一種降低水稻地上部鎘含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低水稻地上部鎘含量的方法，所述方法的具體步驟如下:（1）用納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4·7H2O，在1升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅10mg；（2）將活化后的印度梨形孢接種于步驟（1）所述的液體Kafer培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，接著澆灌于水稻秧苗根部，灌根處理，使印度梨形孢定殖于水稻根部；（3）經(jīng)印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使水稻正常生長(zhǎng)至收獲。本方法易于掌握、成本較低、簡(jiǎn)單實(shí)用，綠色環(huán)保，不會(huì)引起二次污染，適合用于無(wú)公害水稻的生產(chǎn)；它不僅適用于重金屬污染土壤中水稻的種植，對(duì)于非污染土壤也可使用。
【專利說(shuō)明】一種降低水稻地上部鎘含量的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物資源的利用和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種降低水稻地上部鎘含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化肥、農(nóng)藥的大量施用和工業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重。鎘是一種有毒的重金屬，也是主要的環(huán)境污染物之一。中等水平鎘污染的耕作層土壤不會(huì)對(duì)植物造成毒害作用，但可以使得作物的可食用部分積累相當(dāng)多的鎘，通過(guò)食物鏈危害人類的健康。目前，稻田被鎘污染和稻谷中鎘的積累已成為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)問(wèn)題。因此，如何減少水田的鎘污染和谷粒中鎘積累已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)主要的任務(wù)。
[0003]目前，降低稻谷中鎘積累的方法除了保護(hù)水稻種植環(huán)境、減少重金屬鎘污染之外，治理鎘污染稻田的方法有向土壤中添加諸如磷酸鹽、硅酸鹽和石灰等改良劑，使土壤中的重金屬得以穩(wěn)定，不易被植物吸收。這種方法操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是只改變了重金屬的形態(tài)，并沒(méi)有根本去除重金屬，重金屬元素仍保留在土壤中，很容易再度活化而危害植物。在一些鎘污染比較嚴(yán)重的地方通過(guò)更換土壤的方法進(jìn)行治理，而更換土壤需要大量資金和可更換的土壤，同時(shí)對(duì)置換出來(lái)的污土集中處理也是一個(gè)難點(diǎn)。另外，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可達(dá)到降低水稻植株鎘的積累，但人們會(huì)擔(dān)心轉(zhuǎn)基因水稻的種植可能引起新的食品安全問(wèn)題。因此，選用一種更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)措施對(duì)于有效降低稻谷重金屬殘留是必要的。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視生物修復(fù)技術(shù)。生物修復(fù)是指在一定條件下利用植物、動(dòng)物和微生物吸收、降解、轉(zhuǎn)化土壤和水體中的污染物，使環(huán)境中的污染物濃度降低到可接受的水平，該技術(shù)已經(jīng)引起土壤學(xué)家、植物學(xué)家和環(huán)境科學(xué)家的廣泛關(guān)注。
[0005]中國(guó)專利申請(qǐng)2 01310104049.7公開了里氏木霉聯(lián)合伴礦景天在鎘污染農(nóng)田土壤修復(fù)中的應(yīng)用，菌劑使用方法是在伴礦景天幼苗根際施加里氏木霉FSlO-C發(fā)酵液或微生物制劑；中國(guó)專利申請(qǐng)201210137704公開了一種利用叢枝菌根修復(fù)重金屬污染土壤的方法，菌種使用方法是將叢枝菌根接種于稗草根部。上述兩項(xiàng)專利是用生物菌種來(lái)提高寄主植物吸收土壤中重金屬的能力，隨后移除寄主植物，完成重金屬污染土壤的修復(fù)。這類方法能夠降低土壤中的重金屬含量，但同時(shí)也降低了耕地的復(fù)種指數(shù)，且如何處理寄主植物也是生產(chǎn)實(shí)際中的難題。中國(guó)專利申請(qǐng)20121007120和201010525189均公開了一種利用叢枝菌根真菌降低煙草重金屬殘留的方法，叢枝菌根真菌和煙草形成叢枝菌根共生體，促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，降低煙草重金屬殘留。但叢枝菌根真菌不能人工培養(yǎng)，在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用受到了影響。
[0006]印度梨形孢是一種根部?jī)?nèi)生真菌，具有廣泛的寄主范圍，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，提高寄主對(duì)非生物脅迫的抗性等。同時(shí)，印度梨形孢不同于叢枝菌根真菌，它可在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這就為該菌在農(nóng)業(yè)和園藝業(yè)的大面積應(yīng)用提供可能(樓兵干，孫超，蔡大廣.印度梨形孢的多種功能及其應(yīng)用前景[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào).2007, 34(6):653-656)。因此，通過(guò)開發(fā)利用印度梨形孢，在不影響水稻產(chǎn)量的前提下達(dá)到降低水稻體內(nèi)重金屬含量，尤其是稻米中鎘的含量，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種利用植物內(nèi)生真菌印度梨形孢降低水稻地上部重金屬鎘含量的方法，以降低稻米中的重金屬鎘殘留。
[0008]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明降低水稻地上部鎘含量方法的具體步驟如下:
[0010](I)含0.01g/L納米材料氧化鋅培養(yǎng)基的配制；
[0011]用納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg ；
[0012](2)印度梨形孢菌絲液灌根處理水稻秧苗根部；
[0013]將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，接著澆灌于水稻秧苗根部，灌根處理，使印度梨形孢定殖于水稻根部；
[0014](3)水稻秧苗的移栽和后期的管理
[0015]經(jīng)印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使水稻正常生長(zhǎng)至收獲。
[0016]步驟(1)中，納米`材料氧化鋅的粒徑為30nm。
[0017]步驟(1)中，所述的Kafer培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含有:2.0Og蛋白胨、1.0Og酵母提取物、1.0Og 水解酪蛋白、0.60gNaN03、0.52gKCl、0.52gMgS04.7H20、1.52gKH2P04、
0.52gZnS04.7H20, IOmgH3BO3^mgMnSO4.H20、1.6mgCoCl.5H20、1.6mgCuS04.5H20、
1.1mg(NH4)6MO7O24U.3mgFeS04、l.8mgEDTA、0.1Omg 硫胺素、0.04mg 甘氨酸、0.01mg 煙酸、0.01mg批唆醇。
[0018]步驟(2)中，所述的印度梨形孢菌絲液的制備方法如下:在25°C~28°C、100rpm~120rpm避光搖床上，用含0.01g/L納米材料氧化鋅的Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)印度梨形孢7_10天，過(guò)濾，收集菌絲體，用蒸懼水配成濃度為lg/L-4g/L的菌絲液。
[0019]步驟(2)中，所述印度梨形孢菌絲液印度梨形孢菌絲液濃度為lg/L_4g/L。
[0020]步驟(2)中，所述灌根處理時(shí)水稻苗齡為7-14天。
[0021 ] 本發(fā)明的積極效果如下:
[0022]1.與叢枝菌根真菌相比，印度梨形孢可在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，應(yīng)用方便；
[0023]2.在含納米材料ZnO (30nm) 0.01mg/L的Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢，其在水稻根部的定殖率顯著提高，由原來(lái)的80.0%提高到95.0%，同時(shí)使水稻生長(zhǎng)更健壯。
[0024]3.本發(fā)明的內(nèi)生真菌印度梨形孢菌劑能夠改善水稻的營(yíng)養(yǎng)狀況，提高水稻葉片葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，提高水稻產(chǎn)量。本發(fā)明能在不影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的情況下降低水稻地上部重金屬鎘殘留，水培試驗(yàn)表明在3mg/LCd脅迫下12天，接種印度梨形孢的水稻幼苗其地下部和地上部Cd含量分別是對(duì)照的9.84和0.61倍；盆栽試驗(yàn)表明，在3mg/kgCd脅迫下，分蘗期水稻的根、莖桿和葉片的Cd含量分別是對(duì)照的1.24、0.58和0.52倍，灌漿期水稻的根、莖桿、葉片和糙米的Cd含量分別是對(duì)照的1.24,0.66,0.57和0.55倍。本方法易于掌握、成本較低、簡(jiǎn)單實(shí)用，綠色環(huán)保，不會(huì)引起二次污染，適合用于無(wú)公害水稻的生產(chǎn)；它不僅適用于重金屬污染土壤中水稻的種植，對(duì)于非污染土壤也可使用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是納米材料Zn0(30nm)對(duì)印度梨形孢菌落形態(tài)和生物量影響的示意圖。
[0026]圖2是印度梨形孢在水稻根部定殖的示意圖。
[0027]圖3是水培條件下印度梨形孢對(duì)水稻幼苗不同部位鎘含量影響的示意圖。
[0028]圖4是盆栽條件下印度梨形孢對(duì)分蘗期水稻不同組織鎘含量影響的示意圖。
[0029]圖5是盆栽條件下印度梨形孢對(duì)灌漿期水稻不同組織鎘含量影響的示意圖。
[0030]圖6是在不同鎘濃度脅迫下印度梨形孢對(duì)水稻葉片葉綠素含量影響的動(dòng)態(tài)變化的示意圖。
[0031]圖7是在不同鎘濃度脅迫下印度梨形孢對(duì)水稻葉片丙二醛(MDA)含量影響的動(dòng)態(tài)變化的示意圖。
[0032]圖8是在25mg/L鎘脅迫下印度梨形孢對(duì)水稻葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性影響的動(dòng)態(tài)變化的示意圖。
[0033]圖9是在25mg/L鎘脅迫下印度梨形孢對(duì)水稻葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性影響的動(dòng)態(tài)變化的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0035]實(shí)施例1
[0036]一種降低水稻地上部鎘積累的方法，包括如下步驟:
[0037]菌種的活化:將保存在冰箱里的印度梨形孢菌種接種于Kafer培養(yǎng)基(KM)平板上，置于28°C恒溫箱里避光培養(yǎng)7天。用直徑為5mm的打孔器在活化好的印度梨形孢菌落邊緣打孔。
[0038]菌液的培養(yǎng):配制液體Kafer培養(yǎng)基和含納米材料ZnO (30nm) 0.0I g/L的液體Kafer培養(yǎng)基(即以納米材料ZnO (30nm)代替ZnS04)，用250ml三角錐形瓶分裝，每瓶裝150ml培養(yǎng)基，滅菌備用。在無(wú)菌條件下，將印度梨形孢菌絲塊加入裝有上述培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，每瓶4塊菌絲塊；置于恒溫?fù)u床120rpm、28°C避光振蕩培養(yǎng)5天。
[0039]菌絲體的收集:用四層紗布過(guò)濾，用無(wú)菌蒸餾水沖洗菌絲體2-3遍，沖掉殘留的液體Kafer培養(yǎng)基，將紗布擰干，用滅過(guò)菌的鑷子收集紗布上的菌絲體，放入50mL的離心管中，直于4 C保存，備用；
[0040]菌絲液澆灌到秧苗根部:用水將印度梨形孢菌絲配成含菌絲濃度為4g/L的菌絲液，將菌絲液澆灌于苗齡為10天的水稻秧苗根部，設(shè)2個(gè)處理與I個(gè)對(duì)照。處理I為含納米材料ZnO (30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，處理2為普通液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，對(duì)照澆灌相同體積的水。菌絲液澆灌秧苗根部后14天，移栽到塑料桶中，同時(shí)抽樣檢測(cè)比較印度梨形孢在水稻根部的定殖情況。
[0041]通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色顯微鏡下觀察檢測(cè)印度梨形孢在水稻根部的定殖情況，結(jié)果顯示處理I的定殖率為95%，處理2的定殖率為80%，結(jié)果表明含納米材料Zn0(30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲在水稻根部的定殖率明顯提高。
[0042]將水稻秧苗移至塑料桶中栽培:挑選處理I和對(duì)照中長(zhǎng)勢(shì)一致的苗齡為25天水稻秧苗移栽至塑料桶(內(nèi)徑為30cm，高度為28cm)中，桶內(nèi)裝有含3mg/kgCd的土壤顆粒，每桶種植4穴，每穴2株，對(duì)照和處理各5桶。在水稻的整個(gè)生育期，保持水面深為l-2cm。
[0043]測(cè)定水稻不同組織的鎘含量:分別在水稻分蘗期和灌漿期取樣，測(cè)定Cd元素含量，結(jié)果是處理組水稻植株地上部組織的鎘含量顯著低于對(duì)照。如分蘗期，莖桿和葉片鎘含量分別降低了 41.6%和48.0% (圖4);灌漿期，莖桿、葉片和糙米鎘含量分別降低了 33.5%、42.6% 和 44.5% (圖 5)。
[0044]實(shí)施例2
[0045]將實(shí)施例1中盆栽水稻改成水培水稻，用營(yíng)養(yǎng)液(參照國(guó)際水稻研究所(IRRI)配方)培養(yǎng)，置(25± I) °C、14h/10h光暗交替的植物生長(zhǎng)室中，每5d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，最終同樣能降低水稻地上部鎘的積累。如3mg/L鎘脅迫處理12天后，接種印度梨形孢的水稻地上部的鎘含量比對(duì)照降低了 38.4% (圖3)。
[0046]水培條件下，印度梨形孢顯著提高了水稻對(duì)鎘脅迫的耐性。例如，25mg/L鎘處理后第12天，接種印度梨形孢的水稻幼苗的老葉開始表現(xiàn)出輕微的發(fā)黃癥狀，而對(duì)照組水稻苗的最大功能葉已經(jīng)失綠；而在50mg/L鎘脅迫下，對(duì)照組水稻幼苗的絕大多數(shù)葉片變黃枯死，只有少數(shù)葉片呈綠色，此時(shí)接種印度梨形孢的水稻幼苗也表現(xiàn)出較為明顯的鎘中毒癥狀，但是其癥狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)輕于對(duì)照。
[0047]鎘脅迫下，水稻首先表現(xiàn)出來(lái)的毒害癥狀是葉片變黃失綠，因此葉綠素含量的變化幅度可以反映出鎘元素對(duì)水稻的毒害程度。在不同Cd濃度脅迫下、不同取樣時(shí)間，接種印度梨形孢的水稻植株其葉綠素含量均比對(duì)照高，平均比對(duì)照增加13.5%。例如在Cd3和Cd25水平下，Cd處理后第1`2天時(shí)，接種印度梨形孢的水稻植株其葉綠素含量分別比對(duì)照提高了 58.7%和43.2%。說(shuō)明在鎘脅迫下，印度梨形孢可以減弱鎘元素對(duì)葉綠素的影響，增強(qiáng)光合作用，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，緩解鎘對(duì)水稻的毒害作用(圖6)。
[0048]丙二醛(MDA)含量通常用于衡量植物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，以及判斷植物對(duì)脅迫環(huán)境反應(yīng)的強(qiáng)弱。在長(zhǎng)時(shí)間或者高濃度鎘脅迫下，印度梨形孢可以降低水稻體內(nèi)MDA含量，削弱膜脂過(guò)氧化程度，維持細(xì)胞的正常膨壓和生理代謝，提高水稻對(duì)鎘脅迫的耐性。(圖7)
[0049]超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，其活性的高低變化能夠反映出對(duì)氧化損傷的修復(fù)能力。在25mg/LCd濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)，接種印度梨形孢的水稻葉片SOD幾乎都顯著高于對(duì)照。說(shuō)明印度梨形孢誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生S0D，其增強(qiáng)了活性氧的清除能力，減輕了 Cd所帶來(lái)的脅迫壓力(圖8)。
[0050]過(guò)氧化物酶(POD)的作用是清除SOD催化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2,使植物體免受其危害。隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻葉片POD活性增強(qiáng)。在25mg/LCd脅迫下，不同取樣時(shí)間，接種印度梨形孢的水稻葉片中POD活性均高于對(duì)照，如在第9天和第12天分別提高了 20.1%和26.6%(圖9)。說(shuō)明印度梨形孢可以增強(qiáng)水稻葉片POD活性，說(shuō)明該菌激活了水稻葉片中的活性氧清除系統(tǒng)，降低了活性氧含量。
[0051]實(shí)施例3
[0052]將實(shí)施例1中印度梨形孢菌絲塊改成印度梨形孢孢子液，接種于含0.01g/LZnO的液體Kafer培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床100rpm、25°C避光振蕩培養(yǎng)7天，其余等同于實(shí)例1，最終也能降低水稻地上部鎘的積累。
[0053]實(shí)施例4
[0054]將實(shí)施例1中印度梨形孢菌絲液濃度改為lg/L，其余等同于實(shí)例I，最終也能達(dá)到降低水稻地上部鎘的積累。
[0055]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所 附權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.一種降低水稻地上部鎘含量的方法，其特征在于:所述方法的具體步驟如下: (1)含0.01g/L納米材料氧化鋅培養(yǎng)基的配制； 用納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg ； (2)印度梨形孢菌絲液灌根處理水稻秧苗根部； 將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，接著澆灌于水稻秧苗根部，灌根處理，使印度梨形孢定殖于水稻根部； (3)水稻秧苗的移栽和后期的管理 經(jīng)印度梨形孢定殖后水稻移栽到大田，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使水稻正常生長(zhǎng)至收獲。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，納米材料氧化鋅的粒徑為30nmo
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述的Kafer培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含有:2.0Og蛋白胨、1.0Og酵母提取物、1.0Og水解酪蛋白、0.60gNaN03、0.52gKCl、0.52gMgS04.7Η20、1.52gKH2P04、0.52gZnS04.7H20, IOmgH3BO3^mgMnSO4.H2O,1.6mgCoCl.5H20、L 6mgCuS04.5H20、1.1mg (NH4)6MO7O24U.3mgFeS04、l.8mgEDTA、0.1Omg 硫胺素、0.04mg甘氨酸`、0.01mg煙酸、0.01mg批卩多醇。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的印度梨形孢菌絲液的制備方法如下:在25°C~28°C、100rpm~120rpm避光搖床上，用含0.01g/L納米材料氧化鋅的Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)印度梨形孢7_10天，過(guò)濾,收集菌絲體，用蒸懼水配成濃度為lg/L_4g/L的菌絲液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述印度梨形孢菌絲液印度梨形孢菌絲液濃度為lg/L-4g/L。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述灌根處理時(shí)水稻苗齡為7-14 天。
【文檔編號(hào)】A01G16/00GK103858719SQ201410087609
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】樓兵干, 吳金丹, 劉曉曦, 陳乾, 高其康, 林福呈 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)