一種桑樹子葉不定芽的誘導方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑樹子葉不定芽的誘導方法，屬于植物基因工程領域。具體是以桑樹種子內(nèi)胚中子葉為外植體，流水沖洗浸泡的種子經(jīng)表面殺菌后分離得到子葉，接在誘導培養(yǎng)基中直接誘導產(chǎn)生不定芽，不定芽長至1cm移至生根培養(yǎng)基中，形成完整植株。采用本發(fā)明方法經(jīng)不定芽產(chǎn)生的再生植株時間周期短，結果穩(wěn)定，重復性好，主要用于桑樹轉(zhuǎn)基因，是桑樹轉(zhuǎn)基因育種的前提和基礎。
【專利說明】一種桑樹子葉不定芽的誘導方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種子葉不定芽直接誘導方法，為桑樹轉(zhuǎn)基因的受體部分，屬于植物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]在眾多的植物再生體系中，通過誘導葉片不定芽、體細胞胚和原生質(zhì)體再生的方法屬單細胞起源，適合用于植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)。在眾多成熟的轉(zhuǎn)基因技術中，花生、楊樹等植物大多采用侵染葉片產(chǎn)生不定芽再生植株的方式，棉花、水稻等作物大多采用侵染下胚軸誘導胚性愈傷經(jīng)過體胚方式再生植株或先誘導胚性愈傷，再侵染胚性愈傷，通過體胚萌發(fā)方式再生植株。原生質(zhì)體系統(tǒng)作為轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)用得較少，主要原因是這一方法不經(jīng)濟，成本高，難度也大。相比體細胞胚體系和不定芽體系，不定芽再生體系有明顯有優(yōu)勢，如果同一種植物同時能運用體細胞胚方式和不定芽再生方式進行轉(zhuǎn)基因，一般都會采用不定芽再生的方式。直接誘導不定芽時間周期短，一般誘導3個星期左右，不定芽開始發(fā)生，再發(fā)育4周左右可以移瓶生根，整個周期在3個月左右；而采用誘導體細胞胚的方式，步驟繁多，時間長，從浸染開始到獲得植株需要9個月至I年時間。采用不定芽再生的方式，畸形苗少，再生苗長勢旺，而采用體細胞胚的方式有較多畸形苗。
[0003]王勇等學者公開了桑子葉不定芽的誘導與再生植株，用桑子葉為受體開展桑樹基因工程研究作準備，但是其細胞分裂素與植物生長素濃度比較低，并且是采取一次誘導的方法，不考慮不定芽 發(fā)生和發(fā)育對激素濃度要求的不同，所以子葉不定芽誘導率很低；此外，該方法缺乏組織學和解剖學的方法證明所誘導的芽為不定芽還是胚芽來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術問題:針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種桑樹子葉不定芽的誘導方法，根據(jù)不定芽發(fā)生和發(fā)育對激素濃度要求的不同進行遞度誘導，在高濃度細胞分裂素(6-BA)下誘導不定芽發(fā)生的啟動，在不定芽發(fā)生啟動后轉(zhuǎn)入較低濃度細胞分裂素(6-BA)中促進不定芽發(fā)育，方法穩(wěn)定，誘導率高。
[0005]技術方案:本發(fā)明提供的桑樹子葉不定芽的誘導方法，包括以下步驟:
(I)種子吸脹與培養(yǎng)
將桑樹種子清水浸泡12h后，用流水沖洗1-2h，其次用7%次氯酸鈉溶液或0.1%氯化汞溶液滅菌15分鐘，然后用滅菌蒸餾水沖洗3-4次。
[0006](2)子葉分離
將吸漲滅菌好的桑樹種子置于解剖鏡下，用尖嘴鑷撕去種皮，將兩片子葉分開，用手術刀將子葉從基部切除。
[0007](3)不定芽誘導
將分離得到子葉接入不定芽誘導培養(yǎng)基I上，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入不定芽誘導培養(yǎng)基2中。[0008]所述不定芽誘導培養(yǎng)基I為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為5.8-6.0。
[0009]所述不定芽誘導培養(yǎng)基2為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為5.8-6.0。
[0010](4)不定芽生長
不定芽形成后，當不定芽形成3-4片葉片時移入桑樹組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
[0011](5)不定芽生根
當不定芽長至I厘米時，移入生根培養(yǎng)基形成完整植株，生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為5.8-6.0。
[0012]有益效果:本發(fā)明為桑樹轉(zhuǎn)基因提供了一個有效的受體再生系統(tǒng)，時間周期短，不定芽誘導效果好，結果穩(wěn)定，重復效果好，為大規(guī)模轉(zhuǎn)基因桑樹創(chuàng)造了可能，實現(xiàn)桑樹種質(zhì)通過轉(zhuǎn)基因手段進行種質(zhì)創(chuàng)新與儲備。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為子葉分離圖；圖2為誘導子葉產(chǎn)生的不定芽；
圖3為桑樹子葉不定芽掃描電鏡照片；圖4為桑樹子葉不定芽發(fā)生組織切片。
【具體實施方式】
[0014]下面通過實施例的方式對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明范圍。
[0015]實施例1
(I)種子吸脹與培養(yǎng)
取200粒一代雜交桑豐馳桑種子,放入燒杯內(nèi)加清水浸泡12小時,然后將燒杯放在水龍頭下流水沖洗2小時；之后將燒杯中水倒干，加入75%酒精晃動10分鐘，倒干酒精后清水沖洗2次；加7%次氯酸鈉溶液表面殺菌15分鐘，其間不斷晃動，移入超凈工作臺內(nèi)，用滅菌蒸溜水沖洗3次。
[0016](2)子葉分離
將表面殺菌處理后的種子置于超凈工作臺內(nèi)解剖鏡上，用手術刀在種臍處側面切開種皮缺口，用鑷子輕壓種子種皮缺口對側，將完整胚輕輕擠出；用解剖鑷將胚中兩片子葉輕輕分開，用手術刀將子葉從基部切除。
[0017](3)不定芽誘導
將分離得到子葉接種在不定芽誘導培養(yǎng)基I中(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值
6.0)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)3周移入不定芽誘導培養(yǎng)基2中(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 6.0)。
[0018](4)不定芽生長不定芽發(fā)育至3-4片葉片時將不定芽移出，剪去下部葉片，移入不定芽繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6_BA)+0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為6.0)。
[0019](5)不定芽生根
待不定芽長至I厘米，將上部莖段剪下移入生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為6.0);不定芽生根形成完整植株后將植株取出，洗去根部瓊脂，移入室內(nèi)栽培基質(zhì)中生長煉苗。
[0020]圖1為實施例1不定芽分離，從圖1中可以看出，分離得到的子葉沒有附帶任何胚芽組織；圖2為誘導子葉產(chǎn)生的不定芽，從圖2可以看出是一團芽，沒有一個芽占據(jù)優(yōu)勢起主芽作用；圖3為不定芽掃描電鏡圖，從圖3可以看出在細微結構上，不定芽相互疊在一起，沒有主芽側芽之分；圖4為不定芽組織切片，從圖4可以看出不定芽發(fā)生時沒有任何維管組織與之相連。
[0021]表1實施例1子葉不定芽誘導情況(誘導培養(yǎng)后I個月調(diào)查)
【權利要求】
1.一種桑樹子葉不定芽的誘導方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將桑樹種子清水浸泡12h后,用流水沖洗l_2h，再用7%次氯酸鈉溶液或0.1%氯化汞溶液滅菌15分鐘，然后用滅菌蒸餾水沖洗3-4次； (2)在解剖鏡下無菌環(huán)境中剝?nèi)シN皮，分離子葉； (3)將分離得到子葉接入不定芽誘導培養(yǎng)基I上，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入不定芽誘導培養(yǎng)基2中； (4)當不定芽形成3-4片葉片時移入桑樹組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中； (5)當不定芽長至I厘米時，移入生根培養(yǎng)基形成完整植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導方法，其特征在于所述不定芽誘導培養(yǎng)基I為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
3.根據(jù)權利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導方法，其特征在于所述不定芽誘導培養(yǎng)基2為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
4.根據(jù)權利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA) ，PH 值為 5.8-6.0。
5.根據(jù)權利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為 5.8-6.0。
【文檔編號】A01H4/00GK104026010SQ201410243674
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月4日 優(yōu)先權日:2014年6月4日
【發(fā)明者】潘剛, 邸炳榮, 胡穎健, 孫銀蘋, 雷朋 申請人:江蘇科技大學