白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)育種領(lǐng)域的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,包括如下步驟:步驟一,培育白撮茄無(wú)菌苗;步驟二,誘導(dǎo)愈傷組織;步驟三,誘導(dǎo)不定芽;步驟四,誘導(dǎo)不定根,生根移栽,獲得白撮茄再生植株。本發(fā)明采用幼葉作為茄子再生體系外植體,在含有NAA和ZT的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷后,再在含有NAA、ZT、6-BA和AgNO3的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽,再于1/2MS的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,得到生根小苗,按常規(guī)方法馴化移栽。本發(fā)明建立的再生體系,其愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)97%左右,生芽率達(dá)到82%。繼代生長(zhǎng)良好,為茄子基因工程育種工作,提供了高效穩(wěn)定再生體系。
【專利說(shuō)明】白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域,具體涉及一種白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系?!颈尘凹夹g(shù)】[0002]茄子是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,含有多種人體必需物質(zhì),每100g茄子中含有核黃素0.04mg、尼克酸0.6mg、維生素C5mg、維生素El.13mg、鐵0.5mg、錳0.13mg、鋅0.23mg等。茄子在亞洲和非洲栽培廣泛,目前,中國(guó)已經(jīng)成為茄子最大的生產(chǎn)國(guó),2011年年產(chǎn)量達(dá)2770萬(wàn)噸,是第二大生產(chǎn)國(guó)印度的兩倍之多(FA0,2011)。在茄子生產(chǎn)栽培中很容易受到病蟲(chóng)害侵害,尤其是青枯病、黃萎病和枯萎病,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成茄子產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降。因此利用基因工程創(chuàng)造抗病、優(yōu)質(zhì)的茄子新品種具有重要意義。[0003]為獲得轉(zhuǎn)基因植株受體系統(tǒng)必須具有高效穩(wěn)定的再生體系。茄子再生已有相關(guān)報(bào)道 Kamat, M.G et al.,1978 ;Guri, A et al.,1987 ;Franklin, G et al.,2004 ;Shivaraj, Get al.,余波瀾等,2003,范適等,2005,曹必好等,2008,龔靜等2011.)但在茄子再生過(guò)程中,出愈率低,愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)不好,芽分化率不夠高,轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題較為突出。因此,建立高效穩(wěn)定的再生體系,對(duì)推動(dòng)我國(guó)茄子基因工程育種研究具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系。本發(fā)明是以幼葉為外植體的白撮茄高效再生體系建立方法。[0005]本發(fā)明涉及一種白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,包括如下步驟:[0006]步驟一,培育白撮茄無(wú)菌苗;[0007]步驟二,誘導(dǎo)愈傷組織;[0008]步驟三,誘導(dǎo)不定芽;[0009]步驟四,誘導(dǎo)不定根,生根移栽,獲得白撮茄再生植株。[0010]優(yōu)選地,步驟一中,所述培育包括如下步驟:取生長(zhǎng)飽滿的白撮茄種子,于55°C水浴鍋中浸種消毒15min,在室溫條件下浸泡8h,以體積分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉殺菌lOmin,無(wú)菌水漂洗3次,用無(wú)菌濾紙吸干水分,接種在無(wú)激素、pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中,置于黑暗條件下發(fā)芽,溫度設(shè)置白天30°C,夜間20°C,以打破種子休眠,種子長(zhǎng)出Icm左右芽后,光照培養(yǎng)5-7天,待幼苗長(zhǎng)出兩片子葉,第一片真葉即將長(zhǎng)出時(shí),即得白撮茄無(wú)菌苗。
[0011]優(yōu)選地,步驟二中,所述誘導(dǎo)愈傷組織使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
[0012]MS+NAA0.lmg/L+ZT3.0mg/L, pH 值為 5.8。
[0013]優(yōu)選地,步驟二中,所述誘導(dǎo)愈傷組織包括如下步驟:選取白撮茄無(wú)菌苗,切取子葉為外植體,子葉去除兩端后剪成小塊,正面向上平放于培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0014]優(yōu)選地,步驟三中,所述誘導(dǎo)不定芽使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
[0015]MS+NAA0.lmg/L+ZT4.0mg/L+6-BAl.5mg/L+AgNo38.0mg/L, pH 值為 5.8。
[0016]優(yōu)選地,步驟三中,所述誘導(dǎo)不定芽包括如下步驟:誘導(dǎo)愈傷組織10-14天后,得到幼嫩綠色愈傷組織,將其接種于誘導(dǎo)不定芽使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。
[0017]優(yōu)選地,步驟四中,所述誘導(dǎo)不定根使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基,pH值為
5.8。
[0018]優(yōu)選地,步驟四中,所述誘導(dǎo)不定根包括如下步驟:在不定芽誘導(dǎo)獲得的幼苗長(zhǎng)出2-3片真葉或幼苗為2-4cm長(zhǎng)時(shí),不帶愈傷組織將其從基部剪斷,接種不定根使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0019]優(yōu)選地,步驟四中,所述生根移栽為:幼苗進(jìn)行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)15d后,有4-5片真葉,三條主根,若干條側(cè)根,逐漸揭開(kāi)瓶口通風(fēng),繼續(xù)培養(yǎng)5d后即可移栽。
[0020]優(yōu)選地,步驟二、三和四中,所述誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為:溫度24±2°C ;光照強(qiáng)度為16001x,光照時(shí)間為16/24h。
[0021]本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明采用幼葉作為茄子再生體系外植體,在含有NAA和ZT的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷后,再在含有NAA、ZT、6-BA和AgN03的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽,再于1/2MS的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,得到生根小苗,按常規(guī)方法馴化移栽。本發(fā)明建立的再生體系,其愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)97%左右,生芽率達(dá)到82%。繼代生長(zhǎng)良好,為茄子基因工程育種工作,提供了高效穩(wěn)定再生體系。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0022]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述,本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0023]圖1是以白茄無(wú)菌苗子葉為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。
[0024]圖2是白茄無(wú)菌苗子葉分化形成愈傷組織。
[0025]圖3是白茄愈傷組織分化形成不定芽芽。
[0026]圖4是白茄不定芽伸長(zhǎng)。
[0027]圖5是白茄不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)。
[0028]圖6是白茄再生苗馴化移栽。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如 Sambrook 等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0030]實(shí)施例
[0031]以下各步驟的培養(yǎng)條件均為:溫度24±2°C ;光照強(qiáng)度為16001x,光照時(shí)間為16/24h,各培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂含量百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0032]—、無(wú)菌苗的獲得
[0033]取白撮爺(Solanummelongena L.)(《利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記分析爺子種質(zhì)資源遺傳多樣性》韓洪強(qiáng),陳火英。2009.上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文)的種子,將供試種子于55°C水浴鍋中浸種消毒15min,在室溫條 件下浸泡8h。在無(wú)菌操作臺(tái)上以2%次氯酸鈉殺菌lOmin,無(wú)菌水漂洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分,接種在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中;無(wú)菌苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(月季再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化初步研究,孟令寧,2012年6月,碩士學(xué)位論文),pH值為5.8 (如圖1所示);置于黑暗條件下發(fā)芽,溫度設(shè)置白天30°C,夜間20°C,以打破種子休眠;種子長(zhǎng)出Icm左右芽后,光照培養(yǎng)5-7天。待幼苗長(zhǎng)出兩片子葉,第一片真葉即將長(zhǎng)出時(shí),即可用作實(shí)驗(yàn)材料。
[0034]二、愈傷組織誘導(dǎo)
[0035]以步驟一中無(wú)菌苗子葉為外植體,子葉去除兩端后剪成0.3cm x0.2cm的小塊,正面向上平放于培養(yǎng)基(圖1)。誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂 7g/L, pH5.8。分別附加不同激素配比:NAA:0.lmg/L、0.3mg/L、0.5mg/L, ZT:1.0mg/L、 2.0mg/L、3.0mg/Lo試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每組60個(gè),3次重復(fù)。
[0036]外植體接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上,一周后即可產(chǎn)生愈傷組織(圖2)。不同濃度NAA和ZT生長(zhǎng)的愈傷組織類型不同。白撮茄在不同濃度激素培養(yǎng)基上可以形成多種不同類型的愈傷組織,其在顏色、質(zhì)地、形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯差異。
[0037]白撮茄在NAA0.lmg/L, ZT3.0mg/L時(shí)外植體誘導(dǎo)率能達(dá)到97% ;因此,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為,MS+NAA0.lmg/L+ZT3.0mg/L, pH值為5.8 ;在此種類型培養(yǎng)基中,愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)好,愈傷組織類型主要為T3類,顏色為綠色致深綠色,質(zhì)地緊密,塊狀,生長(zhǎng)較慢,分化成芽潛力高。
[0038]表1不同激素濃度誘導(dǎo)愈傷組織類型
【權(quán)利要求】
1.一種白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,包括如下步驟: 步驟一,培育白撮茄無(wú)菌苗; 步驟二,誘導(dǎo)愈傷組織; 步驟三,誘導(dǎo)不定芽; 步驟四,誘導(dǎo)不定根,生根移栽,獲得白撮茄再生植株。
2.如權(quán)利要求1所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟一中,所述培育包括如下步驟:取生長(zhǎng)飽滿的白撮茄種子,于55°C水浴鍋中浸種消毒15min,在室溫條件下浸泡8h,以體積分?jǐn)?shù)為2%次氯酸鈉殺菌lOmin,無(wú)菌水漂洗3次,用無(wú)菌濾紙吸干水分,接種在無(wú)激素、PH值為5.8的MS培養(yǎng)基中,置于黑暗條件下發(fā)芽,溫度設(shè)置白天30°C,夜間20°C,以打破種子休眠,種子長(zhǎng)出Icm左右芽后,光照培養(yǎng)5-7天,待幼苗長(zhǎng)出兩片子葉,第一片真葉即將長(zhǎng)出時(shí),即得白撮茄無(wú)菌苗。
3.如權(quán)利要求1所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟二中,所述誘導(dǎo)愈傷組織使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+NAA0.lmg/L+ZT3.0mg/L, pH值為5.8。
4.如權(quán)利要求3所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟二中,所述誘導(dǎo)愈傷組織包括如下步驟:選取白撮茄無(wú)菌苗,切取子葉為外植體,子葉去除兩端后剪成小塊,正面向上平放于培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求1所述的白 撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟三中,所述誘導(dǎo)不定芽使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
MS+NAA0.lmg/L+ZT4.0mg/L+6-BAl.5mg/L+AgNo38.0mg/L, pH 值為 5.8。
6.如權(quán)利要求5所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟三中,所述誘導(dǎo)不定芽包括如下步驟:誘導(dǎo)愈傷組織10-14天后,得到幼嫩綠色愈傷組織,將其接種于誘導(dǎo)不定芽使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。
7.如權(quán)利要求1所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟四中,所述誘導(dǎo)不定根使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基,pH值為5.8。
8.如權(quán)利要求7所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟四中,所述誘導(dǎo)不定根包括如下步驟:在不定芽誘導(dǎo)獲得的幼苗長(zhǎng)出2-3片真葉或幼苗為2-4cm長(zhǎng)時(shí),不帶愈傷組織將其從基部剪斷,接種不定根使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求7所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟四中,所述生根移栽為:幼苗進(jìn)行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)15d后,有4-5片真葉,三條主根,若干條側(cè)根,逐漸揭開(kāi)瓶口通風(fēng),繼續(xù)培養(yǎng)5d后即可移栽。
10.如權(quán)利要求1所述的白撮茄的高效再生培養(yǎng)體系,其特征在于,步驟二、三和四中,所述誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為:溫度24±2°C ;光照強(qiáng)度為16001X,光照時(shí)間為16/24h。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103734013SQ201410002644
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】劉楊, 張國(guó)剛, 劉新宇, 高莉潔, 周騰夏, 周曉晨, 劉冬媛, 韓洪強(qiáng), 葛海燕 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)