一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗的制作方法
【專利摘要】一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，以臺灣肖楠幼嫩葉片作為外植體，接種到過渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取好的外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用愈傷組織再分化出叢生芽，將叢生芽在生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對植物生長調(diào)節(jié)劑搭配比例、篩選出臺灣肖楠無菌苗的植物生長調(diào)節(jié)劑和天然植物添加劑的搭配配方，進行臺灣肖楠幼嫩葉片無性快繁。獲得大量的無菌苗，保持優(yōu)良的遺傳性狀，具有重要意義。比種子播種，常規(guī)無性繁殖，極大提高了臺灣肖楠種苗的繁殖系數(shù)。有利于園林綠化、退耕還林、植樹造林。
【專利說明】一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及植物的無性組織培養(yǎng)，尤其涉及臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗。

【背景技術(shù)】
[0002]臺灣肖楠(Calocedrusformosana (Florin) Florin)又稱肖楠、黃肉仔、黃肉樹，柏科肖楠屬常綠大喬木，為臺灣特有裸子植物，分部于臺灣北部及中部海拔300?1900米的山地，為臺灣暖帶林(50(Tl800m)的主要造林樹種。是臺灣針葉樹五木之一。臺灣肖楠樹形為直干長圓錐狀，樹皮紅褐色，刀切后會流出淡紅色樹脂。材質(zhì)綿密，不易受白蟻蛀蝕，色澤偏黃褐色，為高級木材。與臺灣扁柏、紅檜、香杉、臺灣杉等同列臺灣針葉五木。雌雄同珠，球果木質(zhì)化，為長橢圓形，種子有兩翅。葉為鱗片狀，細小但比扁柏細長。由于過去的大力采伐天然林，致使臺灣肖楠天然族群量極稀少，且族群有高齡化傾向。
[0003]經(jīng)查閱相關(guān)文獻表明臺灣肖楠母樹稀少，結(jié)實不佳，扦插繁殖成活率不高，且生長緩慢。(鐘鎮(zhèn)德，2000)以不同的育林作業(yè)方式，對臺灣肖楠開花結(jié)實的影響研究表明，以斷根、修枝及斷根且修枝等方式處理24年生的臺灣肖楠母樹，但連續(xù)兩年只促進(Γ2.4%的植株開花，效果不佳。(忠興郭，2002)以GA3對臺灣肖楠開花旺盛期進行處理，93.9%可以開花，但雄花大量提前掉落，造成結(jié)實率不高。(郭寶章，1989)進行臺灣肖楠扦插繁殖試驗，但成活率不到2%，且成活的扦插苗生長緩慢。
[0004]經(jīng)查閱相關(guān)文獻，目前在大陸還未見有關(guān)臺灣肖楠組織培養(yǎng)、扦插等方面的報道。而臺灣學(xué)者在臺灣肖楠組織培養(yǎng)研究方面也未有較大突破，林志謀等(1997)指出未成熟胚添力口 600mg/Lcasein enzymatic hydroIysate>500mg/L yeast extract、0.5mg/L BA 及l(fā)mg/L NAA的WPM培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)出芽，但出芽率較低。用4?6個月的實生苗莖段及葉片，在WPM+0.05 mg/LNAA+lmg/LBA可誘導(dǎo)腋芽發(fā)生，但芽體有玻璃化現(xiàn)象，以相同的外植體接種在WPM +0.01mg/LBA+0.05mg/LTDZ培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率也僅僅能達到60%。愈傷組織在MS+ lmg/LNAA+0.lmg/LBA培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果較好，但愈傷組織再分化為叢生芽的效果不好。
[0005]經(jīng)查閱相關(guān)文獻進行綜合分析認為:目前雖已有臺灣方面相關(guān)科研人員對臺灣肖楠進行了組織培養(yǎng)方面的研究，但總體效果不好，未見完整的組培快繁體系報道，而本發(fā)明探索出了利用臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，本發(fā)明具有一定的獨創(chuàng)性和新穎性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立一套用臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，從而構(gòu)建了不依靠單純的種子繁殖或扦插繁殖進行栽培的傳統(tǒng)種植模式，利用組培技術(shù)繁殖出的種苗最大限度的保持了母本的特性，同時可在短期內(nèi)獲得大量性狀一致、脫毒的臺灣肖楠無菌苗，為野生臺灣肖楠資源的保護、群落的恢復(fù)和利用臺灣肖楠在大陸地區(qū)作為退耕還林、植樹造林等的樹種及合理利用提供了一種新的技術(shù)支撐。
[0007]本發(fā)明可通過以下技術(shù)實現(xiàn)外植體培育
O將從臺灣引進的一棵臺灣肖楠種植在基質(zhì)為腐殖土的盆中，視土壤含水量澆水，置于向陽通風(fēng)處備用，待需要外植體材料時，用不銹鋼剪刀剪取位于頂端新長出的葉片，作為外植體材料來源，外植體采集宜于在晴天的8:0(Γ10:00進行。
[0008]2)無菌苗獲取
剪取的外植體材料，置于洗凈的燒杯中，滴入1-3滴普通洗潔精，I滴吐溫20，蓋上紗布并綁扎好，置于自來水下流水沖洗5h ;沖洗后的外植體材料于超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡50s，用無菌水沖洗3次，而后將沖洗后的外植體用滅菌后的鑷子放入0.1%的升汞中消毒8min,無菌水沖洗6次,每次1.5min,然后將外植體放入事先準備好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌濾紙吸干材料上殘留的水分，接種前將葉片用無菌不銹鋼刀片切成1.5cm的小段，然后將切好的外植體接種到過渡培養(yǎng)基中，(MS (無肌醇)+0.0Γ3.0mg/LNAA+5^7g/L瓊脂)。
[0009]待在過渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)15?20d時，挑取無污染的外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)。
[0010]3)愈傷組織誘導(dǎo)
將過渡培養(yǎng)基中無污染的外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培(MS+0.01mg/L^3.0mg/LNAA+0.0Γ2.0mg/L2, 4-D+0.θΓ?.0mg/L6-BA+25g/L 蔗糖 +5?7g/L 瓊脂)。接種時外植體橫放，并輕壓外植體材料使之與培養(yǎng)基充分接觸；培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x,每天光照時間12h，7d后可見米白色疏松愈傷組織從切口處長出，待愈傷組織長到1.5cm左右寬時，轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0011]4)叢生芽誘導(dǎo)與增值
將疏松、嫩綠色、長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接于再分化培養(yǎng)基上(叢生芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基:
WPM+0.ΟΓ?.0mg/LNAA+0.0lmg/L?2.0mg/LTDZ+0.θΓ?.5mg/LKT+0.0lmg/L?1.5mg/LGAs+30g/L蔗糖+5?7g/L瓊脂)。用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，培養(yǎng)30d后，可見叢生芽大量長出，繼續(xù)培養(yǎng)35d，可得分化良好，長勢旺盛的叢生苗。
[0012]5)壯苗培養(yǎng)
截取高Γ5αιι的叢生苗，接種于壯苗培養(yǎng)基上，(生根壯苗培養(yǎng)基:WPM+0.0Γ3.0mg/LNAA+0.0lmg/L?2.0mg/L IBA+ 適量(5-lOmL)香蕉汁 +30g/L 蔗糖 +5?7g/L 瓊脂)。培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，培養(yǎng)7d后可得健壯的臺灣肖楠無菌苗。
[0013]本發(fā)明在接種操作過程中，在進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)接種時，需要先將臺灣肖楠外植體橫放在培養(yǎng)基上，并輕壓外植體材料使之與培養(yǎng)基充分接觸；在進行叢生芽誘導(dǎo)時，愈傷組織轉(zhuǎn)接于再分化培養(yǎng)基上，需要用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸。避免了接種材料形狀不規(guī)則導(dǎo)致的與培養(yǎng)基接觸不充分而導(dǎo)致的生長不好甚至死亡。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案，具有以下有益效果:相對于傳統(tǒng)的種子播種或扦插繁殖，繁殖速度快，從外植體到成苗只需4個月時間；繁殖系數(shù)高，不定芽成指數(shù)增長；不受外界環(huán)境影響，四季均可進行種苗繁育；種苗穩(wěn)定性好，分離或衰減的情況發(fā)生較少；種苗通過組培，全部為脫毒苗，利于高產(chǎn)，少病蟲害；投資少，只需少量的原生外植體就可獲得大量的無菌苗，經(jīng)濟效益高，可規(guī)?；N植，解決種苗來源這一瓶頸，組培苗的野生環(huán)境栽培有利于野生居群的恢復(fù)，可遏制野生資源的掠奪性采挖，增加退耕還林、植樹造林、園林綠化樹種，可產(chǎn)生良好的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。

【具體實施方式】
[0015]實施例1
從臺灣引進一盆臺灣肖楠備用，用不銹鋼剪刀剪取位于頂端新長出的葉片置于洗凈的燒杯中，滴入1-3滴普通洗潔精，I滴吐溫20，蓋上紗布并綁扎好，置于自來水下流水沖洗3-5h，沖洗后的材料于超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡50s，用無菌水沖洗3次，而后將沖洗后的外植體用滅菌后的鑷子放入0.1%的升汞中消毒8min，無菌水沖洗6次，每次1.5min，然后將外植體放入事先準備好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌濾紙吸干材料上殘留的水分，用無菌不銹鋼刀片切成1.5cm的小段，然后將切好的外植體接種到過渡培養(yǎng)基中，待在過渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)15?20d時，挑取無污染的外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，接種時外植體橫放，并輕壓外植體材料使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度25 V，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，7d后可見米白色疏松愈傷組織從切口處長出，待愈傷組織長到1.5cm左右寬時，挑取疏松、嫩綠色、長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接于再分化培養(yǎng)基上，用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，培養(yǎng)30d后，可見叢生芽大量長出，繼續(xù)培養(yǎng)35d，可得分化良好，長勢旺盛的叢生苗；截取高4?5cm的叢生苗，接種于壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，培養(yǎng)14d后可得健壯的臺灣肖楠無菌苗。
[0016]方案所使用培養(yǎng)基為:外植體培育:腐殖土。
[0017]上述該發(fā)明的過渡培養(yǎng)基:
MS (無肌醇)+0.0Γ3.0mg/LNAA+5?7g/L 瓊脂。
[0018]該發(fā)明的愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基:
MS+0.01mg/L?3.0mg/LNAA+0.01 ?2.0mg/L2, 4-D+0.θΓ?.0mg/L6_BA+25g/L 蔗糖+5?7g/L瓊脂。
[0019]該發(fā)明的叢生芽誘導(dǎo)與增殖最佳培養(yǎng)基:
WPM+0.ΟΓ?.0mg/LNAA+0.01mg/L?2.0mg/LTDZ+0.θΓ?.5mg/LKT+0.01mg/L?1.5mg/LGAs+30g/L 蔗糖 +5?7g/L 瓊脂。
[0020]該發(fā)明的生根壯苗最佳培養(yǎng)基:
WPM+0.0Γ3.0mg/LNAA+0.01mg/L?2.0mg/L IBA+ 適量香蕉汁 +30g/L 蔗糖 +5?7g/L 瓊脂。
【權(quán)利要求】
1.一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:按下列步驟: 1)外植體培育:將臺灣肖楠種植于有腐殖土中備用，待需要外植體材料時，用不銹鋼剪刀剪取位于頂端新長出的葉片，作為外植體材料來源； 2)無菌苗獲取:剪取的外植體材料，置于洗凈的燒杯中，滴入1-3滴普通洗潔精，I滴吐溫20，蓋上紗布并綁扎好，置于自來水下流水沖洗3-5h ;沖洗后的外植體材料于超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡50s，用無菌水沖洗3次，而后將沖洗后的外植體用滅菌后的鑷子放入0.1%的升汞中消毒8min，無菌水沖洗6次，每次1.5min,然后將外植體放入事先準備好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌濾紙吸干材料上殘留的水分，接種前將葉片用無菌不銹鋼刀片切成1.5cm的小段，然后將切好的外植體接種到過渡培養(yǎng)基中，待在過渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)15^20d時，挑取無污染的外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)； 3)愈傷組織誘導(dǎo):將過渡培養(yǎng)基中無污染的外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種時外植體橫放，并輕壓外植體材料使之與培養(yǎng)基充分接觸；培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%,光照強度22001x，每天光照時間12h，7d后可見米白色疏松愈傷組織從切口處長出，待愈傷組織長到1.5cm左右寬時，轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)； 4)叢生芽誘導(dǎo)與增殖:將疏松、嫩綠色、長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接于再分化培養(yǎng)基上，用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x,每天光照時間12h，培養(yǎng)30d后，可見叢生芽大量長出，繼續(xù)培養(yǎng)35d，可得分化良好，長勢旺盛的叢生苗； 5)壯苗培養(yǎng):截取高r5cm的叢生苗，接種于壯苗培養(yǎng)基上，WPM為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)室溫度25°C，濕度70%，光照強度22001x，每天光照時間12h，培養(yǎng)14d后得健壯的臺灣肖楠無菌苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:步驟I)中所述的臺灣肖楠品種從臺灣引進。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:所述步驟2)中過渡培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基，不添加肌醇和蔗糖，添加5?7g/L瓊脂、0.0Γ3.0mg/L的NAA，pH值在常溫下調(diào)整至6.0,高壓滅菌20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種利用臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:所述的步驟3)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.01mg/L^3.0mg/L的NAA,0.0Γ2.0mg/L2, 4_D、0.θΓ?.0mg/L 的 6_BA、25g/L 的蔗糖、pH 值于常溫下調(diào)整至 6.0、5^7g/L瓊脂,高壓滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:所述的步驟4)中再分化培養(yǎng)基，以WPM為基本培養(yǎng)基，添加0.0Γ1.0mg/L的NAA、0.0lmg/L?2.0mg/L 的 TDZ、0.θΓ?.5mg/L 的 KT,0.01mg/L?1.5mg/LGA3、30g/L 的蔗糖、pH 值于常溫下調(diào)整至6.0、5?7g/L瓊脂、高壓滅菌20min，接種時用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種臺灣肖楠幼嫩葉片快速繁殖無菌苗，其特征在于:所述的步驟5)中壯苗培養(yǎng)基:以WPM為基本培養(yǎng)基，添加0.0Γ3.0mg/L的NAA、0.0lmg/L^2.0mg/L的IBA、5-10mL的香蕉汁、30g/L的蔗糖、pH值于常溫下調(diào)整至6.0、5?7g/L瓊脂、高壓滅菌20min。
【文檔編號】A01H4/00GK104351051SQ201410584582
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】張翔宇, 陳杰, 阮培均, 吉云, 嚴顯進, 王彩云, 王永 申請人:畢節(jié)市中藥研究所