家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因的制作方法
【專利摘要】一種家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因，通過(guò)生物信息學(xué)方法在家蠶基因組中鑒定，并經(jīng)克隆得到。該基因在殺蟲(chóng)劑篩選后的家蠶品系中呈高表達(dá)。其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)和CHP(過(guò)氧化氫異丙苯)的活性分別為為5.24μmol/min/mg和0.10μmol/min/mg，且其活性能被有機(jī)磷和菊酯類殺蟲(chóng)劑有效抑制。通過(guò)這一基因靶點(diǎn)，有望設(shè)計(jì)出防治鱗翅目害蟲(chóng)的新型藥物。該發(fā)明在害蟲(chóng)防治和改良家蠶抗藥性品種中有著重要價(jià)值。
【專利說(shuō)明】家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要是鱗翅目害蟲(chóng)防治和家蠶抗藥性品種改良領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase, GSTs, EC 2. 5. 1. 18)是一類 重要的同工酶超家族，廣泛分布于動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌等生物體中，具有對(duì)內(nèi)源和外源性 有毒物質(zhì)解毒的功能。在昆蟲(chóng)體內(nèi)它不但行使對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的 解毒，而且也具有消除昆蟲(chóng)體內(nèi)因殺蟲(chóng)劑等因素引起的的脂質(zhì)過(guò)氧化物，保持體內(nèi)的氧化 與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。
[0003] 殺蟲(chóng)劑在害蟲(chóng)防治中起著非常重要的作用，但是隨著大量農(nóng)藥的使用，昆蟲(chóng)抗藥 性日益加劇，迫使人們加大藥劑的用量，這不但制約了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，也給環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的 負(fù)擔(dān)，影響到了經(jīng)濟(jì)和人類的可持續(xù)性發(fā)展。GSTs作為昆蟲(chóng)重要的解毒酶系，已有少許研究 鑒定了 GSTs基因在殺蟲(chóng)劑抗性中的作用，但因殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)有限嚴(yán)重制約了新型高效殺蟲(chóng) 劑的研發(fā)。家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲(chóng)，而且也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。我們以殺蟲(chóng)劑連續(xù)多 代篩選的家蠶為材料，克隆獲得一個(gè)在篩選品系中高表達(dá)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2 基因。通過(guò)體外表達(dá)的酶活性鑒定，殺蟲(chóng)劑體外抑制酶活性及組織表達(dá)定位等研究，證實(shí)該 基因與家蠶殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)。通過(guò)這一基因靶點(diǎn)，有望設(shè)計(jì)出防治鱗翅目害蟲(chóng)的藥物，并用 于家蠶抗藥性品種的分子改良。因此，在農(nóng)林害蟲(chóng)的防治和品種改良中有著重要的理論和 實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是利用了生物信息學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)方法，證實(shí)了 BmGSTE2具有體外 代謝CDNB (1-氯-2, 4-二硝基苯）和CHP (過(guò)氧化氫異丙苯）的活性，并與殺蟲(chóng)劑相互作用 的功能。目的在于以此為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的殺蟲(chóng)劑藥物及改良家蠶抗藥性品種。
[0005] 本發(fā)明 申請(qǐng)人:用2種殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶分別進(jìn)行多代連續(xù)篩選，獲得耐藥性品系后， 利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)BmGSTe2基因的表達(dá)水平在經(jīng)篩選后的家蠶中顯著提升。通過(guò)對(duì)BmGSTe2 進(jìn)行克隆和異源表達(dá)，獲得BmGSTE2重組蛋白，對(duì)其進(jìn)行酶特性和活性分析；同時(shí)制備了多 克隆抗體，經(jīng)免疫印跡和免疫組化鑒定了 BmGSTE2蛋白的組織表達(dá)和細(xì)胞分布情況。結(jié)果 證實(shí)BmGSTE2的高表達(dá)是增強(qiáng)家蠶耐藥性的原因之一。
[0006] 本發(fā)明的家蠶抗藥性基因 BmGSTe2通過(guò)以下步驟獲得和證實(shí)：
[0007] (l)BmGSTe2與家蠶耐藥性的初步鑒定
[0008] 以甲氰菊酯（fenpropathrin)和辛硫磷（phoxim)分別對(duì)家蠶19-440品系（Ftl)進(jìn) 行4代和5代篩選，并標(biāo)記為F 4和F5品系。經(jīng)篩選后F4對(duì)甲氰菊酯的致死中濃度（LD5tl) 為F tl的4. 2倍，F(xiàn)5對(duì)辛硫磷的LD5tl為Ftl的1. 8倍，表明殺蟲(chóng)劑篩選顯著提高了家蠶耐藥性。 本實(shí)驗(yàn)以添加殺蟲(chóng)劑的桑葉喂食家蠶用于篩選，分離出Ftl, F4和F5品系雌雄個(gè)體的中腸，提 取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA。下載NCBI中其他昆蟲(chóng)GST蛋白序列，與家蠶基因組進(jìn)行同源比 對(duì)，獲得家蠶GST基因序列。并利用RT-PCR方法鑒定家蠶GST家族基因在篩選前后的表達(dá) 變化。結(jié)果表明BmGSTe2的表達(dá)較篩選前有顯著提高（圖1)，暗示BmGSTe2與篩選后家蠶 的耐藥性形成相關(guān)。
[0009] (2)BmGSTe2的克隆與序列分析
[0010] BmGSTe2的克?。禾崛〖倚Q中腸組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以BmGSTe2特異 引物（正向:5' -GGATCCATGTCTATAATTATTTACCAAACAT-3'，反向:5, -GCGGCCGCGACAGGAAAGCA ATTCAATAGTT-3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。膠 回收純化擴(kuò)增獲得的BmGSTe2DNA片段，以NdeI和BamHI雙酶切并回收目的產(chǎn)物，與酶切后 的pET-28a載體經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta (DE3)感受 態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的序列與預(yù) 期的結(jié)果一致。
[0011] 序列分析：克隆獲得的BmGSTe2編碼框長(zhǎng)648bp，共編碼215個(gè)氨基酸。其編碼蛋 白的分子量約為24. 72kDa，等電點(diǎn)為5.98。將BmGSTe2編碼的蛋白與下載自NCBI中其他 昆蟲(chóng)的GST蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)生分析表明BmGSTe2屬于昆蟲(chóng)特異的epsilon家 族。另外，BmGSTe2與鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾中有機(jī)磷抗性基因 PxGST3有著較高的同源性，其 蛋白質(zhì)序列的一致性為46. 4%。
[0012] (3) BmGSTE2外源表達(dá)與純化
[0013] 以0. 5mM異丙基-β -d-硫代半乳糖苷（IPTG)對(duì)重組蛋白進(jìn)行16°C低溫誘導(dǎo)表 達(dá)20h，離心搜集大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)破碎和離心后，分別搜集上清和沉淀物。SDS-PAGE檢測(cè) BmGSTE2蛋白為可溶性表達(dá)。利用通用公司純化系統(tǒng)對(duì)BmGSTE2蛋白分離純化，SDS-PAGE 檢測(cè)純化重組蛋白為單一條帶。純化后的BmGSTE2重組蛋白用于生物特性分析，并免疫小 鼠制備多抗血清。
[0014] (4)BmGSTE2重組蛋白的體外活性鑒定
[0015] 重組BmGSTE2的生物學(xué)特征鑒定：純化的BmGSTE2不僅對(duì)⑶NB底物具有較高生物 學(xué)活性（5.24以111〇1/111；[11/11^)，以0^為底物檢測(cè)出過(guò)氧化物酶活性（0.1(^1]1〇1/111；[11/11^)。 動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，相對(duì)于CHP(Km = L 40)，BmGSTE2對(duì)⑶NB(Km = 0· 41)表現(xiàn)出更高的親和 力。熱穩(wěn)定性檢測(cè)以CDNB和還原型谷胱甘肽（GSH)為底物，表明BmGSTE2在50°C及以下保 持有原活力的90 %以上。
[0016] 殺蟲(chóng)劑對(duì)BmGSTE2酶活性的抑制：通過(guò)向酶活反應(yīng)體系中分別添加不同濃度梯度 的甲氰菊酯，辛硫磷和毒死蝶（chlorpyrifos)，檢測(cè)反應(yīng)體系在340nm下的吸光值變化。結(jié) 果顯示，三種殺蟲(chóng)劑都能有效抑制BmGSTE2活性（圖2)，辛硫磷和毒死蜱兩種有機(jī)磷殺蟲(chóng) 劑對(duì)BmGSTE2的抑制中濃度（IC 5tl)分別為0. 15mM和0. 18mM，對(duì)甲氰菊酯的抑制中濃度為 0. 09mM。表明BmGSTE2與三種殺蟲(chóng)劑均能相互作用，對(duì)菊酯類殺蟲(chóng)劑更加敏感。
[0017] (5) BmGSTE2蛋白的組織表達(dá)與細(xì)胞定位
[0018] BmGSTE2蛋白的組織表達(dá)：實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡法，對(duì)家蠶19-440的中腸，脂肪體， 絲腺和體壁共4個(gè)組織進(jìn)行BmGSTE2蛋白的表達(dá)檢測(cè)。經(jīng)組織勻漿，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜與抗 BmGSTE2的多抗小鼠血清孵育，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠血清孵育，熒光染色，暗 室曝光。結(jié)果顯示BmGSTE2只在家蠶中腸組織中表達(dá)（圖3)。分離F c^F4和F5品系的中腸 組織，利用免疫印跡法對(duì)BmGSTE2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明BmGSTE2的表達(dá)量較對(duì) 照Ftl有顯著升高（圖3)，上調(diào)表達(dá)的BmGSTE2可能通過(guò)解毒代謝或清除脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物來(lái) 提高家蠶的耐藥性。
[0019] BmGSTE2在中腸細(xì)胞的表達(dá)定位：采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)家蠶Ftl品系中腸組 織進(jìn)行石蠟切片，經(jīng)與抗BmGSTE2的多抗小鼠血清孵育，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 鼠血清孵育后，對(duì)切片進(jìn)行DAB染色，于光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)中腸組織細(xì)胞。結(jié)果顯示，中腸 的三種上皮細(xì)胞-杯形細(xì)胞（goblet cells)，圓筒形細(xì)胞（columnar cells)和再生細(xì)胞 (regenerative cells)，均有 BmGSTE2 的表達(dá)。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 通過(guò)對(duì)家蠶進(jìn)行殺蟲(chóng)劑連續(xù)多帶篩選，分別獲得了對(duì)有機(jī)磷和菊酯類有一定耐藥 性的家蠶品系，通過(guò)RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)BmGSTe2基因的表達(dá)水平在篩選品系中顯著提高。 隨后對(duì)其進(jìn)行克隆和序列分析，經(jīng)外源表達(dá)與純化，獲得具有生活活性的BmGSTE2蛋白， 對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)BmGSTE2進(jìn)行了組織表達(dá)和細(xì)胞定位研究，大量結(jié)果顯示 BmGSTE2參與了家蠶耐藥性的形成。鱗翅目昆蟲(chóng)是最主要的農(nóng)林害蟲(chóng)，家蠶作為鱗翅目的模 式生物，從家蠶中獲得與解毒功能相關(guān)的信息，尤其是對(duì)GSTs的研究，有望設(shè)計(jì)出防治鱗 翅目害蟲(chóng)的藥物。該發(fā)明在害蟲(chóng)防治和改良家蠶抗藥性品種中有著重要應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為BmGSTe2基因在殺蟲(chóng)劑篩選前后的家蠶中腸中的表達(dá)水平。Ftl :篩選前的 19-440品系；F4 :19-440經(jīng)甲氛菊醋篩選4代的品系，F(xiàn)5 :19-440經(jīng)半硫憐篩選5代的品系。 柱狀圖為定量PCR結(jié)果，下部電泳圖為半定量PCR結(jié)果。
[0023] 圖2為殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶BmGSTE2蛋白活性的抑制作用。
[0024] 圖3為BmGSTE2蛋白的組織表達(dá)與細(xì)胞定位。其中A、B為western blot結(jié)果，A 顯示BmGSTE2在家蠶不同組織中的表達(dá)情況，B顯示在經(jīng)篩選后的F4, F5和對(duì)照Ftl中腸組 織中，BmGSTE2的表達(dá)差異情況，A、B均以a -Tubulin作為內(nèi)參；C、D為Ftl中腸組織免疫組 化的結(jié)果，C顯示用抗BmGSTE2的小鼠血清孵育的陽(yáng)性中腸切片，D顯示用對(duì)照小鼠血清孵 育的陰性中腸切片。 具體實(shí)施方案
[0025] 實(shí)施例1:
[0026] 家蠶BmGSTe2的克隆和表達(dá)：用Trizol試劑（Invitrogen, USA)從家蠶的中腸組 織中提取家蠶總RNA，樣品中的殘留DNA用DNaseI進(jìn)行消化，分光光度法測(cè)定RNA濃度。 cDNA第一鏈通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA)獲得，反轉(zhuǎn)錄 的cDNA稀釋5倍并保存于-20°C備用。利用生物信息學(xué)分析獲得的BmGSTe2完整編碼區(qū) 序列設(shè)計(jì)特異引物（正向:5' -GGATCCATGTCTATAATTATTTACCAAACAT-3'，反向:5, -GCGGCCGC GACAGGAAAGCAATTCAATAGTT-3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)）。以 cDNA為模版，用上述引物對(duì)BmGSTe2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性 30s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，以上3個(gè)步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)；最后72°C終延伸10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。
[0027] BmGSTe2擴(kuò)增產(chǎn)物與pET_28a載體分別以NdeI和BamHI雙酶切，回收目的產(chǎn)物， 用T4連接酶連接構(gòu)建重組載體，再通過(guò)42°C熱激法，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果 表明擴(kuò)增的序列與預(yù)期的結(jié)果一致。然后對(duì)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)培，并通過(guò)添加 0. 5mM異丙基-β -d-硫代半乳糖苷（IPTG)對(duì)重組蛋白BmGSTE2進(jìn)行16°C低溫誘導(dǎo)表達(dá) 20h。離心搜集大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)破碎和離心后，分別搜集上清和沉淀物。SDS-PAGE檢測(cè) BmGSTE2重組蛋白以包涵體或可溶性形式表達(dá)。
[0028] 實(shí)施例2:
[0029] 殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶BmGSTE2蛋白酶活性的抑制：選用3種殺蟲(chóng)劑甲氰菊酯 fenpropathrin (擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑）、辛硫磷phoxim (有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑）、毒死蝶 chlorpyrifos (有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑），來(lái)評(píng)價(jià)它們對(duì)純化重組蛋白BmGSTE2的抑制作用。抑制 劑先用無(wú)水乙醇稀釋至禮級(jí)別，然后以此為母液用無(wú)水乙醇分別稀釋成相應(yīng)梯度濃度的 抑制劑工作液，而最終測(cè)定的抑制劑濃度以各工作液在200 μ L酶反應(yīng)體系中稀釋后的濃 度為計(jì)算（在200 μ L待測(cè)體系均添加了 4 μ L的抑制劑工作液，這樣保證了乙醇在最終酶 反應(yīng)體系內(nèi)的最高濃度不超過(guò)2 % )。每個(gè)抑制劑測(cè)定至少重復(fù)3次，具體測(cè)定步驟以甲氰 菊酯為例，如表1 :
[0030] 表1甲氰菊酯對(duì)重組BmGSTE2蛋白酶抑制作用的測(cè)定步驟
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 具有殺蟲(chóng)劑抗藥性的BmGSTe2基因，其特征在于該基因是家蠶來(lái)源的，序列組成如 SEQ ID NO :1 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1，其中所說(shuō)的家蠶是家蠶19-440品系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中的抗藥性基因 BmGSTe2在殺蟲(chóng)劑研發(fā)和害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK104293807SQ201410467980
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】余泉友, 周磊, 張澤 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)