一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，該方法選用無菌的山葵芽體為培養(yǎng)材料，經(jīng)變溫處理后，取其芽分生組織接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基中，再經(jīng)壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得山葵脫毒苗，所培養(yǎng)的山葵脫毒苗具有生長速度快、有效組分含量高等優(yōu)點。本發(fā)明方法為山葵優(yōu)良品種的快速培育提供了一條新途徑。
【專利說明】一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種山葵植物的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山箭菜、山菜，為十字花科山箭菜，屬多年生半陰生草本植物。山葵中含有一種芥子苷類的物質(zhì)，在植物體被磨碎時，該物質(zhì)在芥子苷酶的作用下水解形成異硫氰酸酯類化合物，具有殺菌、防腐、利尿、清血、抗感染、抗癌等多種藥用活性，是國際上公認的極為稀缺和珍貴的藥食同源植物。
[0003]山葵植物在自然條件下生長常受到許多病蟲害的危害，如在何月秋等人的研究文獻《云南省山葵常見病害和癥狀調(diào)查》中專門報道了山葵植物有墨入病、霜霉病、白銹病、立枯病、軟腐病、病毒病和根結(jié)線蟲病等多種常見病害癥狀，其中以墨入病對山葵的葉、葉柄、根莖、根須造成的危害最大，直接造成山葵產(chǎn)品的質(zhì)量下降和減產(chǎn)，嚴重時還會造成山葵植物全部死亡；立枯病主要危害幼苗基部，有時在種子萌發(fā)后尚未出土就變褐死亡；病毒病的患病植株表現(xiàn)為葉片大多葉脈間失綠，呈黃綠色相間的花葉狀，有的葉片變小、畸形，葉脈對光有明脈現(xiàn)象，植株長勢不良；軟腐病主要危害根莖及葉柄，根莖危害初期，外圍葉片在烈日下表現(xiàn)萎蔫，嚴重時根莖內(nèi)部組織崩解，產(chǎn)生灰白色惡臭的菌膿，最后整株萎蔫死亡。因此，為保持山葵植物的優(yōu)良品質(zhì)，并提高其產(chǎn)量，有必要提供一種山葵植物的組織培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明提供的山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法包括如下步驟:
[0006](1)切取山葵根莖上生長的芽體的芽尖部分，將其放在超凈工作臺上，先用
0.1%的升汞消毒2~5分鐘，再用無菌水清洗后，接種于促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基MS+KT0.5 ~L 5mg.L_1+NAA0.3 ~L Omg.1 中，在 12 ~20°C、每天光照 6 ~12 小時、光照強度為1000~15001x的條件下進行培養(yǎng)；
[0007](2)選取步驟(1)中培養(yǎng)的長度在1.0cm以上的無菌芽體，轉(zhuǎn)接入MS+6-BA1~
3.0mg.L_1+IAA0.5~2.0mg.L_1+脯氨酸0.5~2%+活性炭1~3%的培養(yǎng)基中，先在5°C的條件下培養(yǎng)15天，再放在培養(yǎng)箱中進行8~15天的變溫處理；
[0008] (3)選取生長良好的芽體于解剖鏡下，用解剖針小心剝?nèi)パ矿w外面的幼葉后，切取帶有1~4個葉原基的芽分生組織，接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基MS+6-BA1.0~3mg '+ΚΤΟ.1~0.5mg 1中，在15~22°C、每天光照10~14小時、光照強度為1000~15001x的條件下培養(yǎng)；
[0009](4)選取生長的山葵叢生芽，將其分割為單株后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS+NAA0.05~
0.lmg.L ^Θ-ΒΑΟ.1 ~0.5mg.L ^KT0.05 ~0.2mg.L 1 中，在 10 ~18 °C、每天光照 10 ~16小時、光照強度為1000~15001x的條件下培養(yǎng)；
[0010](5)選取生長健壯的山葵無根苗接入生根培養(yǎng)基White+NAA0.1~1.0mg.L—1中，在15~22°C、每天光照6~10小時、光照強度為800~ΙΟΟΟΙχ的條件下誘導(dǎo)生根；
[0011](6)當(dāng)無根苗長出3~4條以上不定根時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2~4天后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水洗去不定根上的培養(yǎng)基后，移栽至消毒后的土壤中生長。
[0012]進一步地，步驟(1)中所述芽體的芽尖部分是指芽體上部長度為0.2~0.5cm的牙尖部分。
[0013]進一步地，步驟(2)中所述變溫處理是指在8~12°C的條件下培養(yǎng)19小時與在30~45°C的條件下培養(yǎng)5小時交替進行。
[0014]進一步地，步驟(6)中所述土壤是由蛭石和全營養(yǎng)土按2:1配制而成，土壤消毒是指先采用0.1%多菌靈消毒6~10小時，再用0.1%高錳酸鉀消毒12~24小時。
[0015]進一步地，步驟(6)中煉苗的培養(yǎng)條件為溫度15~20°C和相對濕度80%~95%，移栽后的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度12~20°C、相對濕度為70~80%、每天光照4~10小時和光照強度為800~12001x。
[0016]上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.6~6.2，瓊脂5.5~6.5g.?Λ蔗糖25~35g.L-1。
[0017]本發(fā)明選用無菌的山葵芽體為培養(yǎng)材料，經(jīng)變溫處理后，取其芽分生組織接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基中，再經(jīng)壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得山葵脫毒苗，所培養(yǎng)的山葵脫毒苗具有生長速度快、有效組分含量高等優(yōu)點。本發(fā)明方法為山葵優(yōu)良品種的快速培育提供了一條新途徑。
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020](1)切取山葵根莖上生長的芽體上部長度為0.2cm的芽尖部分，將其放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒2分鐘，再用無菌水清洗4次后，接種于促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基MS+KT0.5mg.L^+NAA0.3mg.L-11中，在溫度12°C、每天光照6小時、光照強度為ΙΟΟΟΙχ的條件下培養(yǎng)25天，長到1.0cm以上的無菌芽體有89.32% ；
[0021](2)選取步驟(1)中培養(yǎng)的長度在1.0cm以上的無菌芽體，轉(zhuǎn)接入MS+6-BA1.0mg.L-1+IAA0.5mg.L^+脯氨酸0.5%+活性炭1.0%的培養(yǎng)基中，先置于5°C的冰箱中低溫培養(yǎng)15天，再放在培養(yǎng)箱中進行8天的變溫處理，所述變溫處理是指在8°C的條件下培養(yǎng)19小時與在30°C的條件下培養(yǎng)5小時交替進行，芽體的存活率為98.68% ；
[0022](3)選取經(jīng)步驟(2)處理后生長良好的芽體于解剖鏡下，用解剖針小心剝?nèi)パ矿w外面的幼葉后，切取帶有1個葉原基的芽分生組織，接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基MS+6-BA1.0mg -'+ΚΤΟ.lmg.L—1中，在溫度15°C、每天光照14小時、光照強度為ΙΟΟΟΙχ的條件下培養(yǎng)30天，叢生芽的誘導(dǎo)率為32.53%，將培育的山葵叢生芽采用雙抗體夾心ELISA方法進行病毒檢測，其脫毒率為96.46% ；
[0023](4)選取生長的山葵叢生芽，將其分割為單株后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS+NAA0.05mg *L_^Θ-ΒΑΟ.lmg -L-1'+ΚΤΟ.05mg七1中，在溫度10°C、每天光照10小時、光照強度為ΙΟΟΟΙχ的條件下培養(yǎng)25天；[0024](5)選取選取步驟(4)中培育的生長健壯的山葵無根苗接入生根培養(yǎng)基White+NAA0.lmg -L-1中，在溫度15°C、每天光照6小時、光照強度為8001x的條件下培養(yǎng)30天，山葵無根苗的生根率為84.63% ；
[0025](6)當(dāng)無根苗長出3條以上不定根時，打開瓶蓋，先在溫度為15°C和相對濕度為80%的培養(yǎng)室內(nèi)煉苗2天，再將其從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水洗去不定根上的培養(yǎng)基后，移栽至由0.1%多菌靈消毒6小時和0.1%高錳酸鉀消毒12小時的土壤中生長，所述土壤是由蛭石和全營養(yǎng)土按2:1配制而成；脫毒苗在溫度12°C、相對濕度70%、每天光照4小時和光照強度為8001x的條件下生長，脫毒苗的存活率為92.62% ；
[0026]上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.6，瓊脂5.5g.L—1，蔗糖25g.L—1。
[0027]實施例2
[0028](1)切取山葵根莖上生長的芽體上部長度為0.3cm的芽尖部分，將其放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒3分鐘，再用無菌水清洗5次后，接種于促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基MS+KT1.0mg.L-1+ΝΑΑΟ.5mg.L-1中，在溫度18°C、每天光照8小時、光照強度為12001x的條件下進行培養(yǎng)25天，長到1.0cm以上的無菌芽體有92.26% ；
[0029](2)選取步驟(1)中培養(yǎng)的長度在1.0cm以上的無菌芽體，轉(zhuǎn)接入MS+6-BA2.0mg-L-1+IAAl.5mg.L-1+脯氨酸1.2%+活性炭2.0%的培養(yǎng)基中，先置于5°C的冰箱中低溫培養(yǎng)15天，再放在培養(yǎng)箱中進行12天的變溫處理，所述變溫處理是指在10°C培養(yǎng)19小時與在35°C培養(yǎng)5小時交替進行，芽體的存活率為96.57% ；
[0030](3)選取經(jīng)步驟(2)處理后生長良好的芽體于解剖鏡下，用解剖針小心剝?nèi)パ矿w外面的幼葉后，切取帶有2個葉原基的芽分生組織，接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基MS+6-BA2.0mg -L-1+ΚΤΟ.3mg -L-1中，在溫度18°C、每天光照12小時、光照強度為12001x的條件下培養(yǎng)30天，叢生芽的誘導(dǎo)率為51.42% ;將培育的山葵叢生芽采用雙抗體夾心ELISA方法進行病毒檢測，其脫毒率為94.76% ；
[0031](4)選取生長的山葵叢生芽，將其分割為單株后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS+NAA0.08mg-L_1+6-BA0.3mg -L-1+KT0.lmg噸―1中，在溫度15°C、每天光照12小時、光照強度為12001x的條件下培養(yǎng)25天；
[0032](5)選取步驟(4)中培育的生長健壯的山葵無根苗接入生根培養(yǎng)基White+NAA0.5mg -L-1中，在溫度18°C、每天光照8小時、光照強度為9001x的條件下培養(yǎng)30天，山葵無根苗的生根率為92.13% ；
[0033](6)當(dāng)無根苗長出4條以上不定根時，打開瓶蓋，先在溫度為18°C和相對濕度為88%的培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3天，再將其從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水洗去不定根上的培養(yǎng)基后，移栽至由0.1%多菌靈消毒8小時和0.1%高錳酸鉀消毒18小時的土壤中生長，所述土壤是由蛭石和全營養(yǎng)土按2:1配制而成；脫毒苗在溫度16°C、相對濕度75%、每天光照6小時和光照強度為1000lx的條件下生長，脫毒苗的存活率為98.37% ；
[0034]上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.8，瓊脂6.0g.L-1蔗糖30g.L'
[0035]實施例3
[0036](1)切取山葵根莖上生長的芽體上部長度為0.5cm的芽尖部分，將其放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒5分鐘，再用無菌水清洗6次后，接種于促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基MS+KT1.5mg.L1+NAAl.0mg.L—1中，在溫度20°C、每天光照12小時、光照強度為15001x的條件下進行培養(yǎng)25天，長到1.0cm以上的無菌芽體有100% ；
[0037](2)選取步驟(1)中培養(yǎng)的長度在1.0cm以上的無菌芽體，轉(zhuǎn)接入MS+6-BA3.0mg.L-1+ΙΑΑ2.0mg.L^+脯氨酸2%+活性炭3%的培養(yǎng)基中，先置于5°C的冰箱中低溫培養(yǎng)15天，再放在培養(yǎng)箱中進行15天的變溫處理，所述變溫處理是指在12°C的條件下培養(yǎng)19小時與在45°C的條件下培養(yǎng)5小時交替進行，芽體的存活率為83.36% ；
[0038](3)選取經(jīng)步驟(2)處理后生長良好的芽體于解剖鏡下，用解剖針小心剝?nèi)パ矿w外面的幼葉后，切取帶有4個葉原基的芽分生組織，接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基MS+6-BA3.0mg -L^+KT0.5mg -L-1中，在溫度22°C、每天光照14小時、光照強度為15001x的條件下培養(yǎng)30天，叢生芽的誘導(dǎo)率為76.45% ;將培育的山葵叢生芽采用雙抗體夾心ELISA方法進行病毒檢測，其脫毒率為73.52% ；
[0039](4)選取生長的山葵叢生芽，將其分割為單株后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS+NAA0.lmg.Ι^+6-ΒΑ0.5mg -L^+KT0.2mg -L-1中，在溫度18°C、每天光照16小時、光照強度為15001x的條件下培養(yǎng)25天；
[0040](5)選取步驟(4)中培育的生長健壯的山葵無根苗接入生根培養(yǎng)基ffhite+NAAl.0mg -L-1中，在溫度22°C、每天光照10小時、光照強度為ΙΟΟΟΙχ的條件下培養(yǎng)30天，山葵無根苗的生根率為89.21% ；
[0041](6)當(dāng)無根苗長出4條以上不定根時，打開瓶蓋，先在溫度為20°C和相對濕度為95%的培養(yǎng)室內(nèi)煉苗4天，再將其從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水洗去不定根上的培養(yǎng)基后，移栽至由0.1%多菌靈消毒10小時和0.1%高錳酸鉀消毒24小時的土壤中生長，所述土壤是由蛭石和全營養(yǎng)土按2:1配制而成；脫毒苗在溫度20°C、相對濕度80%、每天光照10小時和光照強度為12001x的條件下生長，脫毒苗的存活率為97.16% ；
[0042]上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.2，瓊脂6.5g.?Λ蔗糖35g.L'
[0043]實施例4
[0044]將實施例2步驟(1)中所述促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基改為MS+KT0.5mg.L-1+ΝΑΑΟ.8mg.?Λ其它步驟同實施例2，培養(yǎng)25天后，長到1.0cm以上的無菌芽體有90.57%。
[0045]實施例5
[0046]將實施例2步驟(2)中所述培養(yǎng)基改為MS+6-BA1.0mg.L-1+ΙΑΑΙ.5mg.L^+脯氨酸1.2%+活性炭2.0%，變溫處理的時間改為10天，其他步驟同實施例2，芽體的存活率為94.53%。
[0047]實施例6
[0048]將實施例2步驟(2)中山葵無菌芽體的變溫處理方式改為在8°C的條件下培養(yǎng)19h與在40°C條件下培養(yǎng)5h交替進行，其他步驟同實施例2，培育的山葵叢生芽用雙抗體夾心ELISA方法進行病毒檢測，其脫毒率為95.06%。
[0049]實施例7
[0050]將實施例2步驟(3)中所述葉原基的芽分生組織改接入MS+6-BAlmg -L-1+ΚΤΟ.5mg -L-1的叢生芽分化培養(yǎng)基中，在溫度16°C，每天光照13小時和光照強度為ΙΟΟΟΙχ的條件下培養(yǎng)30天，其他步驟同實施例2，叢生芽的誘導(dǎo)率為49.82%。
[0051]比較實施例1[0052]將實施例2步驟(2)中所述培養(yǎng)基改為MS+6-BA2.0mg.1^+2.4-D2.0mg.L_1+活性炭2.0%，其他步驟同實施例2，芽體的存活率為57.86%。
[0053]比較實施例2
[0054]將實施例2步驟(2)中山葵無菌芽體的變溫處理方式改為在5°C的條件下培養(yǎng)5h與在45°C條件下培養(yǎng)19h交替進行，其他步驟同實施例2，芽體的存活率為12.56%。
[0055]比較實施例3
[0056]將實施例2的步驟(2)取消，其他步驟同實施例2，培育的山葵叢生芽用雙抗體夾心ELISA方法進行病毒檢測，其脫毒率為31.43%。
[0057]比較實施例4
[0058]將實施例2步驟(5)中將實 施實例2中所述的生根培養(yǎng)基改為MS+NAA0.5mg -L-1,其他步驟同實施例2，山葵無根苗的生根率為79.73%。
【權(quán)利要求】
1.一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟:(1)切取山葵根莖上生長的芽體的芽尖部分，將其放在超凈工作臺上，先用0.1%的升汞消毒2~5分鐘，再用無菌水清洗后，接種于促進芽尖快速生長的培養(yǎng)基MS+KT0.5~1.5mg.L_1+NAA0.3~1.0mg.I71中，在12~20 °C、每天光照6~12小時、光照強度為1000~15001x的條件下進行培養(yǎng)；(2)選取步驟(1)中培養(yǎng)的長度在1.0cm以上的無菌芽體，轉(zhuǎn)接入MS+6-BA1.0~3.0mg.L_1+IAA0.5~2.0mg.L_1+脯氨酸0.5~2%+活性炭1~3%的培養(yǎng)基中，先在5°C的條件下培養(yǎng)15天，再放在培養(yǎng)箱中進行8~15天的變溫處理；(3)選取生長良好的芽體于解剖鏡下，用解剖針小心剝?nèi)パ矿w外面的幼葉后，切取帶有1~4個葉原基的芽分生組織，接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基MS+6-BA1~3mg.'+ΚΤΟ.1~ 0.5mg *L_1中，在15~22°C、每天光照10~14小時、光照強度為1000~15001x的條件下培養(yǎng)；(4)選取生長的的山葵叢生芽，將其分割為單株后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS+NAA0.05~0.lmg.L ^Θ-ΒΑΟ.1 ~0.5mg.L ^KT0.05 ~0.2mg.L 1 中，在 10 ~18 °C、每天光照 10 ~16小時、光照強度為1000~15001x的條件下培養(yǎng)；(5)選取生長健壯的山葵無根苗接入生根培養(yǎng)基White+NAA0.1~1.0mg.1中，在15~22°C、每天光照6~10小時、光照強度為800~ΙΟΟΟΙχ的條件下誘導(dǎo)生根；(6)當(dāng)無根苗長出3~4條以上不定根時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2~4天后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水洗去不定根上的培養(yǎng)基后，移栽至消毒后的土壤中生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(1)中所述芽體的芽尖部分是指芽體上部長度為0.2~0.5cm的芽尖部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中所述變溫處理是指在8~12°C的條件下培養(yǎng)19小時與在30~45°C的條件下培養(yǎng)5小時交替進行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)中所述土壤是由蛭石和全營養(yǎng)土按2:1配制而成，土壤消毒是指先采用0.1%多菌靈消毒6~10小時，再用0.1%高錳酸鉀消毒12~24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)中煉苗的培養(yǎng)條件為溫度15~20°C和相對濕度80%~95%，移栽后的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度12~20°C、相對濕度為70~80%、每天光照4~10小時和光照強度為800~12001x。
【文檔編號】A01H4/00GK103718963SQ201310724001
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王躍華, 孫雁霞, 劉洪明, 段茂華, 任三軍, 趙鋼, 宋超, 劉銀花, 唐川, 梅英, 徐恩琴, 唐鳳如, 江明殊, 李睿玉, 許志強 申請人:成都大學(xué)