一種培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種干涉植物甾醇甲基轉移酶SMT1（cycloartenol-C24-Methyltransferases1）基因，培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法，屬于植物基因工程領域。本發(fā)明提供了一種甾醇甲基轉移酶SMT1基因的干擾載體，該干擾載體在轉染水稻制備干擾SMT1基因表達的植物后，通過RNAi干涉技術控制單個基因的表達量，從而使植物矮化、分蘗數增多及抗旱性提高。本方法過程簡單，而且可以創(chuàng)造出裝飾性植物和具有新的商業(yè)價值的農業(yè)產品，因此本方法在農業(yè)和園藝學領域是特別有意義的。
【專利說明】一種培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領域，特別提供了一種干涉植物留醇甲基轉移酶SMTKcycloartenol-C24-Methy I transferases I)基因,培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法。
【背景技術】
[0002]矮化是植物的一種重要性狀，植物株高性狀既受內部基因控制，還受各種激素和外部環(huán)境因素的影響。植物矮化是矮桿主基因表達作用的結果，同時也受修飾基因和抑制基因的影響。通過矮化育種，降低植株高度，不僅使作物耐肥抗倒，而且改變了株型，可提高收獲指數。環(huán)境中的非生物脅迫，例如干旱、鹽堿、冷害和熱害等影響植物的生長和發(fā)育，造成農作物的減產，也影響林木、果樹、花卉、園藝觀賞植物的正常生長和品質，培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標之一。所以培育出既矮化、抗逆性又高的植物品種然是十分必要的。
[0003]RNA干涉(RNAi)技術是利用一些小的雙鏈RNA來高效、特異地阻斷體內特定基因的表達，并促使mRNA降解，從而誘使細胞表現出特定基因缺失的表型。該技術已被廣泛應用于植物基因功能研究。與其他技術相比，RNA干涉技術具有特異性強、沉默效率高等優(yōu)點。[0004]谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇以及膽固醇，是植物體的主要甾醇，谷甾醇(Sitosterol)和菜油留醇(Campesterol)是植物激素油菜素內酯生物合成途徑中的中間產物。近年來發(fā)現植物留醇參與植物生長發(fā)育的許多生理過程，而且這些作用并不依賴油菜素內酯(Schaller, 2004 ； Car I and et al., 2010)。一個共同的特征就是調控植物的生長,但植物留醇是否調控抗旱性還沒有報道。植物留醇的生物合成是以環(huán)阿烯醇(cycloartenol)為起始化合物，在SMTl催化下，生成亞甲基膽留烯醇(24-methylenecycloartenol),因此，SMTl是留醇生物合成途徑中最前端的一個酶，也是調控各種植物留醇生物合成的關鍵酶(Diener et al., 2000 ；Clouse et al.,2002)。擬南芥smtl突變體具有短葉柄和更小和圓潤的葉子，比起SMTl野生型，它們更緊湊，更矮，但花正常(Diener et al.，2000)，證明SMTl與矮化性狀密切相關。但在單子葉中還沒有發(fā)現smtl突變體或者T-DNA插入突變體的報道，SMTl能否調控單子葉植物矮化、分蘗和抗旱性，未見報道。

【發(fā)明內容】

[0005]為豐富植物矮化、抗旱育種的方法，本發(fā)明的首要目的在于提供一種甾醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體制備方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供一種干涉植物留醇甲基轉移酶SMTl基因，培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現:一種留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體，具體為用植物干涉載體構建含有水稻OsSMTl基因干擾片段的重組干擾載體；
[0009]所述的水稻OsSMTl基因干擾片段，通過水稻OsSMTl的核苷酸及氨基酸多重序列比對選擇特異性較高的基因片段，命名為OsSMTl-lS，其序列(SEQ ID N01)如下:
[0010]atggttggggtgaatccttccactttgctcacagatggaatggagaatccctacgtgaaagcattaagcgacatgagcactttcttgcccttcagcttggagtgaaaccaggaatgaaggttttggacgtcggttgtggaataggcggaccactaagagaaattgccaaatttagcttggcttcagtcactggattgaacaacaatgagtaccagataactaggggaaaggagcttaatcgggtagcaggagttagtggaacttgcgactttgtgaaggcagacttcatgaagatgccgttttctgataacacttttgatgctgtctatgccattgaggcaacatgccacgcacctgatccggttggctgctataaggagatctatcgtgtattgaagc ；
[0011]所述植物干涉載體包括但不限于用于單子葉基因槍轉化的載體以及雙元農桿菌載體；所述的雙元農桿菌載體包括PRNA1-Ubi和pRNA1-35S系列載體；
[0012]所述的植物干擾載體優(yōu)選為pYLRNAi ；
[0013]上述留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)正向片段的裝載:以水稻核苷酸序列OsSMTl (基因編號AAP21419)全長序列為模板，設計分別帶有BamH I和Hind III酶切位點的上下游引物擴增OsSMTl-1基因片段，引物序列如下:
[0015]ZG1375:GAGTGGATCCATGGTTGGGGT
[0016]ZG1376:TGGCCAAGCTTCAATACACGATAG ；
[0017]以水稻中花11葉片的cDNA為模板及引物ZG1375和ZG1376進行PCR擴增獲得目的片段，擴增目的片段長度約400bp，PCR產物OsSMT1-1S經純化后連入pGEM_T easy載體，轉化大腸桿菌并測序分析獲得pGEM-OsSMTl-lS，用BamHI和Hind III分別酶切pYLRNAi空載體和重組后的pGEM-OsSMTl-lS載體質粒；分別回收目的片段OsSMT1-1S和PYLRNAi后連接，轉化大腸桿菌ToplOF’，檢測重組子，抽提質粒，測序無誤獲得重組質粒pYLRNA1-OsSMTl-lS。然后進行反向片段的裝載；
[0018](2)反向片段的裝載:將步驟(1)中經過驗證的重組子質粒為模板，利用通用引物，Mlu I (CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG)和 PstI (ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACCATGGTCG)擴增獲得反向片段，純化后用Mlu I和Pst I雙酶切，同步用Mlu I和Pst I雙酶切pYLRNA1-OsSMTl-lS的陽性克隆質粒，回收目的片段，連接后轉化大腸桿菌DH5 α后獲得干擾載體 pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri。
[0019]上述甾醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在降低植物株高中的應用。
[0020]上述留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在增加植株分蘗數中應用。
[0021]上述留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在提高植物抗旱性中應用。
[0022]一種干涉植物留醇甲基轉移酶SMTl基因，培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法，具體為:`
[0023]I)用電轉的方法將甾醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體(pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri)導入根瘤農桿菌ΕΗΑ105中，獲得含干涉載體(pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri)農桿菌陽性菌落；
[0024]2)將活化的含有干涉載體(pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri)的農桿菌EHA105浸染植物愈傷，經共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物。
[0025]步驟2)中所述的植物優(yōu)選為單子葉植物；
[0026]所述的單子葉植物優(yōu)選為水稻。
[0027]本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
[0028]本發(fā)明提供了一種留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體，該干擾載體在轉染水稻制備干擾SMTl基因表達的水稻植株后，通過RNAi干涉技術控制單個基因的表達量，從而使植物矮化、分蘗數增多及抗旱性提高。本方法過程簡單，而且可以創(chuàng)造出裝飾性植物和具有新的商業(yè)價值的農業(yè)產品，因此本方法在農業(yè)和園藝學領域是特別有意義的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是植物干涉載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri的表達框示意圖。
[0030]圖2是本發(fā)明所述OsSMTl-1基因片段的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標準DNA分子；I是OsSMTl-1基因的擴增片段。
[0031]圖3pYLRNA1-0sSMTl-l_Ri干涉載體構建過程中驗證酶切圖，其中，(A):PYLRNA1-OsSMTl-1-Ri 干涉載體第一輪酶切鑒定，M 為 Marker DL5000 ；1:BamH I 和 HindIII雙酶切后的載體片段(上)及OsSMTl-1基因片段(下)。(B):pYLRNA1-0sSMT1-1-Ri干涉載體第二輪酶切鑒定，M為Marker DL5000 ；2 =Hind III和BamH I雙酶切鑒定；3 =HindIII單酶切鑒定。
[0032]圖4是導入OsSMTl-1基因干涉片段的轉基因水稻的PCR鑒定結果瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，W表示野生型；PI表示pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri載體，為陽性對照；編號I1、12、
13、14、15、16、17、18、19、110、111、112表示不同的轉OsSMTl-1基因干擾片段后的轉基因水稻樣品。
[0033]圖5是四個OsSMTl-1干涉水稻植株的Southern雜交和實時定量PCR，其中，NT表示陰性植株；編號R2、R4和R5表示不同的轉基因干涉水稻株系；圖(A)是Southern雜交，圖(B)是實時定量PCR檢測；柱上方的字母a、b、c和d表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)。
[0034]圖6是55天野生型與OsSMTl-1干涉植株形態(tài)觀察，其中WT是野生型；編號R2、R4和R5表不不同的轉基因干涉水稻株系；圖(A)是不同水稻株系的外觀圖，圖(B)是55天野生型與OsSMTl-1干涉植株株高，圖(C)是55天野生型與OsSMTl-1干涉植株分蘗數統(tǒng)計數據；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)。
[0035]圖7是導OsSMTl-1干涉植株的抗旱性檢測，其中圖(A)是干旱處理后各個植株的含水量測定圖，圖(B)是干旱處理后各個植株的相對電導率測定；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)。
【具體實施方式】
[0036]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。[0037]實施例
[0038]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0039]水稻種子:品種為中花11 (84-213)，津審稻1989016，本實驗室繁種保存。
[0040]根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105:購自北京天恩澤基因科技有限公司。
[0041]PYLRNAi干涉載體:華南農業(yè)大學劉耀光博士惠贈。
[0042]大腸桿菌DH5a:購自上海超研生物科技有限公司。
[0043]實施例1 OsSMTl-1基因片段的克隆
[0044]一、水稻cDNA模板制備
[0045]將水稻種子(中花11)用體積分數70%酒精消毒2min，28°C水中浸種ld，30°C催芽3d，28°C播種，按蔣德安等(1987)所述方法育苗、管理。取水稻的成熟葉片，用Trizol方法提取總RNA，用M-MLV逆轉錄酶試劑盒(Promega公司)反轉錄獲得cDNA模板，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0046]二、設計擴增OsSMTl -1基因引物
[0047]在NCBI上進行下載水稻OsSMTl基因序列(基因編號AAP21419)，通過DNAMAN軟件比對分析該序列特征，找出特異性較高的OsSMT1-1S基因干擾片段，根據該片段設計引物:
[0048]OsSMT1-1S 基因片段擴增上游引物 ZG1375:GAGTGGATCCATGGTTGGGGT ；
[0049]OsSMT1-1S 基因片段擴增上游引物 ZG1376:TGGCCAAGCTTCAATACACGATAG ；
[0050]三、擴增獲得OsSMTl-1基因片段并構建載體
[0051]用上述步驟一制備的模板和步驟二設計的引物進行PCR擴增。
[0052]PCR 反應體系(50μ L):K0D-Plus_DNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0 公司，IU.μ L-1) 1 μ L，IOXbuffer 5 μ L，dNTPs (1Ommol.L-1) 5 μ L，MgSO4 (25mmol.L-1) 2 μ L，上游弓丨物(10 μ mo I.L-1) 1.5 μ L，下游引物(10 μ mo I.L-1) 1.5 μ L,反轉錄第一鏈 cDNA 2 μ L, ddH20補足至50 μ L。
[0053]PCR 反應程序=PCR 反應程序:94°C 3 分鐘；94°C 0.5 分鐘，55°C 0.5 分鐘，72°C 0.5分鐘，35個循環(huán)；72°C 10分鐘。擴增產物OsSMT1-1S基因干擾片段以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。
[0054]獲得OsSMT1-1S基因干擾片段與預期片段長度(~400bp)—致的PCR片段(圖2)。將獲得的PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收后進一步通過Taq酶催化的反應進行末端加A，反應體系如下:2 μ L10Xbuffer,lu 14mM ?ΑΤΡ,11μ g PCR回收片段，
.0.1μ L Taq DNA聚合酶，加入無菌的去離子水總體積為20 μ L，70°C反應20分鐘。
[0055]用PCR產物回收試劑盒回收上述獲得的OsSMT1-1S基因干擾片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將PCR回收片段與pGEM_T easy載體(Promega公司)進行連接，反應體系如下:1μL 10父1'4連接酶緩沖液，回收目的片段60叩，14 1 T4連接酶，2 μL pGEM-T easy載體(IOng),加無菌水至總體積為10 μ L,16°C連接過夜。
[0056]大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備:用接種環(huán)取保存于_80°C超低溫冰箱的大腸桿菌DH10B菌液，在SOB固體培養(yǎng)基上劃板，于37°C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜；挑取大腸桿菌DH10B單菌落接種于Iml的SOB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)約6h，接種于200ml SOB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)至OD550 = 0.6-0.8。以2500rpm離心10分鐘收集菌體，加入預冷的10%甘油洗滌，離心收集細菌。重復用10%甘油洗滌，離心收集細菌。最后將細菌分裝，于_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057]連接產物電激轉化大腸桿菌:將上述OsSMT1-1S基因干擾片段和pGEMT-vector連接產物在 1/3 的 TE (1M NaCl, IOmM Tris-HCl pH8.0, ImM EDTA)中透析 30 分鐘。取20 μ I大腸桿菌感受態(tài)細胞至電極杯(孔徑1_)，加入I μ I經過透析的連接產物，用電激儀(MicroPulser，Bio-RAD公司)電激轉化。電激參數為:電阻200 Ω，1800V，25 μ F。電激后的菌體轉入Iml SOC液體中，于37°C恒溫搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)I小時。取100 μ I菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固體(含100 μ g/mL Amp)培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)過夜。
[0058]重組質粒pGEM-OsSMTl-lS的篩選、純化及測序:
[0059]呈藍斑的菌落不含插入片段，僅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR檢測。挑取PCR陽性菌落，接種于2ml含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。吸取2ml菌液,用質粒DNA純化試劑盒(Qiagen公司)提質粒,4?保存?zhèn)溆?。對獲得的質粒用BamH I /Hind III雙酶切，電泳檢測插入片段的大小，進一步確定陽性克隆。純化的重組質粒命名為pGEM-OsSMTl-lS，送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果如下: [0060]TGAAATAGAGGAAGCAATAACATCCACAACAAAAAGAGTGGATCCATGGTTGGGGTGAATCCTTCCACTTTGCTCACAGATGGAATGGAGAATCCCTACGTGAAAGCATTAAGCGACATGAGCACTTTCTTGCCCTTCAGCTTGGAGTGAAACCAGGAATGAAGGTTTTGGACGTCGGTTGTGGAATAGGCGGACCACTAAGAGAAATTGCCAAATTTAGCTTGGCTTCAGTCACTGGATTGAACAACAATGAGTACCAGATAACTAGGGGAAAGGAGCTTAATCGGGTAGCAGGAGTTAGTGGAACTTGCGACTTTGTGAAGGCAGACTTCATGAAGATGCCGTTTTCTGATAACACTTTTGATGCTGTCTATGCCATTGAGGCAACATGCCACGCACCTGATCCGGTTGGCTGCTATAAGGAGATCTATCGTGTATTGAAGCTTGGCCAGATTAAGGTCCTCAAGACACAAATGCCTG
[0061]測序結果在NCBI進行序列比對，證明所擴增出的PCR產物為OsSMTl-1基因片段(OsSMTl-lS)，如上述測序序列中下劃線標注部分。該基因片段位于OsSMTl開放閱讀框的第 191bp — 589bp。
[0062]實施例2 OsSMTl-1基因的植物干涉載體(pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri)構建
[0063]根據實施例1獲得的pGEM-OsSMTl-lS帶有BamH I /Hind III酶切位點，搖菌擴繁提取質粒。然后用限制性內切酶BamH I (TaKaRa公司)和Hind III (TaKaRa公司)雙酶切pGEM-OsSMTl-lS質粒，純化回收擴增獲得的酶切后的OsSMT1-1S基因干擾片段。
[0064]將pYLRNAi干涉載體也用限制性內切酶BamH I (TaKaRa公司)和Hind IIICTaKaRa公司)雙酶切，分別回收酶切后載體大片段，之后與上述獲得的酶切過后的OsSMT1-1S基因干擾片段連接后，轉化ToplOF’感受態(tài)細胞，經BamH I和Hind III雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。結果如圖(圖3A)所示，表明正向片段連接成功。OsSMT1-1S基因干擾片段插入到干涉載體pYLRNAi中的多克隆位點的BamH I和Hind III之間，將構建獲得的重組干涉載體命名為 pYLRNA1-0sSMTl-lS。
[0065]以pYLRNA1-OsSMTl-lS的陽性克隆質粒為模板，用通用引物Mlu 1-F和Pst 1-R特異擴增反向片段。[0066]Mlu 1-F (CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG)
[0067]Pst 1-R (ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACCATGGTCG)
[0068]將該反向片段回收后用Mlu I和Pst I雙酶切，同步用Mlu I和Pst I雙酶切PYLRNA1-OsSMTl-1S的陽性克隆質粒，回收目的片段，連接后轉化大腸桿菌，對重組子使用兩種酶切方法鑒定。結果如圖3B所示,Hind III單酶切可切出正向片段+intron+反向片段，約lkb，雙酶切可以切出載體片段和干涉片段，結果表明干涉載體構建成功，載體命名為pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri。
[0069]所述的植物干涉載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri的表達框示意圖如圖1所示。
[0070]實施例3轉基因水稻的產生及分子檢測
[0071]一、轉基因水稻的產生
[0072]1.將 pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri 導入根癌農桿菌 EHA105
[0073]將根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105感受態(tài)細胞(參考J.薩姆布魯克(2002 )的方法并加以改進，取EHA105菌種于MYB平板上劃線，28 °C培養(yǎng)48小時，挑取單菌落，接種于50mL液體SOC中，28°C培養(yǎng)過夜，吸取0.5mL菌液，接種于500mL液體SOC中，28°C培養(yǎng)6~8h，至OD6tltl約為0.6，冰浴冷卻lOmin，倒入經滅菌的200mL離心管中，平衡后4°C，4000rpm,離心lOmin，收集菌體，倒去S0C，倒置于紙巾上，控干水分，加入50mL10%甘油，于冰上搖動，懸浮菌體,4°C, 4000rpm,離心15min,收集菌體,棄10%甘油，重復洗滌一次，加入2mL10%甘油，懸浮菌體，分裝，20~25 μ L/管，加液氮速凍后，獲得根癌農桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細胞，于_80°C冰箱保存。置于冰上解凍，將0.2cm內徑的電擊杯置于冰上預冷。在超凈工作臺內，分別將1.5 μ IpYLRNA1-OsSMTl-1-Ri質粒(20ng/y I)加至20 μ I解凍的感受態(tài)細胞中，輕彈管壁混勻，冰浴I分鐘后，轉移至電擊杯中，置于電擊儀(MicroPulser, Bio-RAD公司)的電極間,選定程序Agr,進行電擊。電擊結束后,在超凈工作臺內，迅速將Iml YEB液體培養(yǎng)基倒`入電擊杯，再用移液槍轉移至搖菌管中，28°C輕柔振蕩培養(yǎng)2小時。吸取0.3ml菌液，涂布在YEB平板(含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素)上。28°C培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)48小時。
[0074]2.含干涉載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri農桿菌陽性菌落的鑒定
[0075]挑取平板上的單菌落進行菌落PCR檢測，并做好標記。進一步挑取PCR陽性菌落至3ml YEB液體培養(yǎng)基(含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素)中，28°C振蕩培養(yǎng)40小時。取2ml菌液用堿裂解法抽提質粒，用限制性內切酶BamH I (TaKaRa公司)和Hind III(TaKaRa公司)進行酶切檢測，確定陽性克隆中含有植物干涉載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri。取0.8ml農桿菌液，加0.2ml80%甘油，混勻后保存于_80°C超低溫冰箱備用。
[0076]3.轉基因水稻植株的獲得
[0077]( I)水稻愈傷組織的誘導和繼代
[0078]選取飽滿健康的中花11成熟種子去皮，用70%酒精浸泡lmin，蒸餾水洗I次，再用
0.1%的升汞(HgCl溶液)封口處理15min，期間在搖床上不斷搖動。然后在超凈工作臺中，倒掉升汞，滅菌蒸餾水洗4-5次，放在3張滅菌的大濾紙上晾干。最后，滅菌種子均勻平放于NB誘導培養(yǎng)基上，25°C黑暗條件下誘導愈傷組織。誘導的種子暗培養(yǎng)15-25天左右，當見到淡黃色顆粒狀愈傷長出后，把愈傷組織接于繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導愈傷。
[0079](2)農桿菌的活化與懸浮[0080]取含有表達載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri的農桿菌EHA105貯存液，在YEB平板(含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素)上劃線，28°C培養(yǎng)。挑分離良好的單菌落,接種于2ml液體YEB (含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素)中，28°C振蕩暗培養(yǎng)24-48小時。吸取菌液20-50 μ 1，涂布于含同樣抗生素的YEB平板上，28°C倒置暗培養(yǎng)24-36小時。將新長出的農桿菌刮下來，用MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋，使0D_為0.06~0.08。
[0081](3)侵染、共培養(yǎng)及轉基因苗的產生
[0082]在超凈工作臺內，將提前干燥好的愈傷組織和農桿菌侵染液混合(保證農桿菌侵染液淹沒愈傷組織)，再加入乙酰丁香酮，終濃度為100 μ Μ，然后在搖床上，150rpm, 28°C黑暗侵染20min。在超凈工作臺內，倒出侵染液，將愈傷組織置于多層滅菌濾紙的小平皿上干燥約5-10min，再將愈傷組織轉移到有3層滅菌濾紙的大平皿上，在風機下吹，干燥約1.5-2h，然后將愈傷組織接到有一張新滅菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，在風機下吹，再干燥2-3h。經干燥處理過的愈傷組織，于超凈工作臺內，在風機下吹0.5-lh后，分別接入篩選培養(yǎng)基，然后封口，于25 °C下暗培養(yǎng)2周，共篩選2次。
[0083]抗性愈傷的預分化和分化:挑選生長狀態(tài)好的抗性愈傷接入預分化培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+0.5g/L L-谷氨酰胺+0.5g/L L-脯氨酸+0.3g/L酸水解干酪素+30g/L鹿糖+20g/L D-山梨醇+lmg/L NAA+5mg/L 6-BA+2.5mg/L CuS04.5H20+5mg/L ABA+50mg/L 潮霉素B+200mg/L頭孢霉素+200mg/L羧芐青霉素+10g/L瓊脂粉ρΗ5.8)，于25°C，光暗交替下培養(yǎng)，直到長出新愈傷，預分化約為3-4周。將有綠點的愈傷組織移至分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化出苗。
[0084]( 4 )轉基因水稻的生長
[0085]待分化苗長至3-5cm時，將其從分化培養(yǎng)基中轉移到IOOmL的三角瓶生根壯苗培養(yǎng)基中，25°C光暗交替培養(yǎng)3-4周，直到長出新的根。如果苗生長良好，新的根長得比較快，則可以提前移栽練苗。當幼苗根部長出新的長根時，將幼苗從培養(yǎng)基中移出，并把根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，分單株移栽到盆中。用木村B營養(yǎng)液，在自然光照強度條件培養(yǎng)2-3周。最后移入土中進行，于溫室外自然條件培養(yǎng)。
[0086]二轉基因水稻的PCR檢測
[0087]1.微量法快速提取DNA
[0088]取1.5mL離心管蓋般大小的葉片于1.5mL離心管，加入400 μ L預熱到80°C的提取液(200mM Tris-HCl pH8.0,250mM NaCl,25mM EDTA，質量分數0.5%SDS)，用小研錘在 1.5mL離心管中充分研磨，70°C水浴IOmin,然后在冰上放置2min。13000rpm離心lmin,取300 μ L上清液，加等量異丙醇，混勻，室溫靜置5min。13000rpm離心2min，棄盡上清液。DNA沉淀風干后溶于 50yL TE (1M NaCl, IOmM Tris-HCl pH8.0, ImM EDTA)，保存于 _20°C冰箱。
[0089]2.轉基因水稻的PCR檢測
[0090]由于侵染植物的載體pYLRNAi在其左右邊界區(qū)內還帶有homomycin (HPT)抗性基因，因此使用能特異識別該基因的引物ZG599 (CGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCT )和ZG600 (CAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCT )來檢測目的基因是否成功轉入到植物基因組。以上一步驟微抽得到的DNA為模板進行PCR擴增，以pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri重組質粒為陽性對照。反應體系(20μ L):TaqDNA 聚合酶 0.1 μ L、PCR IOXbuffer 2 μ L、dNTP (IOmM)
1.6μ L, ZG599 (10 μ Μ) 0.5 μ L、ZG600 (10 μ Μ) 0.5 μ L、DNAl μ L (陽性對照中的用量為PYLRNA1-OsSMTl-1-Ri 質粒 20ng)、ddH20 14 μ L。PCR 反應程序-MV 2min ；94°C 0.5min,57°C 0.5min, 72°C 30s, 35個循環(huán)；72°C 5min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
[0091]三轉基因水稻的Southern雜交
[0092]1.基因組DNA的提取
[0093]取Ig水稻嫩葉，置液氮中研磨成粉末，轉移至50mL離心管，立即加入6mL預熱到70°C 的 1.5XCTAB 提取液(L 5%CTAB，75mM Tris-HCl pH8.0, IM NaCl, 15mM EDTA)，渦漩振蕩lOsec，混勻。70°C水浴lh，間斷混勻。水浴結束，加入5mL氯仿，旋緊管蓋，上下顛倒混勻lOmin。5000rpm離心15min。用剪去尖端的ImL槍頭小心吸取上清液至50mL離心管,并記錄體積，加入1/10量的10%CTAB溶液，搖勻。加入4/5量的氯仿，上下顛倒混勻lOmin。5000rpm離心15min。用剪去尖端的ImL槍頭小心吸取上清液至50mL離心管,并記錄體積，加入等量的沉淀液(l%CTAB，50mM Tris-HCl pH8.0, IOmM EDTA)，輕柔上下顛倒混勻，室溫放置15min(或55°C水浴IOmin)沉淀DNA。5000rpm離心IOmin,小心倒掉上清液,再6000rpm離心lmin，用移液槍吸盡上清液。加入2mL高鹽TE (IM NaCl, IOmM Tris-HCl pH8.0, ImMEDTA)和 5 μ L10mg/mL 的 RNAase (用 IOmM Tris-HCl pH7.5 和 15mM NaCl 溶液配制，經過100°C水浴15min滅活DNA酶)，在55°C搖床中輕搖至沉淀完全溶解(30_40min)。加入2倍體積的無水乙醇，輕柔地上下顛倒混勻。用槍頭鉤出絮狀DNA，在70%乙醇中漂洗，然后移至1.5mL離心管。短暫離心，棄上清液,適當風干沉淀,用0.1-0.2mL TE (IOmM Tris-HCl,pH8.0, ImM EDTA)溶解沉淀。取2 μ L稀釋10倍的DNA溶液，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的質量，測0D260nm和0D280nm，確定DNA的純度和濃度。
[0094]2.DNA酶切、電泳及轉膜
[0095]具體操作參考DIG High Pr ime DNA Labeling and Detection Starter KitII (Roche)使用說明書。電泳結束后將膠簡單沖洗后進行變性和中和，再用20XSSC采用毛細管轉印的方法使DNA轉印到尼龍膜Hybond N+(Amersham公司)上。將膜放在用20XSSC濕潤的濾紙上，進行紫外交聯，800s, 2次。用雙蒸水簡單漂洗后晾干，用保鮮膜包好，做好標記，保存于4°C備用。
[0096]3.探針的制備與標記
[0097]以引物ZG599和ZG600，pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri重組質粒為模板擴增出潮霉素基因的部分序列，用試劑盒純化回收PCR產物作為雜交的探針模板，并電泳定量。用DIG-HighPrime對探針進行標記。參考說明書方法向一個反應管中加入I μ g模板DNA和高壓滅菌的雙蒸水，終體積16 μ L0沸水浴IOmin以變性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。取4 μ LDIG-High Prime加入到變性DNA中，混合并簡單離心。37°C孵育過夜，然后65°C加熱IOmin終止反應。
[0098]4.Southern 雜交
[0099]膜放到已經用10XSSC浸透的Whatman 3號定性濾紙上。紫外交聯后,將膜放入雙蒸水中簡單沖洗一下。將適量體積的雜交緩沖液(lOmL/lOOcm2濾膜)提前預熱到雜交溫度(37-42°C)。將NC膜放入雜交緩沖液中在雜交爐中預雜交lh。將3制備的探針放入沸水浴中煮5min后快速放入冰水混合物中冷卻，將變性的地高辛標記探針加入到預熱的地高辛雜交緩沖液(每IOOcm2的膜加入3.5mL雜交緩沖液)中，充分混合獲得探針雜交液的混合物。倒出預雜交液，加入探針雜交液的混合物，42°C雜交爐中孵育過夜。用2XSSC，0.1%SDS連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次5min，15-20°C。在80mL封阻液中孵育45min，在20mL抗體溶液中孵育30min，用IOOmL洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min，在20mL檢測緩沖液中平衡2_5min。將膜平放在保鮮膜上，均勻滴加500 μ L CSPD顯色液，鋪上一層保鮮膜，由內向外輕輕攤平顯色液，并擠掉多余的顯色液，用紙吸掉。將弄好的膜放于暗室5min，后置于37°C中避光Ih，成像軟件掃描成像。
[0100]采用PCR法檢測(使用引物對ZG599和ZG600)轉基因干涉水稻，陽性植株能擴增出500bp的特異帶，與以植物表達載體pYLRNA1-OsSMTl-1-Ri (陽性對照)為模板擴出的特異帶大小一致，而野生型對照植物不能擴出該特異帶(圖4)，證明OsSMTl-1干涉片段已導入到轉基因水稻中。
[0101]Southern雜交結果顯示，在野生型水稻中沒有HPT基因的特異雜交信號，轉基因干涉水稻植株中有HPT基因的特異雜交信號，表明OsSMTl-1干涉片段已整合到轉基因干涉水稻的基因組中(圖5A)。
[0102]用實時定量PCR檢測了 OsSMTl-1基因的干涉情況，結果表明，轉基因干涉水稻中的OsSMTl-1基因的表達水平明顯低于野生型水稻植株，這說明干涉成功(圖5B)。
[0103]實施例4轉基因干涉水稻的形態(tài)分析
[0104]一高度及分蘗數統(tǒng)計[0105]當水稻生長到55天，量取根部到最長葉直立時的長度，為株高(至葉片)，并對分蘗數進行統(tǒng)計。野生型和轉基因干涉植株各取25株測量，然后取其平均值。試驗結果如圖6顯示，OsSMTl-1的表達量下降矮化了水稻并且提高了水稻的分蘗數。
[0106]二抗旱性測定
[0107]將轉基因干涉水稻及其野生型水稻幼苗在溫室內生長30天后，開始停止?jié)菜?0后收集倒二片葉片，測定電導率及相對含水量。
[0108]測定方法為:
[0109]將葉片放入含20ml去離子水的三角瓶內，4°C過夜，用電導儀測定溶液電導值(Cl);將三角瓶移到沸水浴中保溫20分鐘，冷卻至室溫，再次用電導儀測定溶液電導值(C2)。通過公式(C1/C2) X 100計算相對電導率。每個株系植株共測定5個單株，計算平均值。
[0110]剪下葉片后立刻稱鮮重，然后將它們放在燒杯中，暗中放置24h后稱飽和重，之后于鼓風烘箱中在80°C恒溫下烘干48h，稱干重。3次重復，取平均值為該次取樣植物葉片的相對含水量RWC。計算公式:RWC(% )=(鮮重-干重)/ (飽和重-干重)*100%。
[0111]在干旱處理后，轉基因干涉水稻葉片的相對電導率明顯低于野生型水稻，相對含水量明顯高于野生型(圖7)，表明轉基因干涉水稻在干旱下受到的傷害比野生型水稻輕，提高了抗旱性。
[0112]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體，其特征在于用植物干涉載體構建含有水稻OsSMTl基因干擾片段的重組干擾載體。
2.權利要求1所述的留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在降低植物株高中的應用。
3.權利要求1所述的留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在增加植株分蘗數中應用。
4.權利要求1所述的留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體通過制備轉基因植物在提高植物抗旱性中應用。
5.一種干涉植物留醇甲基轉移酶SMTl基因，培育矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物的方法，其特征在于具體為: 1)用電轉的方法將權利要求1中留醇甲基轉移酶SMTl基因的干擾載體導入根瘤農桿菌EHA105中，獲得含干涉載體的農桿菌陽性菌落； 2)將活化的含有干涉載體的農桿菌EHA105浸染植物愈傷，經共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得矮化、增加分蘗、提高抗旱性的轉基因植物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述的植物為單子葉植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述的單子葉植物為水稻。
【文檔編號】A01H5/00GK103740750SQ201410015223
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】盧少云, 陳晶晶, 陳苗, 郭振飛 申請人:華南農業(yè)大學