tái)上用勺子將種子萌發(fā)形成的原球莖均勻的轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基B上； b.置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)； c.每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih； d.原球莖長出淡黃色愈傷組織，45天左右，愈傷組織不斷分裂增殖成類原球莖； (3)鐵皮石斛類原球莖的分化 a.在超凈工作臺(tái)上用勺子將類原球莖挑出并均勻的轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基C上； b.置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)；C.每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih ； d.60-90天左右，類原球莖分化成小苗； (4)鐵皮石斛小苗的壯苗 a.在超凈工作臺(tái)上用鑷子小心的夾出類原球莖分化形成的小苗放置在事先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把小苗插入培養(yǎng)基D或E中； b.置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)； c.每天對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih； d.60-90天左右，小苗成長為長勢良好的鐵皮石斛大苗； (5)鐵皮石斛大苗的生根 a.在超凈工作臺(tái)上用鑷子小心的夾出鐵皮石斛大苗放置在事先消毒過的大培養(yǎng)皿上; b.將大苗一根一根的挑出并插入培養(yǎng)基F中； c.置于溫度為25°C，光照20001x，每日光照12h的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)； d.每天對(duì)其 培養(yǎng)環(huán)境臭氧滅菌Ih； e.60-90天左右，大苗成長為完整的鐵皮石斛組培苗； (6)鐵皮石斛組培苗的煉苗與移栽 a.將組培瓶里的成苗放置在自然光下煉苗一周； b.將瓶苗取出并洗凈根部培養(yǎng)基后，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由鐵皮石斛類原球莖快速繁殖成苗的組培方法，其特征在于所述步驟(1)所述的鐵皮石斛種子采集的是野生鐵皮石斛或者人工培育的鐵皮石斛。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103688860SQ201310699964
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】丁小余, 鄭瑞, 牛志韜 申請人:南京師范大學(xué)