抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物菌劑的制作，特別是指抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝。是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源及氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的肥力降低，有毒物質(zhì)積累，嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量問題，具有抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)符合GB20287-2006的要求，保質(zhì)期達(dá)18個(gè)月以上，比采用氯化苦熏蒸的大棚中的草莓在產(chǎn)量、糖酸比、可溶性固形物含量、Vc含量等技術(shù)指標(biāo)上具備明顯優(yōu)勢(shì)，能很好的降低發(fā)病率，增強(qiáng)作物抗性，提高草莓產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物菌劑的制作，特別是指抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]草莓重茬病一直是困擾草莓生產(chǎn)的重要問題，尤其是隨著設(shè)施產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，這個(gè)問題越來越突出。目前草莓要連續(xù)種植普遍采用的方法就是劇毒農(nóng)藥溴甲烷土壤熏蒸法。但該藥的使用成本高達(dá)每公頃一萬五千元以上，且藥效僅管當(dāng)年，另外溴甲烷是劇毒氣體，對(duì)大氣臭氧層破壞嚴(yán)重，在2005年聯(lián)合國環(huán)保組織已將其列為限用藥物。大量有毒藥劑的使用使土壤的理化性質(zhì)進(jìn)一步惡化，肥力降低，有毒物質(zhì)積累，嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量。國內(nèi)外的研究表明，造成作物重茬的主要原因是土壤營養(yǎng)元素的缺乏和土傳病害所致。土傳病害，同一作物的耕作、施肥、灌溉等方式固定不變，連年耕作，使土壤環(huán)境惡化，肥力降低，有毒物質(zhì)積累，有益微生物菌群數(shù)量減少，引發(fā)病原微生物的大量滋生。草莓重茬病的生物防治對(duì)環(huán)境保護(hù)和提高草莓國際市場競爭力具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種抗草莓重巷用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝。
[0004]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0005]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0006]豆柏2.0% -3.0% ;玉米漿干粉0.5% -1.5 % ;淀粉0.5% -1.5 % ;葡萄糖0.4% -0.6% ;濃度為 30.8mg/L 的 MnSO4 溶液 0.1% -0.3% ；NaC10.05% -0.15% ;消泡劑
0.05%。-0.15%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0007]通氣發(fā)酵的工藝條件如下:
[0008]攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm,0-4 小時(shí):通風(fēng)量為 1:0.9-1.lvvm，溫度為 32°C -36°C ；4-8小時(shí):通風(fēng)量為1:L0-L2vvm，溫度為33°C _37°C;8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.1-1.3vvm,溫度為34°C -38°C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明中的芽孢率檢測采用平板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基采用營養(yǎng)瓊脂，計(jì)數(shù)方法參照GB20287-2006。
[0010]本發(fā)明中的具體技術(shù)內(nèi)容還有:
[0011] 為便于菌種有效利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:
[0012]在酶解罐內(nèi)加入豆柏200kg-250kg及水1200L-1600L，加溫至33°C _37°C，加入中性蛋白酶 0.9kg-l.2kg，在 IOOrpm 攪拌 2.0-2.5h。[0013]為縮短發(fā)酵周期，常見的技術(shù)方案是，所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)
酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0014]其中更為優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0015]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0016]將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C -35°C培養(yǎng)36h_48h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，30°C -35°C培養(yǎng)36h-48h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，30°C -35°C培養(yǎng)48h-72h ；
[0017]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏1% -5%，蛋白胨3% -8%，氯化鈉3% -8%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為70mL。
[0018]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0019]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35°C _45°C時(shí)接種，壓力為0.03-0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150_250rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.7-0.9vvm，溫度為33°C-37°C;4-8小時(shí):通風(fēng)量為1:0.8-l.0vvm，溫度為330C -370C ；8小時(shí)后:通風(fēng) 量為1:0.9-1.lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0020]所述的發(fā)酵液加熱至35_45°C，加入質(zhì)量百分含量為3.0% -4.0%的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.0% -4.0%的氯化鈣，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0021]更為優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的菌粉中的含菌數(shù)為2X IOltlCfu/克。
[0022]本發(fā)明中所涉及的各項(xiàng)數(shù)據(jù)的獲得采用如下方法:
[0023]1、發(fā)酵液計(jì)數(shù):稱取樣品10mL，加入帶玻璃珠的IOOmL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成母液菌懸液(基礎(chǔ)液)。
[0024]用無菌移液管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45ml無菌水中，按1:10進(jìn)行系列稀釋，分別得到1:1 X IO1,1:1 X IO2,1:1 X IO3,1:1 X IO4……稀釋的菌懸液(每個(gè)稀釋
度應(yīng)更換無菌移液管)。
[0025]2、加樣及培養(yǎng):每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，用無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1ml，加至預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。
[0026]每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)以無菌水作空白對(duì)照，于適宜的條件下培養(yǎng)。
[0027]3、菌落識(shí)別:根據(jù)所檢測菌種的技術(shù)資料，每個(gè)稀釋度取不同類型的代表菌落通過涂片、染色、鏡檢等技術(shù)手段確認(rèn)有效菌。當(dāng)空白對(duì)照培養(yǎng)皿出現(xiàn)菌落數(shù)時(shí)，檢測結(jié)果無效，應(yīng)重做。菌落計(jì)數(shù)以出現(xiàn)20-300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(絲狀真菌為10-150個(gè)菌落數(shù))，分別統(tǒng)計(jì)有效活菌數(shù)目和雜菌數(shù)目。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20-300個(gè)之間時(shí)，則以該平均菌落數(shù)計(jì)算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20-300個(gè)之間時(shí)，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值小于等于2應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計(jì)算。
[0028]4、有效活菌數(shù)按式⑴或式⑵計(jì)算:
[0029]Ω= kvj (/? K2) X I O—8.....................( I )[0030]η= χ kvj (V0 ν2) X I O—8.....................( 2 )
[0031]式中:
[0032]nm一質(zhì)量有效活菌數(shù),億/g
[0033]nv—體積有效活菌數(shù)，億/mL
[0034]I一菌落平均數(shù)(個(gè))
[0035]k一稀釋倍數(shù)
[0036]V1一基礎(chǔ)液體積(mL)
[0037]v2—菌懸液加入量(mL)[0038]Vtl—樣品量(mL)
[0039]IHci—樣品量(g)。
[0040]5、發(fā)酵液處理:
[0041]發(fā)酵液在75 °C -85 °C水浴處理15_20min，殺死幾乎所有菌體后，芽孢計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法同發(fā)酵液計(jì)數(shù)方法。
[0042]芽孢率=熱處理后的芽孢數(shù)/發(fā)酵液的菌數(shù)X %。
[0043]本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于:
[0044]1、 申請(qǐng)人:對(duì)利用本發(fā)明的方法制備的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑進(jìn)行檢測，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)符合GB20287-2006的要求，保質(zhì)期達(dá)18個(gè)月以上。
[0045]2、經(jīng) 申請(qǐng)人:在保定市滿城縣草莓大棚中進(jìn)行的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，使用本發(fā)明制備的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑比采用氯化苦熏蒸的大棚中的草莓在產(chǎn)量、糖酸比、可溶性固形物含量、Vc含量等技術(shù)指標(biāo)上具備明顯優(yōu)勢(shì)，能很好的降低發(fā)病率，增強(qiáng)作物抗
性，提高草莓產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0046]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步及描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書作出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0047]實(shí)施例1
[0048]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0049]豆柏2.0% ;玉米漿干粉0.5% ;淀粉0.5% ;葡萄糖0.4% ;濃度為30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.1% ；NaC10.05% ;消泡劑 0.05% ;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH 值 7.0±0.I ；
[0050]通氣發(fā)酵的工藝條件如下:
[0051]攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.9vvm，溫度為32°C -36°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.0vvm，溫度為33°C -37°C；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.lvvm，溫度為34°C -38°C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0052]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:[0053]在酶解罐內(nèi)加入豆柏200kg及水1200L，加溫至33°C -37°C，加入中性蛋白酶
0.9kg,在 IOOrpm 攬拌 2.0h。
[0054]所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0055]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0056]將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)72h ；
[0057]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏1%，蛋白胨3%，氯化鈉3%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為 70mL。
[0058]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0059]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35°C時(shí)接種，壓力為0.03MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.7vvm，溫度為330C -37°C;4_8小時(shí):通風(fēng)量為I:0.8vvm，溫度為33°C -37°C；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:0.9vvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0060]所述的發(fā)酵液加熱至35°C，加入質(zhì)量百分含量為3.0%的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.0-4.0%的氯化鈣，50_100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0061]所述的菌粉中的含菌數(shù)為2 X IOltlCfu/克。
[0062] 實(shí)施例2
[0063]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0064]豆柏3.0% ;玉米漿干粉1.5% ;淀粉1.5% ;葡萄糖0.6% ;濃度為30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.3% ；NaC10.15% ;消泡劑 0.15% ;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0065]通氣發(fā)酵的工藝條件如下:
[0066]攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為1:1.lvvm，溫度為32°C -36°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.2vvm，溫度為33°C -37°C；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.3vvm，溫度為34°C -38°C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0067]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:
[0068]在酶解罐內(nèi)加入豆柏250kg及水1600L，加溫至33 °C -37 °C，加入中性蛋白酶
1.2kg,在 IOOrpm 攬拌 2.5h。
[0069]所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0070]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0071]將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為35°C培養(yǎng)36h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)36h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，35 °C培養(yǎng)48h ；
[0072]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏5%，蛋白胨8%，氯化鈉8%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為 70mL。
[0073]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0074]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35-45°C時(shí)接種，壓力為0.03-0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.9vvm，溫度為330C -37°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為I:1.0vvm，溫度為33°C -37°C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0075]所述的發(fā)酵液加熱至35_45°C，加入質(zhì)量百分含量為4.0 %的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為4.0%的氯化鈣，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0076]所述的菌粉中的含菌數(shù)為2 X IOltlCfu/克。
[0077]實(shí)施例3
[0078]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0079]豆柏2.5% ;玉米漿干粉0.8% ;淀粉1% ;葡萄糖0.5% ;濃度為30.8mg/L的MnSO4溶液 0.2% ；NaC10.1% ;消泡劑 0.1%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0080]通氣發(fā)酵的工藝條件如下:
[0081]攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為l:lvvm，溫度為32 °C -36 °C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.lvvm，溫度為33 °C -37 °C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為l:1.2VVm，溫度為340C -380C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0082]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:
[0083]在酶解罐內(nèi)加入豆柏220kg及水1500L，加溫至33°C _37°C，加入中性蛋白酶1kg，在 IOOrpm 攪拌 2.0-2.5h。
[0084]所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0085]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0086]將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為32°C培養(yǎng)40h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)40h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，32 °C培養(yǎng)60h ；
[0087]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏3%，蛋白胨5%，氯化鈉5%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為 70mL。
[0088]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0089]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35-45°C時(shí)接種，壓力為0.04MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150_250rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.8vvm,溫度為33°C -37°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:0.9vvm，溫度為33°C -37°C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為l:lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0090]所述的發(fā)酵液加熱至35_45°C，加入質(zhì)量百分含量為3.5%的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.5%的氯化鈣，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0091]所述的菌粉中的含菌數(shù)為2 X IOltlCfu/克。
[0092]實(shí)施例4
[0093]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0094]豆柏2.2% ;玉米漿干粉0.7% ;淀粉0.7% ;葡萄糖0.45% ;濃度為30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.15% ；NaC10.08%;消泡劑 0.08%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0095]通氣發(fā) 酵的工藝條件如下:
[0096]攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為l:lvvm，溫度為32 °C -36°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.0-1.2vvm，溫度為33°c-37°c;8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.1-1.3vvm，溫度為340C -380C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0097]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:
[0098]在酶解罐內(nèi)加入豆柏240kg及水1300L，加溫至33°C _37°C，加入中性蛋白酶1kg，在 IOOrpm 攪拌 2.1h。
[0099]所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0100]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0101]將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C -35°c培養(yǎng)38h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，30°C -35°C培養(yǎng)38h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，30°C -35°C培養(yǎng)60h ；
[0102]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏2%，蛋白胨4%，氯化鈉4%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為 70mL。
[0103]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0104]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35-45°C時(shí)接種，壓力為0.04MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150_250rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為 1:0.75vvm，溫度為 330C -37°C ;4_8 小時(shí):通風(fēng)量為 1:0.85vvm，溫度為 33°C -37°C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為l:lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0105]所述的發(fā)酵液加熱至35_45°C，加入質(zhì)量百分含量為3.5%的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.5%的氯化鈣，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0106]所述的菌粉中的含菌數(shù)為2X IOltlCfu/克。
[0107]實(shí)施例5[0108]抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0109]豆柏2.8% ;玉米漿干粉1.2% ;淀粉1.2% ;葡萄糖0.55% ;濃度為30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.25% ；NaC10.13%;消泡劑 0.13%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0110]通氣發(fā)酵的工藝條件如下:
[0111]攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為1:1.1vvm,溫度為32 °C -36 °C ；4-8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.2vvm，溫度為33°C -37°C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.3vvm，溫度為340C -380C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0112]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理:
[0113]在酶解罐內(nèi)加入豆柏240kg及水1500L，加溫至33°C -37°C，加入中性蛋白酶
1.1kg,在 IOOrpm 攪拌 2.4h。
[0114]所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
[0115]所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟:
[0116]將菌種轉(zhuǎn)接到試管 斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C -35°C培養(yǎng)45h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，30°C -35°C培養(yǎng)45h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，30°C -35°C培養(yǎng)65h ；
[0117]其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏4%，蛋白胨7%，氯化鈉7%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為 70mL。
[0118]所述的種子液的制備包括如下工藝步驟:
[0119]用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35-45°C時(shí)接種，壓力為0.04MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為220rpm，0_4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.85vvm，溫度為 330C -37°C ;4_8 小時(shí):通風(fēng)量為 I:0.9vvm，溫度為 33°C -37°C ；8 小時(shí)后:通風(fēng)量為l:lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
[0120]所述的發(fā)酵液加熱至35_45°C，加入質(zhì)量百分含量為3.8%的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.8%的氯化鈣，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
[0121]所述的菌粉中的含菌數(shù)為2 X IOltlCfu/克。
[0122] 申請(qǐng)人:對(duì)實(shí)施例1-5中制備的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑進(jìn)行如下試驗(yàn)，試驗(yàn)于保定市滿城縣農(nóng)戶家草莓大棚內(nèi)進(jìn)行。選取條件一致的草莓大棚6個(gè),5個(gè)大棚施用抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑，一個(gè)大棚采用氯化苦熏蒸。菌劑連續(xù)兩年使用，每年分別調(diào)查草莓的發(fā)病率，產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果如表1。
[0123]表1連續(xù)兩年施用抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的草莓各項(xiàng)指標(biāo)的變化
[0124]
【權(quán)利要求】
1.抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，是將地衣芽胞桿菌ACCC01957接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行通氣發(fā)酵制成發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、添加保護(hù)劑，載體吸附，噴霧干燥噴干制成菌粉；其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 豆柏 2.0% -3.0%;玉米漿干粉0.5% -1.5%;淀粉0.5% -1.5%;葡萄糖0.4% -0.6%；濃度為 30.8mg/L 的 MnSO4 溶液 0.1% -0.3%；NaC10.05% -0.15%;消泡劑 0.05%。-0.15%；消前 PH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ； 通氣發(fā)酵的工藝條件如下: 攪拌轉(zhuǎn)速為150-250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.9-1.lvvm，溫度為32°C _36°C;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:1.0-1.2VVm，溫度為33°C-37°C;8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:1.l-1.3VVm，溫度為340C -380C，當(dāng)芽孢率為90%以上時(shí)，作為發(fā)酵終點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆柏采用如下方法預(yù)處理: 在酶解罐內(nèi)加入豆柏200kg-250kg及水1200L-1600L，加溫至33°C _37°C，加入中性蛋白酶 0.9kg-l.2kg，在 IOOrpm 攪拌 2.0-2.5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的地衣芽胞桿菌ACCC01957在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的擴(kuò)大培養(yǎng)包括克氏瓶種子的制備以及種子液的制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的克氏瓶種子的制備包括如下工藝步驟: 將菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C -35°C培養(yǎng)36h-48h，培養(yǎng)好的試管斜面再轉(zhuǎn)接一次試管斜面培養(yǎng)基，30°C -35°C培養(yǎng)36h-48h，第二次培養(yǎng)好的試管斜面轉(zhuǎn)接到克氏瓶斜面培養(yǎng)基上，30°C -35°C培養(yǎng)48h-72h ； 其中試管斜面培養(yǎng)基及克氏瓶培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:牛肉膏1% -5%，蛋白胨3% -8%，氯化鈉3% -8%,pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容積為250mL，克氏瓶培養(yǎng)基的裝量為70mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的種子液的制備包括如下工藝步驟: 用無菌水清洗下兩個(gè)克氏瓶斜面培養(yǎng)基上生長好的菌種至接種瓶中，待滅菌后的種子培養(yǎng)基溫度35 °C -45 °C時(shí)接種，壓力為0.03-0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150_250rpm，0-4小時(shí):通風(fēng)量為1:0.7-0.9vvm，溫度為33°C -37°C ;4_8小時(shí):通風(fēng)量為1:0.8-l.0vvm，溫度為330C -370C ；8小時(shí)后:通風(fēng)量為1:0.9-1.lvvm，溫度為30°C -35°C，發(fā)酵周期為12小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的發(fā)酵液加熱至35°C _45°C，加入質(zhì)量百分含量為3.0% -4.0 %的磷酸二氫鈉作為保護(hù)劑，50-100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，加入質(zhì)量百分含量為3.0% -4.0%的氯化鈣，50_100rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)，絮凝菌體，添加載體輕質(zhì)碳酸鈣后經(jīng)噴霧干燥制成菌粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7中任一項(xiàng)所述的抗草莓重茬用地衣芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的菌粉中的含菌數(shù)為2X IOltlCfu/克。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK103947682SQ201410209865
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】李賓, 馬清河, 秦艷梅, 陳文杰, 羅同陽, 高慶華, 鄭翔, 趙從波, 王云鵬, 章淑燕 申請(qǐng)人:河北省微生物研究所