一種過表達gma-miR156b培育高產(chǎn)株型植物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用gma-miR156b及其前體基因培育高產(chǎn)植物的方法,首先構(gòu)建含有SEQ ID NO:2所示microRNA前體序列的重組表達載體,然后利用此重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體,再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物,篩選得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。通過在大豆植株中過表達上述microRNA,可以顯著增加大豆的分枝數(shù),由平均的2個分枝增加到8個分枝,轉(zhuǎn)基因大豆的單株莢數(shù)也增加了59%,單株莢粒數(shù)也增加了2-3倍。通過在小麥植株中過表達上述microRNA,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥的分蘗數(shù)由平均的3.3個分蘗增加到4.4個,小麥穗長、穗粒數(shù)、單穗平均粒重均顯著增加。
【專利說明】-種過表達gma-miR156b培育高產(chǎn)株型植物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物中與株型和產(chǎn)量相關(guān)的microRNA,特別涉及來源于大豆的與 株型發(fā)育相關(guān)的gma-miR156b及其在培育高產(chǎn)大豆及小麥新品種方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆和小麥是非常重要的、具有特殊經(jīng)濟價值的作物。株型是大豆和小麥植株整 體特征的集中表現(xiàn),在大豆和小麥高產(chǎn)育種中發(fā)揮著非常重要的作用。大豆和小麥株型包 括株高、節(jié)數(shù)、莖粗的動態(tài)變化、分枝/分蘗數(shù)、分枝長度和角度等植株形態(tài)特征。在生產(chǎn) 中大豆和小麥的抗倒伏能力是其廣適性栽培及其在不同環(huán)境條件下高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要條件 (Mancuso and Caviness, 1991)。具有理想株型的大豆和小麥品種具有更好的抗倒伏能力。
[0003] miRNA是近年來在生物體中發(fā)現(xiàn)的一類長度約為20-24nt非編碼的小分子RNA,通 過序列互補與特定靶基因的mRNA結(jié)合,因引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯而調(diào)控一些重要 生理過程,被認為是植物重要性狀分子調(diào)控的關(guān)鍵或主控調(diào)節(jié)元件(Master regulators), 已經(jīng)成為世界生物科學(xué)研究的熱點和前沿。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用gma-miR156b及其前體基因培育多分 枝、多莢、多籽粒高產(chǎn)植物的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0006] 序列表中SEQ ID N0 :1所示gma-miR156b的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽 粒株型植物中的應(yīng)用。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案,在植物中過表達SEQ ID N0 :1所示的 gma-miR156b,培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉(zhuǎn)基因植物。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案,首先構(gòu)建含有g(shù)ma_miR156b前體序列的重組表 達載體,然后利用此重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體,再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物,篩選得到與 正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物;所述gma-miR156b前體序列如 SEQ ID N0 :2 所示。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案,構(gòu)建含有SEQ ID N0 :2所不多核苷酸序列的重 組表達載體的步驟為:
[0010] 1)、首先以植物葉片DNA為模板,擴增獲得SEQ ID N0 :2所示多核苷酸序列并連接 至T載體上,然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質(zhì)粒,回收酶切產(chǎn)物;
[0011] 2)、然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD,回收載體骨架;
[0012] 3)、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的載體骨架連接;
[0013] 4)、將步驟3)的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株,37 °C過夜培養(yǎng),挑 取陽性克隆進行測序驗證,得重組表達載體PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案,采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105得轉(zhuǎn)化體, 具體操作步驟包括:
[0015] a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞,融化后加入5-10 μ 1重組表達載體的質(zhì) 粒DNA,輕彈管壁混勻,冰上放20-30min ;
[0016] b.放入液氮中5min后取出,將管轉(zhuǎn)入37°C、5min融化后,加入800μ 1YEP液體培 養(yǎng)基,28°C低速振蕩、150rpm,4-5h ;
[0017] d. 10000rpm,30sec,去上清,加100μ 1YEP液體培養(yǎng)基,懸浮菌體后涂板;
[0018] e.置于28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長出,挑取陽性單克隆搖菌,用于植株子葉節(jié)轉(zhuǎn) 化。
[0019] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案,所述目的植物為大豆或小麥。
[0020] 本發(fā)明還包括gma-miR156b的前體序列,其具有SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列, 在植物細胞內(nèi)被剪切并表達得到對應(yīng)的microRNA。
[0021] 本發(fā)明還包括含有g(shù)ma_miR156b前體序列的重組表達載體。
[0022] 本發(fā)明還包括含有g(shù)ma_miR156b前體序列的轉(zhuǎn)化體。
[0023] 本發(fā)明還包括擴增gma_miR156b前體序列的引物對,其核苷酸序列如SEQ ID N0 : 3 和 SEQ ID NO :4 所示。
[0024] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于: 申請人:的系列實驗證明,通過在大豆 植株中過表達gma-miR156b,可以顯著增加大豆的分枝數(shù),由平均的2個分枝增加到8個分 枝;此外,轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59%,更重要的是,單株莢粒數(shù)也增加了 2-3倍; 最終大幅度的提1? 了大?的廣量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1為實施例1的試驗結(jié)果,顯示gma_miR156b在大豆不同組織中的表達模式,可 見其在大豆葉片中的表達水平較高。
[0026] 圖2為gma-miR156b過表達轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定(實施例2步驟5),對PCR鑒 定純合的株系(圖2A)進行了草丁膦涂抹(圖2B)及Bar試紙條(圖2C)的分析;從圖中 可見,PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株也呈現(xiàn)了對草丁膦的抗性,說明Bar基因正常表達,其蛋白具 有膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0027] 圖3為gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因大豆植株當中的分子鑒定及過表達植株的農(nóng)藝性 狀分析(實施例2步驟6);結(jié)果顯示,在純合轉(zhuǎn)基因株系中目的基因 gma-miR156b的表 達水平和野生型中的表達相比有明顯提高(圖3A);過表達gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同 對照野生型W82相比,株高沒有顯著變化(圖3C),但株型發(fā)生顯著變化(圖3B);過表達 gma-miR156b可以顯著增加大豆的分枝數(shù),由平均的2個分枝增加到8個分枝(圖3D);此 夕卜,過表達gma-miR156b轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59% (圖3E);更重要的是,單株 莢粒數(shù)也增加了 2-3倍(圖3F)。
[0028] 圖4為實施例3步驟5-1中Bar基因的檢測結(jié)果,通過PCR方法鑒定出156b-2_3 和156b-5-8兩個獨立來源的陽性轉(zhuǎn)基因小麥株系。
[0029] 圖5為gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因小麥植株當中的分子鑒定及過表達植株的農(nóng)藝性狀 分析;圖5-A、B顯示實施例3步驟5-2中轉(zhuǎn)基因小麥植株同對照野生型科農(nóng)199相比,穗 長顯著升高;圖5-C顯示轉(zhuǎn)基因小麥植株同對照野生型相比,分蘗數(shù)由平均的3. 3個增加到 4. 4個;圖5-D顯示轉(zhuǎn)基因小麥植株同對照野生型相比,穗粒數(shù)顯著增加;圖5-E顯示轉(zhuǎn)基 因小麥植株同對照野生型相比,單穗平均粒重顯著增加。
【具體實施方式】
[0030] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自 常規(guī)生化試劑公司購買得到的。下述實施例中的%,如無特殊說明,均為質(zhì)量百分含量。以 下實施例中的定量試驗,均設(shè)置三次重復(fù)實驗,結(jié)果取平均值。
[0031] 實施例lgma_miR156b在大豆中的的表達模式分析
[0032] 通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析gma_miR156b在大豆葉、莖、根及根瘤中的表達特 性,同時檢測gma-miR156b在轉(zhuǎn)基因植株中的表達特性。
[0033] (1)材料獲取:實驗所用材料為Wilimas82(威廉姆斯82,下文簡稱W82),材料按 照以下流程進行處理:大豆種子用70 %的酒精滅菌30S,播種于低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石珍 珠巖(3:1)混合基質(zhì)中,于培養(yǎng)室中培養(yǎng),16h光/8h暗,光強7000LUX,溫度26°C,相對濕 度為70 %。播種后7天,每株接種慢生型根瘤菌USDA110菌液(0D_ :0.08) 30ml,在接菌后 28天時取大豆葉、莖、根及根瘤;
[0034] (2)大豆不同組織中RNA的分離:取上步所得的大豆不同組織,提取RNA,具體提取 方法如下:
[0035] ①用液氮在研缽中將材料充分研磨,將50mg-100mg研磨好的粉末放入1. 5ml離心 管中,加入lmL Redzol試劑(Vigorous公司),冰上放置lOmin ;
[0036] ②加入200 μ 1氯仿,200 μ 1 RNA-free NaAC,振蕩均勻后室溫靜置2-3min ;
[0037] ③ 4。(:,12, 000g 離心 lOmin ;
[0038] ④將上清移入另外一個離心管中,加入等體積的異丙醇,振蕩混勻,-20°C沉淀 30min ;
[0039] ⑤ 4。(:,12, 000g 離心 lOmin ;
[0040] ⑥棄上清,用75%的乙醇(DEPC處理過的無菌水配制)洗1-2次;
[0041] ⑦小心去上清(盡力吸干),室溫靜置使RNA干燥;
[0042] ⑧加適量DEPC處理水溶解RNA ;
[0043] ⑨電泳檢測RNA完整性。
[0044] (3)反轉(zhuǎn)錄 PCR :使用 TIANGEN 公司出品的 FastQuant RT Kit (With gDNase)試 劑盒(目錄號:KR106)對上步所得大豆組織的RNA進行反轉(zhuǎn)錄克?。?br>
[0045] ①首先將總RNA末端進行g(shù)DNA去除處理,在10 μ 1體系中加入總RNA 5yl5XgDNA Buffer 2yl,RNase-Free ddH20 3 μ1,徹底混勻上述配制的反應(yīng)液,短暫離 心后,42°C反應(yīng)3min,放置于冰上;
[0046] ②然后配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:10XFast RT Buffer 2 μ 1,RT Enzyme Mix lul,miR156b RT Primer(SEQ ID NO :5) 1 μ 1, miR1515a RT Primer 1 μ 1, RNase-Free ddH205 μ 1 ;
[0047] ③將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的mix加到gDNA去除步驟(步驟①)的反應(yīng)液中,充分混勻; 42°C,孵育15min ;95°C,孵育3min之后放于冰上,得到的cDNA可以直接進行下游熒光定量 檢測,或-20°C低溫保存。
[0048] (4)實時熒光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex Tag?進行 定量PCR分析;
[0049] ①在20 μ 1體系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBR Primix Ex taq?(2X) 10 μ 1, ROX Reference Dye II (50X)0. 4 μ 1, ddH206. 8 μ 1 ;
[0050] ②擴增程序為:95 °C 30s ;95 °C 5s,60 °C 34s,45cycles ;95 °C 15s,60 °C lmin, 95 °C 15s ;其中,正向引物為:GGACCTGACAGAAGAGAGAG(SEQ ID NO :6);反向引物為: GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO :7);
[0051] (5)結(jié)果:gma_miR156b在大豆不同組織中的表達模式如圖1所示,結(jié)果顯示 gma-miR156b在大豆葉片中的表達水平較高。
[0052] 實施例2、理想高產(chǎn)株型大豆的培育
[0053] 1、Wi 1 imas82 大豆 DNA 的提取
[0054] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨,將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中;加入 500μLCTAB提取液(100mM,Tris-HCl(pH8·0),4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA(pH8·0),2% CTAB,使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇),混勻;
[0055] b. 65°C水浴30min,中間輕微振蕩幾次;
[0056] c.置于冰上 5min ;
[0057] d.加等體積的氯仿:異戊醇(24:1),輕輕混勻;
[0058] e.室溫,靜置lOmin,12000rpm冷凍離心15min,取上清;
[0059] f.加 2倍體積冰乙醇,混勻,_20°C靜置30min ;
[0060] g.離心,排出上清液;
[0061] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次,晾干;
[0062] I.無菌水100 μ 1溶解,_20°C冰箱長期保存。
[0063] 2、構(gòu)建重組表達載體
[0064] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0065] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID NO :2),根據(jù)該序列設(shè)計引物對,根據(jù)載 體pEGAD多克隆位點,引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識別位點,以大豆品種W82 的DNA為模板進行PCR,擴增gma-miR156b的前體序列;引物序列為:
[0066] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'(SEQ ID NO :3)
[0067] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'(SEQ ID NO :4)
[0068] 擴增程序為:95°C 5 分鐘;95°C 30 秒,57°C 30 秒,72°C 40 秒,26 個循環(huán);72°C 30 秒;
[0069] PCR擴增產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳,采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶;
[0070] 回收的DNA片段與pMD19_T載體(Takara公司)連接,10 μ 1體系中加入T vector lyl,solution I 5μ1,回收片段4μ1,混勻混合液,16°C連接過夜,熱擊法轉(zhuǎn)入E.coli 大腸桿菌感受態(tài)細胞,過夜培養(yǎng),挑陽性克隆,送交invitrogen公司測序。
[0071] (2)重組表達載體的構(gòu)建
[0072] 1)、提取含有正確測序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切 酶Age I和BamH I酶切,回收酶切產(chǎn)物;
[0073] 2)、用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD,回收載體骨架;
[0074] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接;
[0075] 4)、將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株,37°C過夜培養(yǎng),挑 取陽性克隆進行測序;測序結(jié)果表明,得到了重組質(zhì)粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0076] 3.農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化
[0077] 采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,具體操作如下:
[0078] a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)細胞,融化后加入5-10 μ 1質(zhì)粒DNA,輕彈管壁混勻, 冰上放20-30min ;
[0079] b.放入液氮中5min后取出,將管轉(zhuǎn)入37°C (5min)融化后,加入800μ 1YEP (無抗 性)液體培養(yǎng)基,28°C低速振蕩(150rpm)4-5h;
[0080] cL 10000rpm,30sec,去上清,加 ΙΟΟμΙΥΕΡ液體培養(yǎng)基,懸浮菌體后涂板(含 50mg/ml卡那霉素);
[0081] e.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長出,挑取陽性單克隆搖菌,用于大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化;
[0082] 4.農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化
[0083] ①以大豆品種W82為材料,取種子材料用氯氣消毒10小時;
[0084] ②在B5培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:2 %蔗糖,0· 8 %瓊脂粉(sigma),1 XGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories,貨號:G398),pH調(diào)至 5. 7 左右;)上萌發(fā) 5 天, 用手術(shù)刀先將大豆帶2cm胚軸切下,放入培養(yǎng)皿中,然后沿著子葉下軸垂直將其切開,留取 下胚軸2mm左右,除去仍然連接在子葉上的胚軸組織;在子葉和子葉下胚軸的連接處的軸 向上作5-7個切口,在活化的農(nóng)桿菌EHA105中侵染30min (0D6QQ :0. 8左右);
[0085] ③將外植體轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:2 %蔗糖,0. 8 %瓊脂粉 (sigma),1. 67mg/L 6-BA, 0. 25mg/L GA3, 0. 1XGAMB0RG B-5 BASAL(Phyto Technology Laboratories,貨號:G398, pH調(diào)至5. 4左右;)上共培生長3天后,再轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上誘導(dǎo)叢生芽(培養(yǎng)基配方:2%蔗糖,0.8%瓊脂粉(以 81^),1.671^/16-84,1〇11^/1 glufosinate,lXGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories,貨號:G398),pH調(diào) 至5· 7左右);
[0086] ④在誘導(dǎo)叢生芽后2周,取已生成的分生組織,在生長點的基部作新的切口(水 平方向的),并將培養(yǎng)組織移入伸長培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:2%蔗糖,0. 8%瓊脂粉(sigma), 0. lmg/L IAA, lmg/L Zeatin, 0. 5mg/L GA3, l〇mg/L glufosinate, 1 XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS (Phyto Technology Laboratories,貨號:M404),pH 調(diào)至 5. 7 左右);
[0087] ⑤每兩周將培養(yǎng)物向新的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移一次;每次轉(zhuǎn)移時在外植體的基部作一個 新的水平切口;
[0088] ⑥在6-8周培養(yǎng)以后,將伸長的芽(一般剪取芽長> 4cm)在lmg/ml IBA中蘸 根后移入生根培養(yǎng)基上生根(培養(yǎng)基配方:2%蔗糖,0.8%瓊脂粉(sigma),0.5XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories,貨號:M404), pH調(diào)至5. 7左右));培養(yǎng)大約2-4周,長出足量的根系時,進行移栽;
[0089] ⑦將生根的小苗小心移入小花盆中,花盆里放入(進口土:營養(yǎng)土 = 1 :1)培養(yǎng) 土;移栽后需套保鮮袋一周,使苗習(xí)慣于土壤的新環(huán)境并保持濕度,培養(yǎng)間的溫度于26°C, 一周后取下保鮮袋;
[0090] ⑧待轉(zhuǎn)基因苗恢復(fù)生長后用Bar基因檢測、草丁膦glufosinate(SIGMA,45520)涂 抹葉片以及Bar試紙條(ENVIR0L0GIX,042043)三種方法進行轉(zhuǎn)化鑒定,收獲Bar基因陽性 轉(zhuǎn)基因株系,在T1、T2代的陽性植株及T3代的純合轉(zhuǎn)基因株系進行目的基因的表達分析以 及表型的鑒定。
[0091] 5.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
[0092] 對Τ1和Τ2代陽性的植株后代進行了較為系統(tǒng)的選擇Bar基因表達及基因產(chǎn)物功 能的鑒定。其中包括純合株系PCR鑒定Bar基因、葉片涂抹草丁膦及Bar試紙條的分析。
[0093] 1)PCR檢測反應(yīng)法:提取大豆基因組DNA用于PCR檢測。檢測Bar基因是 否轉(zhuǎn)入大豆基因組中。Bar 基因引物:F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID N0:8), R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID N0:9)。大豆葉片 DNA 提取方法如下:
[0094] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨,將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中;加入 650mLCTAB提取液(100mM,Tris-HCl(pH8·0),4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA(pH8·0),2% CTAB,使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇),混勻;
[0095] b. 65°C水浴30min,中間輕微振蕩幾次;
[0096] c.置于冰上 5min ;
[0097] d.加等體積的氯仿:異戊醇(24:1),輕輕混勻;
[0098] e.室溫,靜置lOmin,12000rpm冷凍離心15min,取上清;
[0099] f.加 2倍體積冰乙醇,混勻,-20°C靜置30min ;
[0100] g.離心,排出上清液;
[0101] h. 70%乙醇lmL漂洗2次,晾干;
[0102] 無菌水100 μ 1溶解,_20°C冰箱長期保存。
[0103] 2)除草劑涂抹法:將Basta原液稀釋為濃度130mg/L,在大豆第一對三出復(fù)葉完 全展開時,以主葉脈為分界線,用記號筆標記半片葉子,然后用棉簽蘸取草丁膦液體擦拭已 標記的半片葉子,5天后觀察葉片對除草劑的反應(yīng)。如為陽性植株則除草劑涂抹過的葉片 與未涂抹的葉片相比沒有太大變化,如為陰性植株則涂抹過除草劑的葉片明顯變黃甚至枯 萎。
[0104] 3) Bar試紙條快速鑒定法:取少許葉片放入1. 5mL離心管中,用研磨棒研碎葉片, 加入300μ L提取液,攪拌均勻,將試紙條按規(guī)定的方向插入混合液中,5min后觀察結(jié)果。試 紙條出現(xiàn)2條帶就表明該植株是陽性植株,出現(xiàn)1條說明是陰性植株。
[0105] 6.結(jié)果觀察
[0106] l)Bar基因檢測結(jié)果:對T1和T2代陽性的植株后代進行了較為系統(tǒng)的選擇Bar 基因表達及基因產(chǎn)物功能的鑒定。其中對PCR鑒定純合的株系(圖2A)進行了草丁膦涂抹 (圖2B)及Bar試紙條(圖2C)的分析。從圖中可見,PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株也呈現(xiàn)了對草 丁膦的抗性,說明Bar基因正常表達,其蛋白具有膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0107] 2) gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因植株當中的分子鑒定及農(nóng)藝性狀分析:由于 gma-miR156b是和Bar基因共轉(zhuǎn)化的,因此,對上述Bar基因純合株系隨后進行了 gma_miR156b的表達分析。如圖3所不,在純合轉(zhuǎn)基因株系中目的基因 gma_miR156b的表 達水平和野生型中的表達相比有明顯提高(圖3A)。并對這些轉(zhuǎn)基因植株的生長習(xí)性、株 型特點等農(nóng)藝性狀進行了跟蹤觀察。發(fā)現(xiàn)過表達gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同對照野生型 W82相比,株高沒有顯著變化(圖3C)但株型發(fā)生顯著變化(圖3B)。過表達gma-miR156b 可以顯著增加大豆的分枝數(shù),由平均的2個分枝增加到8個分枝(圖3D);此外,過表達 gma-miR156b轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59% (圖3E);更重要的是,單株莢粒數(shù)也增 加了 2-3倍(圖3F),從而大幅度的提高了大豆的產(chǎn)量。因此,gma-miR156b是決定大豆理 想株型和高產(chǎn)的重要的基因。
[0108] 實施例3、理想高產(chǎn)株型小麥的培育
[0109] 1、大豆DNA的提取
[0110] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨,將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中;加入 500yL CTAB 提取液(100mM,Tris-HCl(pH8.0),4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA(pH8.0),3% CTAB,使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇),混勻;
[0111] b. 65°C水浴30min,中間輕微振蕩幾次;
[0112] c.置于冰上 5min;
[0113] d.加等體積的氯仿:異戊醇(24:1),輕輕混勻;
[0114] e.室溫,靜置lOmin,12000rpm冷凍離心15min,取上清;
[0115] f.加2倍體積冰乙醇,混勻,-20°C靜置30min ;
[0116] g.離心,排出上清液;
[0117] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次,晾干;
[0118] I.無菌水100 μ 1溶解,-20°C冰箱長期保存。
[0119] 2、構(gòu)建重組表達載體
[0120] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0121] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID N0:2),根據(jù)該序列設(shè)計引物對,根據(jù)載 體pEGAD多克隆位點,引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識別位點,以大豆品種W82 的DNA為模板進行PCR,擴增gma-miR156b前體的編碼基因;引物序列為:
[0122] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'(SEQ ID NO :3)
[0123] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'(SEQ ID NO :4)
[0124] 擴增程序為:95°C 5 分鐘;95°C 30 秒,57°C 30 秒,72°C 40 秒,26 個循環(huán);72°C 30 秒;
[0125] PCR擴增產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳,采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶;
[0126] 回收的DNA片段與pMD19_T載體(Takara公司)連接,10 μ 1體系中加入T vector lyl,solution I 5μ1,回收片段4μ1,混勻混合液,16°C連接過夜,熱擊法轉(zhuǎn)入E.coli 大腸桿菌感受態(tài)細胞,過夜培養(yǎng),挑陽性克隆,送交invitrogen公司測序。
[0127] (2)重組表達載體的構(gòu)建
[0128] 1)、提取含有正確測序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切 酶Age I和BamH I酶切,回收酶切產(chǎn)物;
[0129] 2)、用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD,回收載體骨架;
[0130] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接;
[0131] 4)、將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a菌株,37°C過夜培養(yǎng),挑 取陽性克隆進行測序;測序結(jié)果表明,得到了重組質(zhì)粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0132] 3.小麥成熟胚基因槍遺傳轉(zhuǎn)化
[0133] 1)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo):
[0134] 小麥品種科農(nóng)199種子用70%的酒精消毒5min,然后用0. 1 %的升萊浸泡種子 13min,無菌水沖洗5次;然后將小麥種子置于10mg/L的噻二唑苯基脲(TDZ)溶液中在25°C 室溫條件下處理15h ;剝?nèi)〕墒炫?,接種于成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織;小 麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基(Phyto Technology Laboratories,貨號: G398)為基準,添加如下物質(zhì):2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) :2. 0mg/L,鹽酸硫胺素(VB1): 8. 0mg/L,水解酪蛋白:500mg/L,L-天門冬酰胺:250mg/L,L-谷氨酰胺:200mg/L ;鹿糖: 15g/L,麥芽糖:15g/L,瓊脂:5g/L ;pH = 5. 7 ;小麥成熟胚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后陸續(xù)產(chǎn)生成 熟胚愈傷組織,挑選誘導(dǎo)兩周質(zhì)地致密的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中,于20°C黑 暗條件培養(yǎng)6h ;高滲培養(yǎng)基配方為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再附加0. 2mol/ L的甘露醇和0· 2mol/L的山梨醇;
[0135] 2)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化:
[0136] 經(jīng)高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進行轟擊轉(zhuǎn)化,基因 槍轟擊參數(shù)為:金粉直徑1. 〇 μ m,阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為9. 0cm,可裂膜壓力為 llOOPa,每槍金粉 /pEGAD-35S: :gma-miR156b 用量為 0. 5μ g/30y g,每皿材料轟擊 1 次;
[0137] 3)恢復(fù)培養(yǎng):
[0138] 基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)18h后,將愈傷組織 從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中,于26°C暗培養(yǎng)兩周;小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基 以通用MS培養(yǎng)基為基準,添加以下物質(zhì):2,4_二氯苯氧乙酸(2,4-D) :1.5mg/L,6-呋喃 基氨基嘌呤(KT) :0. 5mg/L,水解酪蛋白:500mg/L,L-天門冬酰胺:250mg/L,L-谷氨酰胺: 200mg/L,鹽酸硫胺素(VB1) :8. 0mg/L,蔗糖:15g/L,麥芽糖:15g/L,瓊脂:5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0139] 4)分化培養(yǎng):
[0140] 恢復(fù)及篩選培養(yǎng)后的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng);培養(yǎng)溫 度為25?28°C,分化培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準,添加以下物質(zhì):6_呋喃基氨基嘌呤 (KT) :2.0mg/L,α-萘乙酸(NAA) :0.01mg/L,酪蛋白:500mg/L,生物素:0.5mg/L,鹽酸硫胺 素(VB1) :8. 0mg/L,蔗糖:15g/L,麥芽糖:15g/L,瓊脂:5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0141] 5)生根培養(yǎng):
[0142] 待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2?3片葉時轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上,于25°C、 3000Lux光照條件下進行生根培養(yǎng);生根培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準,且將MS通用培養(yǎng) 的無機鹽濃度降低一半,其中添加 ct 一奈乙酸(NAA)0. 5mg/L,鹿糖:30g/L,瓊脂:5g/L ;pH =5.7 ;待轉(zhuǎn)基因苗恢復(fù)生長后用Bar基因檢測,收獲Bar基因陽性轉(zhuǎn)基因株系,在ΤΙ、T2 代的陽性植株及Τ3代的純合轉(zhuǎn)基因株系進行目的基因的表達分析以及表型的鑒定。
[0143] 4.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
[0144] 對Τ1和Τ2代陽性的植株后代采用PCR方法進行了 Bar基因的鑒定。
[0145] PCR檢測反應(yīng)法:提取小麥基因組DNA用于PCR檢測。檢測Bar基因是否 轉(zhuǎn)入小麥基因組中。Bar 基因引物:F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID NO :8), R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID NO :9)〇
[0146] 5.結(jié)果觀察
[0147] l)Bar基因檢測結(jié)果:對T2代陽性的植株進行了 Bar基因鑒定。如(圖4)顯示, 通過PCR方法鑒定出156b-2-3和156b-5-8兩個獨立來源的陽性轉(zhuǎn)基因小麥株系。
[0148] 2)gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因小麥中的農(nóng)藝性狀分析:對這些轉(zhuǎn)基因植株的生長習(xí) 性、穗型特點等農(nóng)藝性狀進行了跟蹤觀察。發(fā)現(xiàn)過表達gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同對照 品種科農(nóng)199相比,穗長顯著增加(圖5A, 5B)。過表達gma-miR156b可以顯著增加轉(zhuǎn)基因 小麥的分蘗數(shù),由平均的3. 3個分蘗增加到4. 4個分蘗(圖5C);此外,過表達gma-miR156b 轉(zhuǎn)基因植株的穗粒數(shù)也顯著增加(圖;更重要的是,單穗平均粒重也顯著增加(圖5E), 從而大幅度的提高了小麥的產(chǎn)量。因此,gma-miR156b是決定小麥分蘗和高產(chǎn)的重要的基 因。
[0149] 上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出,不作為對其技術(shù)方案本身的單一 限制條件,例如:含有本發(fā)明miRNA的前體序列,成熟miRNA序列的表達載體及序列本身,擴 增所需引物,轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1. 序列表中SEQ ID NO :1所示microRNA的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽粒株 型植物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于:在植物中過表達SEQ ID NO :1所示的 microRNA,培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉(zhuǎn)基因植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于:首先構(gòu)建含有所述microRNA前體序列的 重組表達載體,然后利用此重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體,再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物,篩選 得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物;所述microRNA的前體 序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于:構(gòu)建含有SEQ ID NO :2所示多核苷酸序 列的重組表達載體的步驟為: 1) 、首先以植物葉片DNA為模板,擴增獲得SEQ ID NO :2所示多核苷酸序列并連接至T 載體上,然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質(zhì)粒,回收酶切產(chǎn)物; 2) 、然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD,回收載體骨架; 3) 、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的載體骨架連接; 4) 、將步驟3)的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株,37 °C過夜培養(yǎng),挑取陽 性克隆進行測序驗證,得重組表達載體pEGAD-35S: : gma-miR156b。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于:采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105得轉(zhuǎn) 化體,具體操作步驟包括: a. 取出凍存的200 μ 1感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞,融化后加入5-10 μ 1重組表達載體的質(zhì)粒 DNA,輕彈管壁混勻,冰上放20-30min ; b. 放入液氮中5min后取出,將管轉(zhuǎn)入37°C、5min融化后,加入800 μ 1YEP液體培養(yǎng)基, 28°C 低速振蕩、150rpm,4-5h ; d. 10000rpm,30sec,去上清,加100μ 1YEP液體培養(yǎng)基,懸浮菌體后涂板; e. 置于28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長出,挑取陽性單克隆搖菌,用于植株子葉節(jié)轉(zhuǎn)化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的應(yīng)用,其特征在于:所述目的植物為大豆或小麥。
7. 權(quán)利要求1所述microRNA的前體序列,其具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列,在 植物細胞內(nèi)被剪切并表達得到對應(yīng)的microRNA。
8. 含有權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的重組表達載體。
9. 含有權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的轉(zhuǎn)化體
10. 擴增權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的引物對,其核苷酸序列如SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 所示。
【文檔編號】A01H5/00GK104232682SQ201410478207
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】李霞, 王幼寧, 紀洪濤, 姜瓊, 趙芳, 石磊, 杜琳倩 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所