使用性別選擇的精細胞提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在人工授精技術中通過使用性別選擇的精細胞提高豬的品系、品種或種群的遺傳進展的方法。本發(fā)明還涵蓋通過深子宮內導管或腹腔鏡手術對豬人工授精的方法，這使得性別選擇的精細胞的使用量降低。
【專利說明】使用性別選擇的精細胞提高豬的品系或品種的遺傳進展的 方法
[0001] 本申請要求2013年3月15日提交的美國申請?zhí)?3/840,598和2012年6月6日 提交的美國申請?zhí)?1/656, 446的權益。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及在人工授精技術中通過使用性別選擇的精細胞提高豬的品系、品種或 種群的遺傳進展的方法。本發(fā)明還涵蓋通過深子宮內導管或腹腔鏡手術（laparoscopic procedure)對豬人工授精的方法，這使得性別選擇的精細胞的使用劑量降低。
[0003] 背景
[0004] 在養(yǎng)豬業(yè)中有必要提高品系和品種中的需要的遺傳變化的速率以及降低育種和 商業(yè)化養(yǎng)豬場中的經營成本。本文中公開的本發(fā)明通過以下方式來實現這些目標：允許育 種或商業(yè)農場的經營者使用性別選擇的精細胞樣品選擇后代豬的性別和/或允許使用少 得多的遺傳優(yōu)良的公豬，后者是通過借助于深子宮內導管或腹腔鏡使用減少的用于人工授 精操作的精細胞劑量實現的。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明的一個實施方案包括一種提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法，所述方 法包括從來自所述品系或品種的公豬采集精液樣品；將所述精液樣品分選到至少兩個精細 胞亞群中，其中第一亞群的至少80%具有X染色體或Y染色體；用來自所述第一亞群的精 細胞對來自所述品系或品種的母豬授精；由所述母豬生產一個或多個后代；對一個或多個 所述后代計算選擇指數；和選擇一個或多個具有與所述品系或品種的平均選擇指數相比更 高的選擇指數的所述后代與來自所述品系或品種的豬育種以便提高所述品系或品種的遺 傳進展。
[0007] 本發(fā)明的另一個實施方案包括一種提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法，所述 方法包括從來自所述品系或品種的公豬采集精液樣品；將所述精液樣品分選到至少兩個精 細胞亞群中，其中第一亞群的至少80%具有X染色體或Y染色體；用來自所述第一亞群的 精細胞對來自所述品系或品種的母豬授精；由所述母豬生產一個或多個后代；在一個或多 個所述后代中獲得性狀的數值；和選擇一個或多個所述后代與來自所述品系或品種的豬育 種以便提高所述品系或品種的遺傳進展，所述后代具有的所述性狀的數值比所述品系或品 種中的所述性狀的平均值更大或更小。
[0008] 在本發(fā)明的一些實施方案中，要與本發(fā)明一起使用的精液樣品被分選到至少兩 個精細胞亞群中，其中至少 60 %、60-65 %、65 %、65-70 %、70 %、70-75 %、75 %、75-80 %、 80%、80-85%、85%、85-90%、90%、90-95%、95%、95-99%或約99%的第一亞群具有父染 色體和/或Y染色體。
[0009] 另一種用于提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法包括使用從所述品系或品種 的公豬獲得的性別選擇的精細胞樣品制備一個或多個胚胎或受精卵（在體內或體外），并 且隨后通過本領域已知的任何方法將所述一個或多個胚胎或受精卵轉移到母豬中妊娠。在 本發(fā)明的某些方面中，卵供體是來自某種品系或品種的母豬。在本發(fā)明的一些具體實施方 案中，使用深子宮內導管或腹腔鏡將所述胚胎或受精卵轉移到母豬中或轉移出母豬。這種 方法還可以進一步包括以下步驟：計算由所述胚胎或受精卵產生的一個或多個后代的選擇 指數；根據與所述品系或品種的平均選擇指數相比具有更高的選擇指數的所述一個或多個 后代選擇一個或多個所述后代；使用與所述品系或品種的平均選擇指數相比具有更高的選 擇指數的所述一個或多個后代與來自相同品系或品種的豬育種以便提高那種品系或品種 的選擇強度。本發(fā)明的另一個實施方案包括使用這些胚胎或受精卵重組（repopulate)品 系、品種和/或種群。
[0010] 本發(fā)明的另一個方面包括根據在所述胚胎或受精卵中存在或不存在遺傳標記選 擇用于本發(fā)明的胚胎或受精卵。在某些實施方案中，這種遺傳標記可以通過從所述胚胎或 受精卵中移除一個或多個卵裂球并且檢測所述一個或多個卵裂球存在或不存在所述遺傳 標記來篩選。所述遺傳標記可以是，例如，本文中公開的任何豬性狀的標記或與本文中公開 的任何豬性狀有關的標記。在某些實施方案中，在4-16細胞期、4-10細胞期或4-8細胞期 從所述胚胎或受精卵移除一個或多個卵裂球?？梢允褂帽绢I域已知的任何技術從胚胎或受 精卵移除卵裂球，包括但不限于在美國專利號7, 893, 315中公開的那些，所述專利的公開 內容在此以引用方式全部并入本文。簡單地說，其中描述的一種方法包括固定胚胎并且輕 敲所述固定的胚胎直到卵裂球被分離（所述胚胎可以使用微量吸管固定并且輕敲所述微 量吸管的支架以分離所述卵裂球）。在某些實施方案中，篩選所述胚胎或受精卵的遺傳標記 包括將從所述胚胎或受精卵獲得的卵裂球或細胞基因分型。篩選胚胎或受精卵的遺傳標記 的技術在美國專利號8, 338, 098中公開，所述專利的公開內容在此以引用方式全部并入本 文。簡單地說，可以使用匯集DNA測序手段確定單核苷酸多態(tài)性（SNP)，并且隨后可以通過 基于PCR-限制性片斷長度多態(tài)性（PCR-RFLP)的方法實現確定的SNP的基因分型。
[0011] 與本發(fā)明一起使用的分選的精細胞構成"性別選擇的"精細胞樣品。性別選擇的 精細胞樣品可以通過本領域已知的任何技術獲得。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述性別 選擇的精細胞樣品可以使用流式細胞儀制備。在本發(fā)明的任何實施方案中使用的性別選擇 的精細胞可以使用任何已知的方法低溫保存并且隨后在使用之前解凍，或者此外可以使用 新鮮的（即，從未冷凍）性別選擇的精細胞。
[0012] 術語"品系"和"品種"表示具有共同來源和相似的識別特性的一組動物。本發(fā)明 還適用于豬的"純品系"和"純品種"，正如本領域中使用的那些術語。
[0013] 術語"選擇指數"是指根據育種者選擇的某些性狀的豬的表達對于個別豬品種產 生的數值評分。通常育種者將會對每個豬的品系或品種指定給定數目的性狀（常稱為選擇 對象），并且可以進一步區(qū)別地衡量每個性狀在產生選擇指數中的重要性。對于豬來說更高 的選擇指數表示豬表達或攜帶那些性狀的程度更高。
[0014] 在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用任何想要的基因型或表現型性狀為豬的品 系或品種構建選擇指數?？梢栽谶x擇指數中使用的表現型性狀包括但不限于飼料轉化率、 平均日增重、胴體瘦肉、胴體品質、生育力、每窩產仔數和產奶量。
[0015] 在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用僅僅從那個特定的豬獲得的數據（即，個 體數據）來計算特定的豬的選擇指數，或者此外，可以使用來源于包括那個特定的豬或是 那個特定的豬的代表的數據（即，群體數據）來計算特定的豬的選擇指數。例如，可以在個 體的公豬中測量飼料轉化率一因此，在這個實例中的公豬的選擇指數將會基于個體數據。 此外，可以測量與所討論的公豬一起飼養(yǎng)的公豬群體的飼料轉化率一在這個實例中的公豬 的選擇指數基于群體數據。
[0016] 本發(fā)明的其它方面涵蓋使用深子宮內導管或插入所述母豬的膜的針頭用性別選 擇的精細胞對來自所述品系或品種的母豬授精。這些實施方案中的一些涵蓋可用于將精細 胞放入母豬的生殖道中的已知的手術和非手術技術，包括剖腹手術（涉及穿過腹壁的大切 口以進入腹腔的手術操作）。這種實施方案涵蓋使用IxlO 9或更少個總精細胞對母豬授精。
[0017] 在其它實施方案中，可以使用深子宮內導管將精細胞樣品施用到母豬的生殖道的 遠端部分中，如一個或多個子宮角或一個或多個子宮-輸卵管接合處。在本發(fā)明的另一個 方面中，所述深子宮內導管由外管或外鞘和內柔性探針組成。在本發(fā)明的又一個方面中，所 述柔性的內探針包括液體或細胞可以通過的柔性內管道。在本發(fā)明的某些實施方案中，所 述外管和內柔性探針可以由塑料制成，在其它實施方案中，它們可以由被構造成諸如盤管 或彈簧構造等的柔性金屬制成。在又一個實施方案中，所述深子宮內導管包括用于觀察母 豬的生殖道內的深子宮內導管遠端部分的位置的攝像機或顯示器。在替代實施方案中，可 以使用放射顯影或熒光透視法觀察所述所述母豬的生殖道內的深子宮內導管。在本發(fā)明的 另一個實施方案中，可以使用深子宮內導管從諸如來自一個或多個子宮角或來自一個或多 個子宮-輸卵管接合處的母豬的生殖道遠端部分插入或取出胚胎或受精卵等。
[0018] 相對于用深子宮內導管授精，涵蓋對母豬施用IxlO9個精細胞或更少的劑量。這些 精細胞可以是性別選擇的精細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過深子宮內導管將一定 劑量的性別選擇的精細胞（例如600xl0 6個，但是可以更多，或在發(fā)情期最佳時機放入最佳 位置就低至IOxlO6個）施用到母豬的一個或兩個子宮角（例如，每個子宮角中300xl0 6個精 細胞）中。在其它實施方案中，劑量可以在約300xl06、約150xl06、約140xl0 6、約ΙΟΟχΙΟ6、 約70xl06、約50xl06或約5x10 6個性別選擇的精細胞或更少的范圍內變化或在這個范圍之 間的任何劑量，并且可以施用到母豬的一個或兩個子宮角中。
[0019] 上述劑量可以在多種體積中施用，包括但不限于每150xl06個精細胞5ml，或 相同數目的細胞在以下范圍的體積中施用：5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml或100ml， 或 5-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、80-90ml 或 90-100ml之間的某個體積。
[0020] 在本發(fā)明的任何實施方案中使用的性別選擇的精細胞可以低溫保存并且隨后解 凍，或此外可以使用新鮮（即，從未冷凍）性別選擇的精細胞。上述劑量也可以施用到母豬 的一個或多個子宮-輸卵管接合處中。
[0021] 本發(fā)明的這種實施方案也涵蓋使用腹腔鏡觀察用于施用性別選擇的精細胞樣品 的插入母豬的膜的針頭。用于注射精細胞樣品的針頭和腹腔鏡（以及諸如鑷子等操縱儀 器）都可以通過腹腔鏡手術典型的小切口插入母豬的腹部。本發(fā)明還涵蓋在雌性生殖道內 的一個或多個位置中注射精細胞樣品。僅通過舉例的方式，可以將精細胞樣品注射到母豬 子宮內的一個或多個位置中，包括一個或多個子宮角、輸卵管、壺腹、峽部或子宮-輸卵管 接合處。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以借助于腹腔鏡從母豬的生殖道插入或取出胚 胎或受精卵。
[0022] 相對于借助于腹腔鏡授精，涵蓋對母豬施用IxlO9個精細胞或更少的劑量。這些精 細胞可以是性別選擇的精細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過腹腔鏡將約500xl06 個性別選擇的精細胞或更少的劑量注射到一個或兩個輸卵管中（例如，每個輸卵管中 25(^106個精細胞）；在其它實施方案中，可以將在約1(^10 6、約51106、約31106、約2.(^106、 約I. 2xl06、約IxlO6或0. 6x10 6個性別選擇的精細胞或更少范圍內的劑量或在這個范圍之 間的任何劑量注射到母豬的一個或兩個輸卵管中。
[0023] 在又一個實施方案中，可以將性別選擇的精細胞注射到輸卵管的特定區(qū)域中，包 括但不限于峽部、壺腹和/或子宮-輸卵管接合處。在某些實施方案中，可以將在約5xl0 6、 約2xl06、約lxlO6、約600xl03、約500xl0 3、約300xl03或約150x10 3個性別選擇的精細胞或 更少范圍內的劑量或在這個范圍之間的任何劑量注射到輸卵管的一個或多個區(qū)域，無論是 單側或雙側。
[0024] 在又一個實施方案中，就借助于腹腔鏡授精而論，可以使用在每個壺腹中注射約 500xl0 3個性別選擇的精細胞每個子宮-輸卵管接合處注射約1x10 6個性別選擇的精細胞 范圍內的劑量；或每個壺腹注射約IxlO6個性別選擇的精細胞每個子宮-輸卵管接合處注 射約2xl0 6個性別選擇的精細胞的劑量；或每個壺腹注射約5x105個性別選擇的精細胞每個 子宮-輸卵管接合處注射約2xl0 6個性別選擇的精細胞的劑量；或每個壺腹注射約5x10 5個 性別選擇的精細胞每個子宮-輸卵管接合處注射約IxlO6個性別選擇的精細胞的劑量或在 這些范圍之間的任何劑量在輸卵管中的多個部位多次注射。上述劑量可以包含在多種體積 中，舉例來說，每IxlO 12個精細胞1〇〇μ 1，或相同數目的精細胞在以下體積之一中或在以下 任何體積之間的體積中：50μ 1、100μ 1、200μ 1、300μ 1、400μ 1 或 500μ 1。
[0025] 本發(fā)明的另一個方面包括通過對母豬施用一種或多種激素或激素類似物使要使 用本文中公開的實施方案授精的母豬發(fā)情期同步和/或誘導定時排卵。在一個實施方案 中，所述一種或多種激素或激素類似物包括PG600 (包含懷孕母馬血清促性腺激素、"PMSG" 和人絨毛膜促性腺激素、"hCG" ；InterVet)、OvuGel (借助于陰道內輸送系統(tǒng)的醋酸曲普瑞 林緩釋配方；Gel Med Sciences, Inc.)、馬絨毛膜促性腺激素、"eCG"、hCG或孕激素。
[0026] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述一種或多種激素或激素類似物是通過放入所 述母豬的生殖道的可編程裝置施用的。本文中涵蓋的可編程裝置能夠以定時釋放的方式釋 放所述一種或多種激素或激素類似物，所述方式不需要育種者必須監(jiān)測所述裝置或提供除 了編制釋放所述一種或多種激素或激素類似物的初始參數的程序之外的任何輸入。在本發(fā) 明的另一個實施方案中，可以通過施用1250至1500IU的eCG以及隨后施用750IU的hCG 72至80小時后誘導母豬的同步發(fā)情/定時排卵。在另一個實施方案中，可以通過施用400 至2000IU的PMSG以及隨后施用500至1000IU的hCG72至83小時后誘導母豬發(fā)情。
[0027] 其它實施方案進一步涵蓋通過研究所述母豬的卵泡檢測母豬的排卵。在本發(fā)明的 一個特定實施方案中，使用超聲研究所述母豬的卵泡。在又一個實施方案中，是在hCG注射 之后25-35小時開始通過每3-5小時經直腸超聲來研究所述母豬的卵巢是否存在預排卵卵 泡的。在本發(fā)明的又一個實施方案中，選擇超聲2-3小時之后顯示有多個預排卵卵泡的母 豬進行授精。
[0028] 本發(fā)明此外涵蓋一種提高豬種群或養(yǎng)豬場中的遺傳優(yōu)良的公豬后代數目的方法， 它包括從種群或養(yǎng)殖場中的公豬群體建立一個或多個遺傳優(yōu)良的公豬的亞群；從所述一個 或多個遺傳優(yōu)良的公豬中獲得精細胞樣品；從每個所述精細胞樣品中制備多個精細胞劑 量；對所述種群或所述養(yǎng)殖場中的多個母豬施用一種或多種激素或激素類似物以便確定每 只母豬的已知排卵時間；和使用深子宮內導管或腹腔鏡手術用一個或多個精細胞劑量對所 述母豬授精，其中對每個母豬一起施用的一個或多個精細胞劑量包含總共小于IxlO 9個的 精細胞。這些步驟還可以用于減少豬種群或養(yǎng)豬場中育種所需的公豬數目。在某些實施方 案中，遺傳優(yōu)良的公豬包括相對于所述種群或所述養(yǎng)殖場內的其它公豬具有更高的選擇指 數的公豬。
[0029] 本發(fā)明還涵蓋一種提高豬種群或養(yǎng)殖場的利益率的新方法，它包括根據所述種群 或養(yǎng)殖場從屬的市場條件計算雄豬和雌豬的單豬凈收入；確定是雄豬還是雌豬產生更高的 單豬凈收入；從公豬中采集精液樣品；將所述精液樣品分選到至少兩個精細胞亞群中，其 中（i)如果雌豬產生更高的單豬凈收入那么第一亞群中的至少80%具有X染色體，或（ii) 如果雄豬產生更高的單豬凈收入那么第一亞群中的至少80%具有Y染色體；用來自所述第 一亞群的精細胞對母豬授精；和由所述母豬生產后代。
[0030] 本文中使用的術語"母豬"涵蓋小母豬（還沒有產仔的幼年雌豬）以及任何生殖 成熟的雌豬。
[0031] 本發(fā)明的任何實施方案都可以使用是遺傳核心或繁殖種群成員的母豬。類似地， 本發(fā)明的任何實施方案都可以使用是遺傳核心或繁殖種群成員的公豬。
[0032] 附圖簡述
[0033] 圖1示意性地說明可以用于將精細胞樣品分選到具有X或Y染色體的一個或多個 亞群中的流式細胞儀。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 本發(fā)明的實施方案針對通過使用性別選擇的精液樣品授精提高豬種群或品系中 的想要的遺傳變化或進展的速率的方法。使用性別選擇的精細胞產生具有全部是雄性或全 部是雌性的高概率的后代，這取決于使用的單獨的亞群。如下面所示，這種能力為豬育種業(yè) 提供顯著的優(yōu)勢，因為該產業(yè)非常重視每年的遺傳進展。使用性別選擇的精細胞的額外的 好處是降低與維持兩種性別的基礎設施和物資有關的經營成本一例如，對雄豬和雌豬分開 飼養(yǎng)的需求消失或大大降低，對雄性和雌性維持兩種不同飼料提供鏈的需求也是這樣（雄 性通常飼喂蛋白更高的飼料）。只銷售公豬或小母豬的養(yǎng)殖場基本上可以使用性別選擇的 精細胞授精使其生產力加倍。此外，他們可以使其成年種群庫存降低50%并且因此降低需 要的流動資本投資。如果所述性狀在一個性別中相比其它性別中表達或表達更強，實現在 豬中使用性別選擇的精細胞還允許育種者提高或降低給定豬同窩仔畜（litter)或種群中 的性狀。例如，為了降低肉的"公豬氣味（boartaint)"在商業(yè)農場中往往將雄性閹割一因 此，只產生雌性的能力會消除對閹割的需求并且完全消除"公豬氣味"的問題。
[0036] 然而，產生性別選擇的精細胞樣品的過程是既費時又費錢的，通常需要使用專業(yè) 化流式細胞術設備、訓練有素的技術人員和復雜的過程。遺憾的是，使用諸如子宮頸內授精 等傳統(tǒng)的人工授精技術成功授精需要的公豬精細胞的一般劑量是IxlO 9個精細胞至3x10 9 個精細胞，而一般的公豬精液包含大約6χ101(ι個精細胞。因此，一般的公豬精液包含大約20 至60個人工授精劑量，大大限制性別選擇的精細胞樣品在育種豬中的商業(yè)應用。此外，每 個發(fā)情周期對雌豬最少授精兩次。因此，如果可以降低成功授精需要的精細胞的總量，給定 的公豬就可以在一定的時間內產生更高數目的人工授精劑量，使性別選擇的精細胞樣品的 使用在商業(yè)觀點上更合乎需要。為了優(yōu)化性別選擇的精細胞樣品在豬中的商業(yè)應用，本發(fā) 明還涵蓋降低有效的人工授精劑量需要的樣品中的精細胞總數的方法，它包括借助于深子 宮內導管和腹腔鏡授精。成功授精需要的精細胞數量降低產生了減少育種需要的公豬數目 以及其相關成本的額外好處。
[0037] A.提高遺傳變化速率
[0038] 通過使用本發(fā)明來選擇某種品系中的后代的性別，可以提高種群或品系的想要的 遺傳變化的速率。在這里，遺傳變化或遺傳進展表示對于給定的性狀，連續(xù)世代中的個體會 使所述想要的性狀比上代表達更強。就不想要的性狀而論，遺傳進展表示連續(xù)世代中的個 體會使所述性狀比上代表達更弱。
[0039] 從一代到下一代的遺傳進展（AG)可以根據選擇的親代的平均遺傳水平與選擇 的候選者（可用于選擇的動物）的平均遺傳水平之間的差異來衡量。在理想條件下，這取 決于所述性狀的遺傳率（h 2)和選擇的親代的平均表現（P)和選擇的候選者的平均表現（A) 之間的差異。選擇的親代的平均表現（P)和所有選擇的候選者的平均表現（A)之間的差異 (其中選擇的親代是子集）也稱為選擇差（SD)。
[0040] Δ G = h2 (P-A)
[0041] 選擇差前面的符號表明選擇的方向-正值表示較大表現型數值的選擇，而負的選 擇差表示較小表現型數值的選擇。因此，如果目標是選擇較大的表現型數值，就將所述品 系、品種和/或種群內的相對于其它個體具有大的正選擇差的個體視為優(yōu)良個體并且可以 在那個基礎上被選為親代。類似地，如果目標是選擇較小表現型數值，就將所述品系、品種 和/或種群內的相對于其它個體具有大的負選擇差的個體視為優(yōu)良個體并且可以在那個 基礎上被選為親代。
[0042] 在消除非遺傳影響時（例如通過比較每個表現記錄與同群的平均值）以及在除了 所述動物本身的信息之外還使用來自親屬的信息時，選擇是更有效的。這是通過計算估計 的育種值（EBV)實現的。在選擇基于EBV時，預期的遺傳進展等于選擇的動物的平均EBV 和選擇的候選者的平均EBV之間的差異。
[0043] AG = Pebv-Aebv
[0044] 那么遺傳進展的年率就是：AG/t = (Pebv-Aebv)/t，其中t是代間隔。換句話說，遺 傳進展的年率取決于代間隔以及親代EBV相對于選擇候選者的優(yōu)越性。在本發(fā)明的某些實 施方案中，可以使用諸如最優(yōu)線性無偏預測（BLUP)等統(tǒng)計模型來確定EBV，不過本領域已 知的任何統(tǒng)計模型都可以與本發(fā)明一起使用。
[0045] 通常，在對豬育種時，選擇一種以上的性狀。然而，在有多種性狀要選擇時，選擇必 須根據其經濟價值、它們對選擇的響應如何（遺傳率）和它們怎樣影響彼此（遺傳相關） 來權衡每個性狀。實現這種平衡的一種方式是建立選擇指數，這取決于以上數值和每個動 物的每個性狀的EBV。對于選擇指數的遺傳進展的預測與個體EBV的相同，S卩，所述指數中 的改變的年率是代間隔和選擇的親代的指數和選擇的候選者的指數之間的差異的函數。
[0046] 在大的群體中，選擇差取決于檢測多少動物以及選擇多少動物-選擇的比例越 低，選擇差越高。因此，為了使遺傳進展最大化，人們應該根據選擇指數為所有測試動物分 級并且隨后選擇維持所述品系、品種和/或種群規(guī)模需要的頂端公豬和母豬的最小數量。 這保證選擇的動物的平均指數基本上高于檢測的所有動物的平均指數。
[0047] 如上所示，遺傳進展取決于識別作為下一代的親代的優(yōu)良個體。有兩種方法用于 衡量選擇的個體的表現型優(yōu)越性：選擇差（如上討論的）和選擇強度。這兩種尺度對于性 狀來說密切相關，數值分布正如預期的的那樣是正態(tài)分布。選擇差等于選擇強度和表型標 準偏差的乘積。因為選擇強度與標準偏差的單位相同，所以比較不同性狀的選擇壓力而不 考慮用于衡量表現的單位類型是可能的。
[0048] 此外，人們可以把選擇作為親代的候選者的比例轉化成選擇強度，因為在群體的 比例和正態(tài)分布中的平均值之間的標準偏差的數目之間有直接的關系。因此，選擇的群體 的比例越小，選擇強度越大并且遺傳進展越大，其它一切相等。
[0049] 此外，為了實現更高的遺傳進展速率，人們也想保持代間隔較小一代間隔是其子 代出生時種群中的親代的平均年齡并且可以通過加快所述品系、品種和/或種群中的公豬 和母豬的替換來降低。為了使豬的代間隔保持較低，應該在公豬達到一歲大之前淘汰，母豬 在一次或兩次產仔之后淘汰。最后，為了提高遺傳進展，選擇的一個或多個性狀應該具有高 水平的遺傳率。性狀的遺傳率是與環(huán)境相比，由于遺傳差異，在群體內的個體之間的性狀的 看得見的差異的比例。
[0050] 養(yǎng)豬業(yè)中的重要性狀的實例是飼料轉化率，即，衡量動物將飼料質量轉化成身體 質量增加的效率的尺度（也稱為飼料轉化率或飼料增重比），和平均日增重，即，動物每天 的平均增重。性狀是用不同單位衡量的（例如，豬的數量、每日的磅數、英寸等），性狀在所 有全球市場中的經濟重要性不相等，并且遺傳影響的程度不相同（即，不同遺傳率）。一般 來講，諸如飼料轉化率和平均日增重等產量性狀具有高遺傳率。相比之下，諸如生育力和每 窩產仔數等繁殖性狀一般來講具有低遺傳率。
[0051] 在本發(fā)明的某些實施方案中，能夠將公豬精細胞分離成具有X和具有Y的亞群的 效率是可以在品系、品種或種群中選擇的性狀。提高這種性狀的表現允許以較高速率分選 具有X和具有Y的亞群和/或與所述品系、品種和/或種群中的個體平均值相比具有更高 的純度水平，其它一切相等。可以測定公豬精液樣品的某些性狀來評價能夠分選其精液的 效率，包括未處理精液中的死亡精子數量，以及精細胞攝取DNA選擇性染料（如Hoechst 33342)的好壞，從而建立在用流式細胞儀分選時使用的染色方法的飽和。舉例來說，精液樣 品中的死亡精細胞的數量或百分比可以使用優(yōu)先結合損壞或死細胞的有色或熒光染料來 評價。優(yōu)良的染料飽和與在流式細胞儀上觀察到的具有X和具有Y染色體的優(yōu)良的分離和 /或由流式細胞儀為具有X和具有Y染色體的亞群產生的直方圖的優(yōu)良的"峰谷"比有關。
[0052] 豬產量可以由多水平金字塔表示，在下一個更低的水平中使用處于每個水平的某 些后代進行育種。金字塔的頂部水平就是核心種群。自上而下的下一個水平分別是子代核 心種群，繁殖種群，最后是商業(yè)養(yǎng)殖場。
[0053] 核心種群通常由12至15個品系組成，不過可以提供任何數目的品系，每個品系都 包括若干需要的性狀。
[0054] 每個品系也可以根據育種者為那個品系選擇的性狀選定其自己的選擇指數，針對 每個品系內的后代進行評價一具有更高選擇指數評分的后代是更想要的。如上所述，特定 的豬的選擇指數可以使用個體數據或群體數據來計算。選擇指數的目的是為各種性狀的每 一個選定適當的重點以提供在比較不同動物中使用的單個值。只有具有最高的測定的選擇 指數的后代才可保留在核心種群中。每個品系內的母豬是公豬品系母豬，即，用于繁殖雄 性，或小母豬品系母豬，即，用于繁殖雌性。公豬品系母豬的雌性后代被舍棄。同樣地，小母 豬品系母豬的雄性后代也被舍棄。
[0055] 因此，使用本發(fā)明的性別選擇的精細胞授精，與使用傳統(tǒng)的、未分選的精液相比， 公豬品系母豬的后代是雄性的可能性更高，而小母豬品系母豬的后代是雌性的可能性更 高，從而顯著地提高相應的品系的選擇強度，因為有正確性別的更大后代群體要測定并且 隨后從其中選擇親代。例如，可以使用本文中公開的技術分離取自公豬品系公豬的精細胞 樣品，從而建立其中至少80%的精細胞具有Y染色體的亞群（在小母豬品系上使用本發(fā)明 時，可以使用其中至少80 %的精細胞具有X染色體的亞群）。隨后可以使用那個亞群或那 個亞群的一部分對公豬品系母豬授精。因為來自那個母豬的后代至少有80%的可能性是雄 性，所以所述公豬品系的選擇強度將被提高，因為將會有更多可供選擇的雄性。
[0056] 在子代核心水平或"品系繁殖"水平，用來源于所述核心種群的公豬精液對來自某 一品系的母豬授精。在繁殖場種群水平，得到的母豬通常與不同品系的公豬雜交。繁殖場 種群通常是小母豬繁殖場或公豬繁殖場。小母豬繁殖場產生親代小母豬而公豬繁殖場產生 親代公豬。親代小母豬被送到商業(yè)化養(yǎng)殖場以替換年長或死亡的小母豬和母豬，而親代公 豬被送到公豬場以產生在人工授精中使用的精細胞。
[0057] B.改變跨窩或種群性狀的表現
[0058] 如上所述，在豬育種中使用性別選擇的精液允許人們提高（或降低）給定同窩或 種群中的某些性狀的表現，如果那些性狀在一種性別中比另一種性別中表達或表達更強 烈。
[0059] 例如，小母豬具有比閹公豬更高的飼料轉化率（在性成熟之前已經被閹割的雄 豬）。因為飼料費占豬生產成本的相當大的比例，同窩仔全部或基本上全部由雌性組成可 以為育種者或養(yǎng)殖場提高利益率，這取決于當地市場條件。此外，與閹公豬（年幼的閹割 雄性）相比，小母豬（年幼的雌性）通常具有更低的體重、更低的平均日增重、更低的平均 每日采食量并且瘦肉更多（更小的背脂厚度、更大的腰肌厚度、更高的無脂瘦肉指數）。因 此，雖然小母豬可能長得比閹公豬慢，但是它們將是更瘦并且更有效率的，因此在正確的市 場條件下對于養(yǎng)殖場來說可能是更有利可圖的。
[0060] 因此，在市場條件下，在豬中使用性別選擇的精液可以通過選擇具有最想要的性 狀的性別允許人們提1?養(yǎng)殖場的利益率。
[0061] 實施例1-性別選擇的公豬精細胞樣品的制備
[0062] 用于制備性別選擇的公豬精細胞樣品的以下過程只是通過非限制性實施例的方 式提供的。制備性別選擇的公豬精細胞樣品的第一步是從合適的公豬獲得精液。一旦采集 到精液，就可以將它在可能包含抗氧化劑的合適的稀釋劑中稀釋。隨后可以稀釋所述精液 的富含精液組分。如果所述樣品需要在性別選擇之前運輸，那么在從采集點運輸到性別分 選處理的流式細胞儀的同時可以將所述樣品保持在〇_39°C (通常16-17°C)的溫度下約12 小時至約18小時。
[0063] 一旦所述精細胞樣品在實驗室中，就可以對所述精細胞樣品進行各種質量檢查， 包括檢查運動力（motility)(例如，借助于CASA系統(tǒng)）、生存力（例如，借助于流式細胞 儀）、形態(tài)（例如，借助于顯微鏡）和濃度（例如，借助于NucleoCounter)。將通過這些質 量檢查的精細胞樣品準備用于分選。
[0064] 在使所述樣品通過流式細胞儀之前，用DNA選擇性染料將樣品染色，暴露于淬滅 染料以形成染色的精細胞樣品，隨后將其放入流式細胞儀的精細胞源。具體地講，在一些 實施方案中，所述精細胞樣品首先可以用諸如BTS等緩沖液或稀釋劑（參見表1)稀釋至 最終濃度，在一些情況下可以是IOOxlO 6個細胞/ml，隨后添加 DNA選擇性染料Hoechst 33342(可以是在MiliQ水中5mg/ml ;Ref:B-2261)，良好的工作濃度可以是約5μ 1/1億個 細胞/ml，但是DNA染料可以在在0. 5至20ul/l億個細胞/ml范圍內的更低和更高濃度使 用。隨后通常將所述樣品放入30和42°C (通常接近35°C )之間的覆蓋的浴水中10分鐘 到12小時，特別好的染色為約50分鐘，隨后在分選之前將其放在室溫（21-22°C )的黑暗區(qū) 域。在分選樣品之前，將樣品過濾以除去大碎片和細胞（例如用〇. 30μπι的CellTricks) 并且在過濾之后可以添加紅色食用染料（添加時，通常是在Mi IiQ水中的0. 5-5μ 1或1μ 1 的25mg/ml儲備溶液），或可以向所述樣品中添加另一種淬滅染料。隨后可以流式細胞儀分 選所述樣品，所述流式細胞儀使用在一些情況下可以包含表2中列出的成分的鞘液，但是 也可以使用其它鞘液。
[0065] 圖1以示意圖的形式說明用于分選精細胞樣品以形成一個或多個亞群的流式細 胞儀的一部分，所述流式細胞儀通常引用為10。在這種特定的實施方案中，進行性別分選以 便所述亞群是具有X染色體的精細胞和具有Y染色體的精細胞。圖1提供用于分選精液的 單一技術，但是本領域已知的分選細胞的任何已知技術都可以與本發(fā)明的某些實施方案一 起使用。
[0066] 圖1的流式細胞儀10可以由操作者編程以產生兩個帶電液滴流，一個包含具有X 染色體的精細胞，帶正電，12, 一個包含具有Y染色體的精細胞，帶負電，13,而不帶電的未 偏轉死細胞流14直接進入廢液。
[0067] 操作者還可以選擇用這樣的方式對所述流式細胞儀編程，即使用"高純度分選"同 時收集具有X和Y染色體的精液（換句話說只收集活的具有X和Y染色體的精液），或對所 述流式細胞儀編程以使用"富集分選"同時收集具有X和Y染色體的精液（換句話說，這將 采集包含活的先前未分選的并且通過使用控制所述流式細胞儀的計算機可用的布爾邏輯 門再次排除所有最初死亡的液滴）。所述布爾邏輯門也可以用于只收集具有X或Y染色體 的精液中的任一種。
[0068] 開始，以精細胞流能夠被在鞘液源16的壓力下提供給噴嘴15的鞘液共軸環(huán)繞的 方式將在壓力下的精細胞流從精細胞源11注到管口 15中?？梢源嬖诘恼袷幤?7能夠借 助于振蕩器控制機構18被非常精確地控制，在噴嘴15內產生壓力波并且在精細胞流離開 噴嘴口 19時將壓力波傳輸到共軸環(huán)繞的精細胞流。結果，流出的共軸環(huán)繞的精細胞流20 能夠最終并且有規(guī)則地形成液滴21。
[0069] 相應的液滴流帶電是通過細胞傳感系統(tǒng)22實現的，細胞傳感系統(tǒng)22包括照射噴 嘴排出流20的激光23,并且通過傳感器24檢測熒光流的光發(fā)射。傳感器24接收的信息被 傳送到分選機識別系統(tǒng)25,分選機識別系統(tǒng)25非常迅速地決定是否為形成的液滴充電并 且如果充電為形成的滴劑提供什么電，于是隨后為液滴21充電。
[0070] 具有X染色體的精液的特性是它們比具有Y染色體的精液吸收更多的熒光染料， 因為它們存在更多的DNA，因此，具有X染色體的精液中的激光激發(fā)的吸收的染料發(fā)射的光 的量與具有Y染色體的精液的不同，而這種差異向分選機識別系統(tǒng)25傳達適用于理論上只 包含一個具有X或Y染色體的精細胞的單個液滴的電荷類型。死細胞（或將要死亡的細 胞）通常吸收向分選機識別系統(tǒng)25傳達不對包含這些細胞的液滴施加電荷的淬滅染料。
[0071] 所述帶電或不帶電的液滴流隨后在一對靜電帶電板26之間通過，靜電帶電板26 使它們偏離一種路線或另一種路線或根本不偏離，這取決于其電荷，進入相應的收集容器 28和29,分別形成具有X染色體的性別富集的群體和具有與其DNA有關的DNA選擇性染料 的性別富集的具有Y染色體的精液細胞。包含死細胞（或將要死亡的細胞）的不帶電非偏 離亞群流進入廢液容器30。
[0072] 性別選擇的精細胞樣品是在具有2. 5ml捕獲液體（catch fluid)的50ml管子中 收集的，對于每2千萬細胞來說，所述捕獲液體在某些實施方案中可以是具有2%蛋黃的 TesTris葡萄糖（TTG)(參見表3)。在這個實施方案中，所述性別選擇的精細胞樣品通常具 有大約24ml的最終體積，每ml約IxlO 6個細胞。隨后將這個管子在室溫下在暗室中儲存 約2小時。
[0073] 表I-BTS稀釋劑
[0074]
【權利要求】
1. 一種提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法，其包括以下步驟： 從來自所述品系或品種的公豬采集精液樣品； 將所述精液樣品分選到至少兩個精細胞亞群中，其中第一亞群的至少80%具有X染色 體或Y染色體； 用來自所述第一亞群的精細胞對來自所述品系或品種的母豬授精； 由所述母豬生產后代； 對一個或多個所述后代計算選擇指數；和 選擇一個或多個具有與所述品系或品種的平均選擇指數相比更高的選擇指數的所述 后代與來自所述品系或品種的豬育種以便提高所述品系或品種的遺傳進展。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述品系或品種是小母豬品系并且所述第一亞群具 有X染色體。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述品系或品種是公豬品系并且所述第一亞群具有 Y染色體。
4. 如權利要求1所述的方法，其中一個或多個所述后代的選擇指數是根據來源于包括 所述后代的群組的數據計算的。
5. 如權利要求1所述的方法，其中一個或多個所述后代的所述選擇指數包括測量生育 力、每窩產仔數和產奶量的性狀。
6. 如權利要求1所述的方法，其中一個或多個所述后代的所述選擇指數包括測量飼料 轉化率、平均日增重和胴體瘦肉的性狀。
7. 如權利要求1所述的方法，其中用來自所述第一亞群的精細胞對來自所述品系或品 種的母豬授精的步驟包括使用深子宮內導管或插入所述母豬的膜的針頭對所述母豬的生 殖道施用所述精細胞。
8. 如權利要求7所述的方法，其中使用深子宮內導管對所述母豬的生殖道施用所述精 細胞包括將所述精細胞放在一個或多個子宮角中。
9. 如權利要求8所述的方法，其中所述深子宮內導管包括攝像機或顯示器。
10. 如權利要求8所述的方法，其進一步包括在插入所述母豬的生殖道時通過放射顯 影或熒光透視觀察所述深子宮內導管的步驟。
11. 如權利要求8所述的方法，其中施用的所述精細胞的總數是1x10 9或更少個精細 胞。
12. 如權利要求7所述的方法，其中使用通過所述母豬的膜插入的針頭對所述母豬的 生殖道施用所述精細胞包括將所述精細胞注射到所述母豬的子宮的一個或多個輸卵管中。
13. 如權利要求12所述的方法，其進一步包括通過腹腔鏡或攝像機觀察插入所述一個 或多個輸卵管中的所述針頭的步驟。
14. 如權利要求12所述的方法，其中施用的所述精細胞的總數是1x10或更少個精細 胞。
15. 如權利要求1-14中任一項所述的方法，其進一步包括通過對所述母豬施用一種或 多種激素或激素類似物使發(fā)情期同步或誘導定時排卵的步驟。
16. 如權利要求15所述的方法，其中所述一種或多種激素或激素類似物包括PG600、 OvuGel、eCG、孕激素或 hCG。
17. 如權利要求15所述的方法，其中所述一種或多種激素或激素類似物是通過放入所 述母豬的生殖道的可編程裝置施用的。
18. 如權利要求15所述的方法，其進一步包括通過研究所述雌性的卵泡來檢測所述母 豬中的排卵的步驟。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述卵泡是使用超聲波研究的。
20. 如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述母豬是遺傳核心或繁殖場種群的 成員。
21. 如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述公豬是遺傳核心或繁殖場種群的 成員。
22. -種提高豬的品系或品種的遺傳進展的方法，其包括以下步驟： 從來自所述品系或品種的公豬采集精液樣品； 將所述精液樣品分選到至少兩個精細胞亞群中，其中第一亞群的至少80%具有X染色 體或Y染色體； 用來自所述第一亞群的精細胞對來自所述品系或品種的母豬授精； 由所述母豬生產后代； 在一個或多個所述后代中獲得性狀的數值；和 選擇一個或多個所述后代與來自所述品系或品種的豬育種以便提高所述品系或品種 的遺傳進展，所述后代具有的所述性狀的數值比所述品系或品種中的所述性狀的平均值更 大或更小。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述品系或品種是小母豬品系并且所述第一亞群 具有X染色體。
24. 如權利要求22所述的方法，其中所述品系或品種是公豬品系并且所述第一亞群具 有Y染色體。
25. -種提高豬種群或養(yǎng)豬場中的遺傳優(yōu)良的公豬的后代數目的方法，其包括： 建立來自種群或養(yǎng)殖場中的公豬群體的一個或多個遺傳優(yōu)良的公豬的亞群； 從所述一個或多個遺傳優(yōu)良的公豬中獲得精細胞樣品； 從每個所述精細胞樣品中制備多個精細胞劑量； 對所述種群或所述養(yǎng)殖場中的多個母豬施用一種或多種激素或激素類似物以便誘導 每個母豬的定時排卵；和 使用深子宮內導管或腹腔鏡手術用一個或多個精細胞劑量對所述母豬授精，其中對每 個母豬一起施用的一個或多個精細胞劑量包含總共小于IxlO9個精細胞， 從而提高種群或養(yǎng)殖場中的遺傳優(yōu)良的公豬的后代數目。
26. -種降低豬種群或養(yǎng)豬場中的育種所需的公豬數目的方法，其包括： 建立來自種群或養(yǎng)殖場中的公豬群體的一個或多個遺傳優(yōu)良的公豬的亞群； 從所述一個或多個遺傳優(yōu)良的公豬中獲得精細胞樣品； 從每個所述精細胞樣品中制備多個精細胞劑量； 對所述種群或所述養(yǎng)殖場中的多個母豬施用一種或多種激素或激素類似物以便誘導 每個母豬的定時排卵；和 使用深子宮內導管或腹腔鏡手術用一個或多個精細胞劑量對所述母豬授精，其中對每 個母豬一起施用的一個或多個精細胞劑量包含總共小于IxlO9個精細胞， 從而降低所述種群或所述養(yǎng)殖場中的育種所需的公豬數目。
27. 如權利要求25或權利要求26所述的方法，其中遺傳優(yōu)良的公豬包括具有相對于所 述種群或所述養(yǎng)殖場中的其它公豬更高的選擇指數的公豬。
28. -種提高豬種群或養(yǎng)殖場的利益率的方法，其包括： 根據所述種群或養(yǎng)殖場從屬的市場條件確定是雄豬還是雌豬產生更高的單豬凈收 入； 從公豬中米集精液樣品； 將所述精液樣品分選到至少兩個精細胞亞群中，其中如果所述雌豬產生更高的單豬凈 收入，那么第一亞群中的至少80%具有X染色體，或者如果所述雄豬產生更高的單豬凈收 入，那么第一亞群中的至少80%具有Y染色體； 用來自所述第一亞群的精細胞對母豬授精；和 由所述母豬生產后代。
29. 如權利要求28所述的方法，其中所述雄豬是閹公豬。
30. 如權利要求28所述的方法，其中所述雌豬是小母豬。
31. 如權利要求28所述的方法，其中根據所述種群或養(yǎng)殖場從屬的市場條件確定是 雄豬還是雌豬產生更高的單豬凈收入的步驟包括比較雄豬和雌豬之間的性狀，其中所述性 狀選自以下任一種：飼料轉化率、體重、平均日增重、胴體瘦肉、腰肌厚度、背膘厚度、腹膘厚 度、無脂瘦肉指數、每日瘦肉增重、單豬飼料費和臉頰脂肪碘值。
【文檔編號】A61D19/02GK104519828SQ201380029461
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年6月6日 優(yōu)先權日:2012年6月6日
【發(fā)明者】J·莫雷諾, G·貝維, J·多布林斯基 申請人:英格朗公司