一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用，該菌株已于2014年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?NO.8861。本發(fā)明的菌株用于僵蠶生產(chǎn)時(shí)包括以下步驟：用含0.2%吐溫-80的無(wú)菌水將球孢白僵菌配制成孢子懸浮液，均勻噴灑5齡起蠶，接種第4-5天，家蠶大批量發(fā)僵病死亡，得到僵蠶。本發(fā)明的球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶致病力強(qiáng)，家蠶死亡時(shí)間整齊，僵化率高，有利于解決僵蠶的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制等問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于僵蠶生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]僵蠶為蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶Bombyx mori L.4_5齡的幼蟲(chóng)感染(或人工接種)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體，是一種優(yōu)良的中藥材，在中成藥和中藥方劑中應(yīng)用廣泛，年需求量在1000噸左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在513種人用成藥中有49種含白僵蠶，64種兒科成藥中含白僵蠶的有29種，如七珍丸、太極升降丸、小兒奇應(yīng)丸、小兒鎮(zhèn)驚丸等。
[0003]但是，當(dāng)前僵蠶主要依靠從蠶區(qū)農(nóng)戶(hù)散收，無(wú)論從藥材的品質(zhì)方面考慮，還是從桑蠶生產(chǎn)安全角度來(lái)講，都存在重大隱患。為達(dá)到僵蠶質(zhì)量?jī)?yōu)質(zhì)化、應(yīng)用廣泛化和蠶區(qū)僵病可控制的目的， 申請(qǐng)人:于2007年提出在非蠶區(qū)大規(guī)模人工生產(chǎn)白僵蠶的設(shè)想，并進(jìn)行了初步嘗試。但是，由于在接種時(shí)缺乏優(yōu)良的白僵菌菌株，造成家蠶僵化成功率低，僵蠶產(chǎn)量不高，嚴(yán)重影響到僵蠶生產(chǎn)的效益和人工生產(chǎn)僵蠶的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)。因此，篩選對(duì)家蠶高致病力的球孢白僵菌菌株是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)研究工作。
[0004]在傳統(tǒng)分類(lèi)方法中，白僵菌分生孢子和菌落形態(tài)等特征是白僵菌屬分類(lèi)的重要依據(jù)。但是，對(duì)于形態(tài)特征差異不明顯的菌株用傳統(tǒng)的方法很難準(zhǔn)確鑒定，所以以形態(tài)特征為主，同時(shí)依據(jù)生理生化指標(biāo)和核酸指標(biāo)，對(duì)白僵菌屬種進(jìn)行分類(lèi)鑒定更為準(zhǔn)確和科學(xué)，其中，ITS被廣泛用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服因缺乏優(yōu)良的白僵菌菌株而導(dǎo)致的家蠶僵化成功率低，僵蠶產(chǎn)量不高等問(wèn)題，本發(fā)明的首要目的在于提供一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述的球孢白僵菌菌株在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株(JC-1),已于2014年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8861。
[0009]上述的球孢白僵菌菌株是從僵蠶中分離純化后得到，其性狀如下:
[0010]菌落和分生孢子形態(tài):本發(fā)明的球孢白僵菌菌株在26°C、相對(duì)濕度(RH) 95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，用0.2%吐溫-80的水溶液沖洗平板表面，經(jīng)過(guò)濾、離心后懸浮于0.2%吐溫-80的水溶液中，配成濃度為I X IO7個(gè)/mL的孢子懸浮液，用接種針?lè)謩e將孢子懸浮液植于PDA培養(yǎng)基平板,每皿I點(diǎn)，每個(gè)菌株分別用3個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng),接種后置于26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天觀察記錄菌株菌落形態(tài)特征。如圖1所示。
[0011]由圖1可見(jiàn)，本發(fā)明的球孢白僵菌菌株菌落中心略凸起，基質(zhì)為桃紅色，菌落為純白色，呈同心環(huán)擴(kuò)散狀生長(zhǎng)。
[0012]將本發(fā)明球孢白僵菌菌株的成熟孢子用0.2%吐溫-80的水溶液配成孢子懸浮液，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。如圖2所示，分生孢子為球形。
[0013]本發(fā)明球孢白僵菌菌株的ITS鑒定:菌株DNA的提取按照TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 操作進(jìn)行。利用引物 ITS4 (SEQ IDN0.1)和ITS5 (SEQ ID N0.2)用于rRNA ITS片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s,循環(huán) 30 次；72°C延伸 lOmin。
[0014]本發(fā)明球孢白僵菌菌株的ITS序列如SEQ ID N0.3所示，序列長(zhǎng)度596bp。通過(guò)NCBI/blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與FJAT-9624同源性最高，達(dá)99.8%以上，為球孢白僵菌。
[0015]上述的球孢白僵菌菌株應(yīng)用于僵蠶生產(chǎn)，包括以下步驟:
[0016]用含0.2%吐溫-80的無(wú)菌水將球孢白僵菌配制成孢子懸浮液，均勻噴灑5齡起蠶，接種第4-5天，家蠶大批量發(fā)僵病死亡，得到僵蠶；
[0017]所述的孢子懸浮液中，孢子濃度為(I X IO4)-(IX IO7)個(gè)/mL，優(yōu)選I X IO6個(gè)/mL。
[0018]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0019]1、本發(fā)明的球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶致病力強(qiáng)，家蠶死亡時(shí)間整齊，僵化率高。
[0020]2、本發(fā)明的球孢白僵菌菌株可用于白僵蠶的人工規(guī)?；a(chǎn)，有利于解決僵蠶的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制等問(wèn)題。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是本發(fā)明的球孢白僵菌菌株培養(yǎng)第7天時(shí)的菌落形態(tài)圖。
[0022]圖2是本發(fā)明球孢白僵菌菌株的分生孢子形態(tài)圖。 [0023]圖3是家蠶接種不同濃度球孢白僵菌后的死亡率曲線圖。
[0024]圖4是接種不同濃度的球孢白僵菌后獲得的僵蠶。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0026]實(shí)施例
[0027]1、本發(fā)明球孢白僵菌菌株的分離鑒定
[0028](I)分離純化
[0029]本發(fā)明的僵蠶是從廣東羅定蠶區(qū)收集，家蠶品種為“春5”。
[0030]收集的僵蠶充分僵化后，將其體表白粉狀物輕輕抖落到盛有0.2%吐溫-80的水溶液的三角瓶中，用磁力攪拌子劇烈震蕩使白僵菌分生孢子單個(gè)分開(kāi)。將孢子懸浮液梯度稀釋?zhuān)脺缇娜切尾Ａ磕ò粽喝『缶鶆蛲坎加赑DA培養(yǎng)基平板上，置于26°C、90%濕度環(huán)境下培養(yǎng)。
[0031]當(dāng)有純白色單個(gè)菌落長(zhǎng)出后，及時(shí)用接種針挑取菌落轉(zhuǎn)接到另一個(gè)滅菌的PDA培養(yǎng)基平板上，繼續(xù)培養(yǎng)觀察確無(wú)其它雜菌后，純化培養(yǎng)完成。
[0032](2)菌落和分生孢子形態(tài)
[0033]白僵菌菌株在26°C、RH95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，用0.2%吐溫-80的水溶液沖洗平板表面，經(jīng)過(guò)濾、離心后懸浮于0.2%吐溫-80的水溶液中，配成濃度為I X IO7個(gè)/mL的孢子懸浮液，用接種針?lè)謩e將孢子懸浮液植于PDA培養(yǎng)基平板，每皿I點(diǎn)，每個(gè)菌株分別用3個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)，接種后置于26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天觀察記錄菌株菌落形態(tài)特征。如圖1所示。
[0034]由圖1可見(jiàn)，該菌落中心略凸起，基質(zhì)為桃紅色，菌落為純白色，呈同心環(huán)擴(kuò)散狀生長(zhǎng)。
[0035]成熟孢子用0.2%吐溫-80的水溶液配成孢子懸浮液，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。如圖2所示，分生孢子為球形。
[0036](3)菌株ITS鑒定
[0037]菌株DNA的提取按照 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0操作進(jìn)行。利用引物ITS4和ITS5用于rRNA ITS片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s,循環(huán) 30 次；72°C延伸IOmin0[0038]引物ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' (SEQ ID N0.1)
[0039]引物ITS5:5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0040]本發(fā)明球孢白僵菌菌株的ITS序列如SEQ ID N0.3所示，序列長(zhǎng)度596bp。通過(guò)NCBI/blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與FJAT-9624同源性最高，達(dá)99.8%以上，為球孢白僵菌。
[0041 ] 2、本發(fā)明球孢白僵菌菌株的生物學(xué)特性
[0042](I)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量測(cè)定
[0043]用接種針將含有I X IO7個(gè)/mL孢子的懸浮液植于PDA培養(yǎng)基平板，每天測(cè)定菌落的直徑，每個(gè)菌株重復(fù)3次，共記錄10天。
[0044]表1菌落生長(zhǎng)直徑測(cè)定(mm)
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一株對(duì)家蠶具有高致病力的球孢白僵菌菌株，已于2014年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8861。
2.權(quán)利要求1所述的球孢白僵菌菌株在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的球孢白僵菌菌株在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟: 用含0.2%吐溫-80的無(wú)菌水將球孢白僵菌配制成孢子懸浮液，均勻噴灑5齡起蠶，接種第4-5天，家蠶大批量發(fā)僵病死亡，得到僵蠶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的球孢白僵菌菌株在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于:所述的孢子懸浮液中，孢子濃度為(1X 104)-(1 X 107)個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的球孢白僵菌菌株在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于:所述的孢子懸浮液中，孢子濃度為1 X 106個(gè)/mL。
【文檔編號(hào)】A01K67/04GK103923841SQ201410148487
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】邢東旭, 楊瓊, 李麗, 廖森泰, 羅國(guó)慶, 肖陽(yáng), 李慶榮, 葉明強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所