本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種低劑量電離輻射生物誘變方法及應(yīng)用和植物育種方法。

背景技術(shù)：

通常的輻射誘變，是利用χ、γ、α、β射線(xiàn)和中子、紫外光等輻射處理生物體，誘發(fā)遺傳物質(zhì)的改變，使后代出現(xiàn)新的變異類(lèi)型。在植物誘變中，一般采用60Co-γ射線(xiàn)對(duì)植物種子進(jìn)行處理，所采用的劑量通常為50-300Gy，根據(jù)不同植物種類(lèi)或品種，適宜的輻射劑量有所不同。其主要特征是，(1)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的基因序列變異；(2)輻射劑量大；(3)變異方向不可控，多數(shù)為劣變；(4)致死率高。

目前農(nóng)業(yè)育種(包括工業(yè)微生物菌種)中常用的育種材料，包括一般品種、親本、自交系和自然種，雖然通過(guò)多代篩選，在表型上已經(jīng)具有很高的一致性，但是群體內(nèi)都存在著大量的隱匿性遺傳變異(遺傳多樣性)，這些變異來(lái)自于長(zhǎng)期的自然突變。基于最新提出的遺傳緩沖理論，在生物群體中，多數(shù)性狀都存在大量的隱匿性遺傳變異，在正常條件下，遺傳緩沖阻止了這些遺傳變異的表達(dá)，保證生物發(fā)育和表型的穩(wěn)定性，當(dāng)發(fā)生某些環(huán)境脅迫或其他變化時(shí)，遺傳緩沖被抑制或干擾，正常發(fā)育被破壞，生物中隱藏的遺傳變異得到表達(dá)，產(chǎn)生了新的表型變異。

目前，尚未有利用該理論進(jìn)行生物誘變或植物育種的應(yīng)用方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的生物誘變方法及應(yīng)用和植物育種方法。本發(fā)明的方法利用群體中積累的隱匿性變異，不產(chǎn)生新的遺傳變異；變異頻率高；可產(chǎn)生有利或綜合性的變異性狀；通過(guò)篩選富集變異可穩(wěn)定遺傳。并且簡(jiǎn)便、可大批量進(jìn)行；輻射劑量小，不會(huì)對(duì)植物正常生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，便于變異篩選。

本發(fā)明的第一方面是提供一種低劑量電離輻射生物誘變方法，該方法包括：利用低劑量電離輻射處理休眠態(tài)生物體，使其發(fā)生表型變異。根據(jù)本發(fā)明，所述低劑量電離輻射只要能實(shí)現(xiàn)休眠態(tài)生物體的表型變異即可。優(yōu)選地，所述低劑量電離輻射的劑量為1Gy以下。進(jìn)一步優(yōu)選為5-200mGy。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述低劑量電離輻射的劑量率為100mGy/天以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mGy/天以下，可長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)或間斷處理。

本發(fā)明的原理基于此：Hsp90是一種分子伴侶，其在生物的遺傳緩沖中起著核心作用。Hsp90遺傳緩沖抑制了這些變異的表達(dá)并積累變異。利用低劑量電離輻射干擾Hsp90基因表達(dá)和遺傳緩沖，生物群體中會(huì)產(chǎn)生各種表型變異，由于這些變異多數(shù)是由許多微小變異控制的，可以通過(guò)篩選和雜交將其富集，成為穩(wěn)定遺傳性狀。

Hsp90家族非常保守，在動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中都已發(fā)現(xiàn)Hsp90的同源基因。因此，根據(jù)本發(fā)明，所述休眠態(tài)生物體可以為生長(zhǎng)和代謝處于暫時(shí)停頓狀態(tài)的任何生物體，優(yōu)選為植物種子或其他植物繁殖體、微生物孢子和動(dòng)物卵中的至少一種。所述植物種子可以為植物干種子或濕種子。所述其他植物繁殖體優(yōu)選包括：用于繁殖的球莖、塊莖、塊根、根莖、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細(xì)胞組織、懸浮細(xì)胞系或原生質(zhì)體。其中，所述植物種子例如為擬南芥種子，所述微生物孢子例如為細(xì)菌芽孢，所述動(dòng)物卵例如為果蠅卵。

本發(fā)明的第二方面是提供上述生物誘變方法在生物育種中的應(yīng)用。

其中，本發(fā)明的所述生物可以包括植物、卵生動(dòng)物或微生物。

本發(fā)明的第三方面是提供一種植物育種的方法，該方法包括：

(1)根據(jù)上述方法對(duì)植物種子或其他植物繁殖體進(jìn)行生物誘變，得到表型變異體；

(2)篩選并雜交所述表型變異體，使其遺傳性狀穩(wěn)定。上述雜交的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的雜交方法。

根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)低劑量電離輻射可能同時(shí)獲得多種不同變異的表型變異體。因此，篩選同種表型變異體進(jìn)行雜交。

本發(fā)明中，所述植物種子可以為植物干種子或濕種子。所述其他植物繁殖體優(yōu)選包括：用于繁殖的球莖、塊莖、塊根、根莖、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細(xì)胞組織、懸浮細(xì)胞系或原生質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述植物種子為干種子，進(jìn)一步優(yōu)選為擬南芥干種子。

根據(jù)本發(fā)明，所述電磁輻射可以為本領(lǐng)域常規(guī)的射線(xiàn)輻射，包括但不限于χ、γ、α、β射線(xiàn)、中子、紫外光。

目前已知抑制Hsp90基因功能的方法有：熱激、抑制劑、基因工程方法。其中，熱激是將動(dòng)物、植物、微生物在較高的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，使之處于熱激脅迫，細(xì)胞內(nèi)大量蛋白變性，從而造成Hsp90分子伴侶的相對(duì)短缺；抑制劑，是將Hsp90蛋白的特異性抑制劑格爾德霉素加入到動(dòng)物的食物或植物的培養(yǎng)基中；基因工程方法是通過(guò)基因突變或轉(zhuǎn)基因?qū)sp90基因序列進(jìn)行突變或?qū)ζ浔磉_(dá)進(jìn)行抑制。以上三種方法進(jìn)行誘變處理時(shí)，都存在較大的局限性，其中，熱激脅迫會(huì)對(duì)動(dòng)、植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)不良；抑制劑格爾德霉素見(jiàn)光易分解(48小時(shí)內(nèi))，只能對(duì)植物進(jìn)行短期避光處理；基因工程方法難度較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于應(yīng)用。

與常規(guī)輻射誘變和已知抑制Hsp90功能方法比較，本發(fā)明進(jìn)行低劑量輻射處理方法的優(yōu)勢(shì)包括：

(1)利用群體中積累的隱匿性變異，不產(chǎn)生新的遺傳變異。

(2)變異頻率高。

(3)群體內(nèi)積累的變異，多數(shù)已經(jīng)過(guò)篩選，剩下的多為微效或有利變異，通過(guò)富集可產(chǎn)生有利或綜合性的變異性狀。

(4)方法簡(jiǎn)便，可大批量進(jìn)行。僅需對(duì)種子進(jìn)行低劑量γ輻照處理，后續(xù)無(wú)需特殊培養(yǎng)條件即可誘導(dǎo)變異，一次可處理大量不同種類(lèi)、品種的種子。

(5)輻射劑量小，不會(huì)對(duì)植物正常生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，便于變異觀(guān)察。本發(fā)明所用輻射劑量約為通常輻射育種所用劑量的幾千-幾十萬(wàn)分之一。處理后，植物的正常生長(zhǎng)不會(huì)受到顯著影響，僅有少數(shù)植株會(huì)發(fā)生一些形態(tài)變異，非常方便觀(guān)察與篩選。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1顯示的是Greenville生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導(dǎo)突變體。

圖2顯示的是Col-PRL生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導(dǎo)突變體。

具體實(shí)施方式

一、植物低劑量輻射誘變及選育方法

1、誘變材料的選擇

誘變材料的選擇是低劑量輻射誘變育種能否成功的關(guān)鍵之一，應(yīng)根據(jù)育種目標(biāo)，選擇綜合性狀優(yōu)良、穩(wěn)定、一致的品種作為誘變材料，它們可以是推廣品種、地方品種、野生種、自交系、雜交種的親本、甚至雜交種。所選品種材料已具有育種目標(biāo)所要求的大部分性狀，僅需改良某些方面的性狀，例如：提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等。所選材料應(yīng)具有通過(guò)有性雜交繁殖后代的能力。用于誘變的材料可以是干種子、濕種子；也可以是用于繁殖的休眠態(tài)營(yíng)養(yǎng)體，如球莖、塊莖、塊根、根莖等；休眠的接穗或芽；花粉粒；以及植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細(xì)胞組織、懸浮細(xì)胞系和原生質(zhì)體等，優(yōu)選為植物干種子。

2、低劑量輻射誘變

選取一定數(shù)量的上述植物材料，優(yōu)選地，每種材料的數(shù)量大于1000個(gè)。利用χ、γ、α、β射線(xiàn)和中子、紫外光對(duì)所選材料進(jìn)行輻照處理，優(yōu)選地，使用60Co-γ射線(xiàn)進(jìn)行輻照處理。輻照的總劑量小于1Gy，優(yōu)選地，總劑量小于200mGy，大于5mGy。輻照處理可以長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)或間斷進(jìn)行，每天輻照劑量小于100mGy，優(yōu)選地，每天輻照劑量小于10mGy，輻照周期大于5天，優(yōu)選地，輻照周期大于10天。輻射處理后可以立即進(jìn)行萌發(fā)，也可低溫儲(chǔ)藏一定時(shí)間后再進(jìn)行萌發(fā)，優(yōu)選為30天以?xún)?nèi)。

3、變異的選育

低劑量輻射誘變當(dāng)代即可表現(xiàn)突變性狀。在輻照當(dāng)代，從幼苗期開(kāi)始，篩選植株形態(tài)、發(fā)育、果實(shí)等各種性狀變異，并按性狀的相似性對(duì)變異株進(jìn)行分類(lèi)。根據(jù)育種目標(biāo)挑選感興趣的變異株進(jìn)行自交留種，或與性狀相近的變異株進(jìn)行雜交留種。在自交和雜交后代中選取目標(biāo)性狀突出的變異株，再進(jìn)行自交和雜交留種。重復(fù)進(jìn)行幾代后即可獲得具有穩(wěn)定性狀的突變體。

多數(shù)變異株的前幾代自交或雜交后代群體，表現(xiàn)父代變異性狀的頻率較低，通過(guò)自交或雜交可以使變異性狀表現(xiàn)頻率逐漸升高。一般經(jīng)過(guò)3-5代自交或雜交即可獲得具有較高表現(xiàn)率的性狀穩(wěn)定的突變?nèi)后w。

二、微生物孢子低劑量輻射誘變方法

1、誘變材料的選擇

用于誘變的微生物可以是用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥用等各種行業(yè)的微生物菌種，誘變的材料可以是真菌的孢子或細(xì)菌的芽孢。

2、低劑量輻射誘變

輻照的劑量與方法與植物低劑量輻射誘變方法相同。

3、突變體篩選

將輻照過(guò)的菌種，在通用或篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)的觀(guān)察、染色鑒定以及生理生化試驗(yàn)，篩選變異菌株，再通過(guò)分離純化和繼代培養(yǎng)，獲得具有穩(wěn)定表型的變異株。

三、動(dòng)物卵低劑量輻射誘變方法

1、誘變材料的選擇

用于誘變的動(dòng)物可以是各種卵生動(dòng)物，包括一般的鳥(niǎo)類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)，大部分魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)。如：雞、鴨、魚(yú)、青蛙、烏龜、蝴蝶、果蠅等。誘變材料為各種動(dòng)物的卵。

2、低劑量輻射誘變

輻照的劑量與方法與植物低劑量輻射誘變方法相同。

3、變異的選育

具體選育方法與植物低劑量輻射變異的選育方法相同。。

實(shí)施例

用低劑量的60Co-γ射線(xiàn)對(duì)擬南芥干種子(Greenville生態(tài)型和Col-PRL生態(tài)型)進(jìn)行輻照處理，輻照的總劑量為100mGy，輻照處理間斷進(jìn)行，每天輻照劑量為8mGy。分析表明，處理擬南芥在萌發(fā)后的較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)Hsp90基因的表達(dá)發(fā)生持續(xù)性變化，并且，一些處理群體產(chǎn)生新的表型變異。圖1顯示的是Greenville生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導(dǎo)突變體。由圖1可以看出，星號(hào)所標(biāo)識(shí)的擬南芥植株發(fā)生了表型變異。圖2顯示的是Col-PRL生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導(dǎo)突變體。由圖2可以看出，框線(xiàn)內(nèi)的擬南芥植株發(fā)生了表型變異。

根據(jù)育種目標(biāo)挑選感興趣的變異株進(jìn)行自交留種，或與性狀相近的變異株進(jìn)行雜交留種。在自交和雜交后代中選取目標(biāo)性狀突出的變異株，再進(jìn)行自交和雜交留種。重復(fù)進(jìn)行3代后即可獲得具有穩(wěn)定性狀的突變體。

由此可見(jiàn)，對(duì)植物種子進(jìn)行低劑量電離輻射處理可以作為一種干擾Hsp90功能，誘導(dǎo)變異的有效手段。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說(shuō)明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說(shuō)明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)許多修改和變更都是顯而易見(jiàn)的。