一種優(yōu)化的植物病毒接種方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的利用農(nóng)桿菌接種植物病毒的方法。本方法針對(duì)能在農(nóng)桿菌中復(fù)制的植物病毒侵染性克隆，其原理是將攜帶植物病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌可以通過(guò)自然孔口和微傷口侵染植物這一特性，在普通煙四葉一心期到六葉一心期利用OD600值為0.2-0.3的農(nóng)桿菌噴霧接種，形成系統(tǒng)侵染。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，適合在田間大規(guī)模應(yīng)用，可用來(lái)接種植物病毒弱毒疫苗以保護(hù)植株免受病毒病的侵害，也可用來(lái)接種植物病毒載體，進(jìn)而在植物體內(nèi)表達(dá)外源蛋白。
【專利說(shuō)明】一種優(yōu)化的植物病毒接種方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護(hù)和植物病毒基因工程領(lǐng)域，提供了一種優(yōu)化的植物病毒接種 方法，具體是一種利用農(nóng)桿菌大規(guī)模接種病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過(guò)基因工程手段，可以構(gòu)建植物病毒的侵染性cDNA克隆，進(jìn)而利用反向遺傳學(xué) 技術(shù)明確調(diào)控病毒致病力的分子機(jī)制，由此獲得的弱毒株系可作為弱毒疫苗用來(lái)保護(hù)植株 免受強(qiáng)毒株系的危害；也可以把病毒的侵染性cDNA克隆改造成植物表達(dá)載體，用來(lái)生產(chǎn)動(dòng) 物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。
[0003] 限制植物病毒弱毒疫苗和表達(dá)載體應(yīng)用的一個(gè)重要瓶頸是目前沒(méi)有適合在田間 大規(guī)模接種的技術(shù)。根據(jù)不同植物病毒侵染性克隆的特點(diǎn)，可以通過(guò)基因槍接種，摩擦接種 或是農(nóng)桿菌浸潤(rùn)等方法接種供試植物?；驑尳臃N需要昂貴的實(shí)驗(yàn)器材，操作復(fù)雜，每批次 可接種的植株數(shù)量極少。摩擦接種和農(nóng)桿菌浸潤(rùn)不需要復(fù)雜的儀器，但每批次可接種的植 株數(shù)量也非常有限。這些方法只適合在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)用，不能滿足田間大規(guī)模接種的需要。
[0004] 因此，生產(chǎn)中急需開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便高效、適合植物病毒弱毒疫苗與表達(dá)載體大規(guī)模接種 的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有接種方法無(wú)法滿足植物病毒弱毒疫苗與表達(dá)載體田間大規(guī)模接種需要 這一問(wèn)題，本發(fā)明提供了 一種優(yōu)化的適合田間大規(guī)模接種需要的病毒接種方法。
[0006] 本發(fā)明主要是針對(duì)能在農(nóng)桿菌中復(fù)制的侵染性克隆，利用了農(nóng)桿菌在自然界可以 通過(guò)自然孔口和傷口侵入植物這一現(xiàn)象，以接種細(xì)菌的方式來(lái)接種病毒。其包括如下步驟： 將植物病毒弱毒疫苗與植物病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后離心收集菌體，重懸后 稀釋到一定濃度，通過(guò)葉片噴霧的方式將菌體噴布到植物葉片表面。農(nóng)桿菌可以通過(guò)自然 孔口（例如氣孔）和微傷口侵染植物，從而將病毒基因組帶入植物細(xì)胞，使病毒在植物細(xì)胞 內(nèi)增殖并形成系統(tǒng)侵染。
[0007] 本發(fā)明實(shí)施的具體技術(shù)方案是：將待接種病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，培養(yǎng)后 離心收集農(nóng)桿菌菌體，將其稀釋到〇D 6(?值為0. 2-0. 3,通過(guò)葉面噴施農(nóng)桿菌接種植物病毒。 接種煙草的最佳時(shí)期為四葉一心期至六葉一心期。
[0008] 本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，不需要特殊的儀器設(shè)備，適合在科研溫室、育苗 公司的育苗棚或大田應(yīng)用，可在短時(shí)間內(nèi)接種大量植株。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1采用本發(fā)明方法接種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP15天后普 通煙的癥狀（A)及綠色熒光蛋白表達(dá)情況（B)
[0010] 圖2利用本發(fā)明在普通煙三葉一心期噴霧結(jié)果示意圖
[0011] 圖中A為接種后第六天，在紫外燈下可見(jiàn)普通煙葉片出現(xiàn)零星熒光斑點(diǎn)；B為接種 后第七天，熒光斑點(diǎn)數(shù)目增加；C為接種后第八天，熒光斑點(diǎn)面積逐漸礦大，病毒通過(guò)葉脈 向其它部位擴(kuò)展；D為接種后第十天，普通煙上部葉片布滿綠色熒光。
[0012] 圖3利用本發(fā)明在普通煙四葉一心期噴霧結(jié)果示意圖
[0013] 圖中A、B、C、D分別為接種后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通煙植株 上的擴(kuò)展情況。
[0014] 圖4利用本發(fā)明在普通煙六葉一心期噴霧結(jié)果示意圖
[0015] 圖中A、B、C、D分別為接種后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通煙植株 上的擴(kuò)展情況。
[0016] 圖5利用本發(fā)明接種的弱毒株系DDK對(duì)強(qiáng)毒株系的交叉保護(hù)效果
[0017] 圖中A為先用噴霧法接種弱毒株系然后再接接種強(qiáng)毒株系的植株，幾乎看不到癥 狀；B為直接接種強(qiáng)毒株系的植株，產(chǎn)生嚴(yán)重的花葉癥狀。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0019] 實(shí)施例1 :證明農(nóng)桿菌噴霧可系統(tǒng)侵染普通煙并表達(dá)外源蛋白（以綠色熒光蛋白 GFP為例）
[0020] 1.病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0021] 從_80°C冰箱中取出一管農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞（100-200μ 1)，冰上解凍。 解凍后加入100_300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP質(zhì)粒。放入液氮中冷凍l-5min，取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0022] 加入800 μ 1無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)3h。5000r/min離心收集菌體， 離心管中保留約200 μ 1培養(yǎng)液并重新懸浮菌體。
[0023] 在超凈臺(tái)上將菌體均勻涂布于含抗生素（本實(shí)驗(yàn)中為卡那霉素、利福平霉素和四 環(huán)素）的固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2天，直至出現(xiàn)菌落。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，證明 菌落中含有病毒侵染性克隆PCamTVBMV-GFP。
[0024] 2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0025] 經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑取單菌落接種于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福平 霉素和5 μ g/ml四環(huán)素的5ml液體LB中。28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
[0026] 將5ml培養(yǎng)后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-嗎啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相應(yīng)抗生素（濃度與上述步驟相同）的LB液體培養(yǎng)基中，于 28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液以10000r/m離心1分鐘，收集菌體后懸浮于農(nóng)桿 菌重懸溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)，調(diào)整濃度使其 0D6QQ 值為 0.4左右，室溫靜置3h。
[0027] 3.寄主植物接種及結(jié)果觀察
[0028] 將攜帶侵染性克隆pCamTVBMV-GFP的農(nóng)桿菌菌體懸浮液裝入噴壺（300ml)，選取 三葉一心至四葉一心的普通煙五棵，以噴霧器噴嘴距葉片10 - 30cm處均勻噴施。處理后 植株置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16h光照/8h黑暗交替）。十五天后在白光及紫外燈下 觀察煙草發(fā)病情況及綠色熒光的有無(wú)與分布。
[0029] 結(jié)果表明，噴霧接種十五天后，所有普通煙植株均出現(xiàn)輕微的脈帶花葉癥狀， 在紫外燈下可以看到強(qiáng)烈的綠色熒光（圖1)。說(shuō)明通過(guò)農(nóng)桿菌噴霧把侵染性克隆 pCamTVBMV-GFP接種到普通煙上形成系統(tǒng)侵染，并大量表達(dá)外源的綠色熒光蛋白GFP。
[0030] 實(shí)施例2 :最佳菌液濃度以及最佳噴霧時(shí)期優(yōu)化
[0031] 1.病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采取液氮凍融法。
[0032] 從-80°C冰箱中取出1管農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞（100-200μ 1)，冰上解凍。 解凍后加入100_300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP質(zhì)粒。放入液氮中冷凍l-5min。取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0033] 加入800 μ 1無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)3h。5000r/min離心收集菌體， 離心管中保留約200 μ 1培養(yǎng)液并重新懸浮菌體。
[0034] 在超凈臺(tái)上將菌體均勻涂布于含抗生素（本實(shí)驗(yàn)中為卡那霉素、利福平和四環(huán) 素）的固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2天，直至出現(xiàn)菌落。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，證明菌 落中含有病毒侵染性克隆PCamTVBMV-GFP。
[0035] 2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0036] 經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑取單菌落接種于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福霉 素和5 μ g/ml四環(huán)素的5ml液體LB中。28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
[0037] 將5ml培養(yǎng)后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-嗎啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相應(yīng)抗生素（濃度與上述步驟相同）的LB液體培養(yǎng)基中，于 28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液以10000r/m離心1分鐘，收集菌體后懸浮于農(nóng)桿 菌重懸溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)。將懸浮液設(shè)置為5個(gè)濃 度梯度，使其〇D6(?值分別為0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 6,室溫靜置3h。
[0038] 3.最佳接種濃度及時(shí)期的篩選
[0039] 將攜帶侵染性克隆pCamTVBMV-GFP的農(nóng)桿菌懸浮液裝入噴壺（300ml)，分別選取 三葉一心、四葉一心和六葉一心的普通煙各三棵，以噴霧器噴嘴距葉片10 - 30cm處均勻噴 施。處理完的植株放置25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16h光照/8h黑暗交替）。第六天至第十 每天在紫外燈下觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各處理普通煙侵染點(diǎn)數(shù)目。
[0040] 結(jié)果表明，在普通煙三葉一心期、四葉一心期和六葉一心期噴霧都可以成功接種 病毒（圖2、圖3、圖4)。在農(nóng)桿菌0D 6(?為0. 1 - 0. 4時(shí)，接種菌液濃度越高，產(chǎn)生的斑點(diǎn)越 多，〇D6(?值為0. 4和0. 6時(shí)侵染點(diǎn)數(shù)目差別不大。噴霧時(shí)煙草葉齡越大，綠色熒光斑點(diǎn)越 多。在普通煙四葉一心期和六葉一心期時(shí)噴霧接種，即便農(nóng)桿菌〇D_為0. 1也很容易接種 成功；若在三葉一心期接種，農(nóng)桿菌〇D6(?值需要達(dá)到0. 2以上。考慮到田間生產(chǎn)中的實(shí)際 情況，最佳接種時(shí)期為普通煙四葉一心期到六葉一心期，菌液濃度〇D_值為0. 2-0. 3。
[0041] 實(shí)施例3 :利用農(nóng)桿菌噴霧接種病毒的弱毒疫苗
[0042] 1.病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采取液氮凍融法。
[0043] 從-80°C冰箱中取出一管農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞（100-200 μ 1)，冰上解凍。 解凍后加入100-300ng煙草脈帶花葉病毒弱毒株系DDK質(zhì)粒。放入液氮中冷凍l-5min，取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0044] 加入800 μ 1無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)3h。5000r/min離心收集菌體， 離心管中保留約200 μ 1培養(yǎng)液并重新懸浮菌體。
[0045] 在超凈臺(tái)上將菌體均勻涂布于含抗生素（本實(shí)驗(yàn)中為卡那霉素、利福平霉素和四 環(huán)素）的固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2天，直至出現(xiàn)菌落。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，證明 菌落中含有TVBMV弱毒株系DDK。
[0046] 2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0047] 經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑斑接種于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福平霉素和 5 μ g/ml四環(huán)素的5ml液體LB中。28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
[0048] 將5ml培養(yǎng)后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-嗎啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相應(yīng)抗生素（濃度與上述步驟相同）的LB液體培養(yǎng)基中，于 28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液以10000r/m離心1分鐘，收集菌體后懸浮于農(nóng)桿 菌重懸溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)，調(diào)整濃度使其 0D6QQ 值為 0.2-0. 3,室溫靜置3h。
[0049] 3.接種寄主植物及交叉保護(hù)效果
[0050] 將0D6(?值為0. 2-0. 3、攜帶TVBMV弱毒株系DDK的農(nóng)桿菌菌體懸浮液裝入噴壺 (300ml)，選取五葉一心的普通煙植株，以噴霧器噴嘴距葉片10 - 30cm處均勻噴施。處理 完的植株放置25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16h光照/8h黑暗交替）。15天后摩擦接種TVBMV 強(qiáng)毒株系，攻毒25天后觀察癥狀。
[0051] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種強(qiáng)毒株系25天后，直接接種強(qiáng)毒株系的煙草葉片上表現(xiàn)出嚴(yán)重的 脈帶花葉癥狀，而預(yù)接種弱毒株系DDK后再接種強(qiáng)毒株系的煙草葉片上沒(méi)有明顯癥狀，弱 毒株系對(duì)強(qiáng)毒株系表現(xiàn)出良好的交叉保護(hù)效果（圖5)。說(shuō)明通過(guò)農(nóng)桿菌噴霧接種植物病毒 的弱毒株系用以保護(hù)植物免受強(qiáng)毒株系的危害是可行的。
【權(quán)利要求】
1. 一種優(yōu)化的植物病毒接種方法。其特征在于：將待接種病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 菌，培養(yǎng)后離心收集農(nóng)桿菌菌體，將其稀釋到〇D_為0. 2-0. 3,通過(guò)葉面噴霧在煙草四葉一 心期到六葉一心期接種。
2. 如權(quán)利要求1所述方法，在利用植物弱毒疫苗保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系侵染以及利用 植物病毒載體表達(dá)外源蛋白方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK104152487SQ201410263717
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】李向東, 劉錦, 叢倩倩, 高瑞 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)