本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄灰霉病是由一種植物病原性真菌引起的世界性病害，其致病菌是屬于半知菌亞門的灰葡萄孢(B.cinerea)。該病菌主要危害番茄的花、果和莖葉，引起果實(shí)和葉片腐爛，導(dǎo)致番茄大范圍減產(chǎn)，一般可減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50％，從20世紀(jì)80年代開始蔓延至我國。
化學(xué)防治方法具有防治范圍廣、防治速度快、防治操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，所以傳統(tǒng)的防治方法依然以化學(xué)農(nóng)藥為主。防治番茄灰霉病的常見化學(xué)農(nóng)藥主要有苯并咪唑類、N-苯基氨基甲酸酯類、苯胺基嘧啶類以及二甲酰胺類殺菌劑。苯并咪唑類殺菌劑主要有多菌靈、甲基托布津、噻菌靈等，這類殺菌劑應(yīng)用較早，它的的作用機(jī)理是藥劑結(jié)合番茄灰霉病病菌的微管蛋白，影響其正常功能，抑制菌絲體的生長與分隔，從而使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的有絲分裂和形態(tài)建成；N-苯基氨基甲酸酯類殺菌劑包括霜霉威和乙霉威，這類殺菌劑主要通過抑制病菌菌絲體微管蛋白的活性，影響菌絲體正常有絲分裂來達(dá)到防治效果；苯胺基嘧啶類殺菌劑包括嘧菌環(huán)胺、嘧菌胺、嘧霉胺，這類殺菌劑可以通過抑制菌絲體分泌胞外蛋白酶以及抑制蛋氨酸的合成來達(dá)到防治效果；二甲酰胺類殺菌劑包括異菌脲、腐霉利、乙烯菌核利，這類殺菌劑可以影響菌絲體細(xì)胞膜的通透性，從而影響細(xì)胞活性，達(dá)到防治效果。雖然化學(xué)防治具有其不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是由于大量使用單一化學(xué)農(nóng)藥以及灰霉病菌繁殖速度快，易遺傳變異等原因，導(dǎo)致灰霉病菌已對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性。雖然化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)品在不斷更新，但化學(xué)防治的效果依然在逐步減弱。
生物防治是一種新型的防治方法，與傳統(tǒng)的化學(xué)防治相比，具有綠色、安全、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，符合人與自然和諧相處的理念，引起眾多科學(xué)家的關(guān)注，一些新型有效的防治方法也逐漸出現(xiàn)在大眾視線，與化學(xué)防治共同發(fā)揮作用，并逐步取代化學(xué)防治的地位。
竹紅菌素是我國率先研究的一類天然光敏劑，我國對(duì)其研究歷史已超30多載，上世紀(jì)80年代，研究主要圍繞在其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)等方面，90年代，主要圍繞在光動(dòng)力治療腫瘤以及結(jié)構(gòu)修飾方面，進(jìn)入21世紀(jì)后，又展開了治療微血管疾病方面的研究，而關(guān)于將其開發(fā)為生物農(nóng)藥，防治農(nóng)林類病害方面的研究卻鮮有報(bào)道。隨著化學(xué)農(nóng)藥的濫用，許多害蟲和病原菌已逐漸產(chǎn)生抗藥性，開發(fā)高效、低毒、綠色、環(huán)保的生物農(nóng)藥已成為研究者們競相研究的熱門課題。
中國專利文獻(xiàn)公開了一種高純度竹紅菌甲素的制備方法[申請(qǐng)?zhí)枺?00610011072.1]，是從竹紅菌或竹黃菌中藥材中提取并通過分離、結(jié)晶、洗滌、萃取、干燥等工藝及產(chǎn)品純度分析得到高純度竹紅菌甲素，可用于支撐軟膏劑、酊劑、氣霧劑、片劑、膠囊劑和注射劑等多種劑型。但沒有提供應(yīng)用于抑制番茄灰霉病菌的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供竹紅菌甲素對(duì)抑制番茄灰霉病菌的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的是提供竹紅菌甲素對(duì)在光化農(nóng)藥中的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：一種竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法，將竹紅菌甲素溶液與番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體接觸。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹紅菌甲素溶液噴灑在番茄灰霉病菌上和/或感染番茄灰霉病菌的物體上。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體浸泡在竹紅菌甲素溶液中。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，當(dāng)竹紅菌甲素溶液與番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體接觸時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體在12000LX光強(qiáng)下光照10-24h。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹紅菌甲素溶液的制備方法是：將竹黃子座用無水酒精浸泡，過濾固體雜質(zhì)得到提取液，提取液濃縮制得竹紅菌甲素浸膏，竹紅菌甲素浸膏稀釋得到竹紅菌甲素溶液。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹黃子座用無水酒精浸泡12小時(shí)以上，竹紅菌甲素浸膏稀釋成濃度為10-100mg/L的竹紅菌甲素溶液。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹紅菌甲素浸膏先用無水乙醇稀釋后制成竹紅菌甲素母液，再用含5％乙醇的0.05mol/L PBS緩沖液稀釋成濃度為10-100mg/L，pH值為6.0、7.0或7.2的竹紅菌甲素溶液。
在上述的竹紅菌甲素抑制番茄灰霉病菌的方法中，所述的竹紅菌甲素溶液的濃度為40mg/L，pH值為7.2。
竹紅菌甲素在抑制番茄灰霉病菌中的應(yīng)用。
竹紅菌甲素在光活化農(nóng)藥中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
1、HA處理番茄灰霉病菌時(shí)HA可以進(jìn)入菌絲，且充滿菌絲，能明顯抑制番茄灰霉病菌SOD抗氧化酶的活性，能導(dǎo)致番茄灰霉病菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，引起胞內(nèi)蛋白與可溶性還原糖外泄，細(xì)胞膜遭到損傷，能引發(fā)番茄灰霉病菌膜脂質(zhì)過氧化，從而對(duì)番茄灰霉病菌起到抑制作用。
2、HA作為一種新型天然光敏劑，兼具化學(xué)成分單一、原料易得易純化、光毒性高且暗毒性低、三重態(tài)量子產(chǎn)率高、單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，加之其源于自然，不引起土壤污染，對(duì)環(huán)境安全無公害，能開發(fā)為綠色光活化農(nóng)藥，符合環(huán)境友好型社會(huì)的發(fā)展需求與趨勢(shì)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規(guī)生化試劑商店購買得到。以下實(shí)施例中的定量數(shù)據(jù)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
實(shí)施例1
竹紅菌甲素(HA)浸膏的制備
取50-100g竹黃子座，加入500mL無水酒精浸泡10-24h，優(yōu)選12小時(shí)以上，。用定性濾紙過濾酒精浸提液，優(yōu)選過濾4次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)酒精，濃縮制得HA浸膏。
HA溶液的配制：取一定量HA浸膏，加少量的無水乙醇作為溶劑，制成HA母液。用紫外分光光度計(jì)測(cè)465nm下的吸光值，參照[黃小波.藥用真菌竹黃的液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化及竹紅菌素的提取研究.浙江：浙江農(nóng)林大學(xué)，2010]HA標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，算出HA含量。用含5％乙醇的0.05M PBS緩沖液(除CAT活性測(cè)定pH 7.0，POD測(cè)定pH 6.0，其他均pH 7.2)將HA母液分別稀釋成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的HA溶液，優(yōu)選地，HA溶液稀釋至40mg/L。
將上述的HA溶液噴灑到竹紅菌甲素溶液與番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體上，對(duì)番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體在12000LX光強(qiáng)下光照10-24h。
對(duì)比例1
在本對(duì)比例中含5％乙醇的0.05M PBS緩沖液替代HA溶液，將緩沖液噴灑到竹紅菌甲素溶液與番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體上，對(duì)番茄灰霉病菌和/或感染番茄灰霉病菌的物體在12000LX光強(qiáng)下光照10-24h。
應(yīng)用例1
培養(yǎng)基的制備
PDA固體培養(yǎng)基：稱取200g去皮土豆切成大小均勻的小塊，加1.5L水煮沸15～20min，用4層紗布過濾取濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，趁熱攪拌均勻，使瓊脂完全溶解，用水補(bǔ)足至總體積為1L，pH自然。把培養(yǎng)基分裝至錐形瓶，用壓力蒸汽滅菌器在121℃條件下滅菌20min。PDA液體培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基配置過程中不加瓊脂。
番茄灰霉病菌菌絲體的制備
將番茄灰霉病菌平板26℃恒溫培養(yǎng)4天后，用4mm孔徑的無菌打孔器打取平板上生長旺盛的同一圓周的菌餅，接到液體PDA培養(yǎng)基中，26℃，120rpm搖床培養(yǎng)4天。將菌絲球取出，用無菌水淋洗2次，洗去菌絲球上粘上的培養(yǎng)基，得到菌絲體。
番茄灰霉病菌菌絲對(duì)HA吸收的測(cè)定
挑取少量PDA平板上生長的番茄灰霉病菌菌絲在40mg.L-1的HA溶液中靜置30min，以5％乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組。輕輕用無菌水洗去粘在菌絲上的HA，在載玻片上滴一滴無菌水，挑取少量菌絲置于載玻片中，蓋上蓋玻片，用于觀察HA吸收情況。HA在一定波長的光源激發(fā)下，可以產(chǎn)生熒光，利用這一特性選擇激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，激發(fā)光源選擇綠色氦氖激光器，分別采集微分干涉相差圖像(DIC)，熒光圖像和二者相疊加的圖像用于分析。
結(jié)果分析：未經(jīng)HA處理的菌絲，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，未見熒光。而經(jīng)HA處理的菌絲，在激發(fā)光源的照射下，產(chǎn)生了明顯的熒光。且整根菌絲充滿了熒光。由于HA在一定波長的光源激發(fā)下，可以產(chǎn)生熒光，說明HA已被番茄灰霉菌絲所吸收，并且進(jìn)入到菌絲內(nèi)部。本應(yīng)用例觀察到的熒光現(xiàn)象進(jìn)一步證明了HA可以通過破壞細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生生理生化變化。
應(yīng)用例2
稱取2g菌絲，放入150mL的錐形瓶中，每瓶錐形瓶加30mL40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組，設(shè)置處理時(shí)間為0h、6h、12h、24h、36h。每組時(shí)間梯度設(shè)3組重復(fù)。放入恒溫光照培養(yǎng)箱，26℃，12 000LX光強(qiáng)進(jìn)行光照。在光照后取出錐形瓶，4℃，8 000rpm離心10min，獲得菌絲，用無菌水淋洗菌絲2次。將菌絲置于研缽中，液氮研磨至菌絲呈均勻糊狀，加入4mL 0.05M pH 7.2的PBS緩沖液，4℃，10 000rpm離心20min。取2mL上清液加入2mL含0.67％TBA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的三氯乙酸(TCA)，混合均勻后，放置在100℃的沸水浴中水浴15min，取出后快速置于冰浴中冷卻至反應(yīng)終止。測(cè)定混合液在450、532、600nm處的吸光值，經(jīng)公式(2.1)算出MDA濃度。公式中C表示MDA濃度，單位μmol.L-1。
C＝6.45(OD532-OD600)-0.56OD450(2.1)
結(jié)果分析：用40mg.L-1的HA處理番茄灰霉病菌，隨著處理時(shí)間的延長，菌絲、培養(yǎng)液、菌絲+培養(yǎng)液的MDA含量均呈上升趨勢(shì)。在處理12h時(shí)，與0h相比，差異顯著(P<0.5)。在處理24～36h后，菌絲+培養(yǎng)液的MDA含量較高，與0h、6h、12h相比，差異均為顯著(P<0.5)。這表明HA誘導(dǎo)了番茄灰霉病菌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成膜損傷，改變膜通透性，導(dǎo)致了MDA流出細(xì)胞。
應(yīng)用例3
設(shè)置HA處理濃度為10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1，以30mL含5％的乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組，每組濃度設(shè)3組重復(fù)。稱取2g菌絲(見2.2.1)，放入150mL的錐形瓶中，每瓶錐形瓶加30mL的HA溶液。放入恒溫光照培養(yǎng)箱，26℃，12 000LX光強(qiáng)光照24h。在光照后取出錐形瓶，4℃，8 000rpm離心10min，獲得菌絲，用無菌水淋洗菌絲2次。菌絲及培養(yǎng)液中MDA含量測(cè)定方法同上。
結(jié)果分析：隨著HA濃度的升高，菌絲、培養(yǎng)液、菌絲+培養(yǎng)液的MDA含量均呈上升趨勢(shì)。在HA濃度為0mg.L-1、10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1時(shí)，培養(yǎng)液、菌絲+培養(yǎng)液的MDA含量各濃度間差異顯著(P<0.5)。各HA濃度與0mg.L-1相比，差異均顯著(P<0.5)。HA濃度為10mg.L-1時(shí)，與0mg.L-1相比，菌絲MDA含量差異不顯著(P>0.5)，高于10mg.L-1的菌絲MDA含量與0mg.L-1相比，差異顯著。在HA濃度為100mg.L-1時(shí)，MDA含量達(dá)到最高，與60mg.L-1相比，差異顯著，且培養(yǎng)液中MDA含量顯著高于菌絲中的含量。這表明HA可能誘導(dǎo)了番茄灰霉病菌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成膜損傷，改變膜通透性，導(dǎo)致了MDA流出細(xì)胞，HA濃度越高，對(duì)菌絲的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)越明顯。
應(yīng)用例4
HA處理不同時(shí)間后番茄灰霉病菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：稱取1g菌絲，放入150mL的錐形瓶中，每瓶錐形瓶加30mL 40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組，設(shè)置處理時(shí)間為0h、3h、6h、12h、24h、36h。每組時(shí)間梯度設(shè)3組重復(fù)。將錐形瓶放入恒溫光照培養(yǎng)箱，26℃，12 000LX光強(qiáng)進(jìn)行光照。在光照后取出錐形瓶，4℃，8000rpm離心10min，獲得菌絲。用無菌水淋洗菌絲2次。將菌絲置于研缽中，液氮研磨至菌絲呈均勻糊狀，用0.05M pH 7.2的PBS緩沖液定容至10mL，4℃，10 000rpm離心10min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果分析：未經(jīng)HA處理的菌絲胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量各處理時(shí)間差異不顯著。用40mg.L-1的HA處理番茄灰霉病菌，隨著處理時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)。菌絲經(jīng)HA處理6h時(shí)，菌絲胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量與0h相比，差異不顯著(P>0.5)，分別為0.177gprot.L-1和0.187gprot.L-1，是由于處理時(shí)間較短，HA還未對(duì)細(xì)胞膜的通透性造成顯著影響。在處理12h時(shí)，與0h相比，差異顯著(P<0.5)。在處理24h后，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量較低，與0h、3h、6h、12h相比，差異均為顯著(P<0.5)。在36h時(shí)，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量達(dá)到最低，與對(duì)照組相比，降低了37.0％。這表明胞內(nèi)蛋白質(zhì)明顯泄漏，HA破壞了細(xì)胞膜，使通透性發(fā)生變化，造成胞內(nèi)的蛋白質(zhì)滲漏到胞外，在0～36h，HA處理時(shí)間越長，菌絲胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降越明顯。
應(yīng)用例5
不同濃度HA處理后番茄灰霉病菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:設(shè)置HA處理濃度為10mg.L-1、20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1，以30mL含5％的乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組，每組濃度設(shè)3組重復(fù)。稱取1g菌絲(見2.2.1)，放入150mL的錐形瓶中，每瓶錐形瓶加30mL的HA溶液。放入恒溫光照培養(yǎng)箱，26℃，12 000LX光強(qiáng)光照24h。24h后取出錐形瓶，4℃，8 000rpm離心10min，獲得菌絲。用無菌水淋洗菌絲2次。將菌絲置于研缽中，液氮研磨至菌絲呈均勻糊狀，用0.05M pH 7.2的PBS緩沖液定容至10mL，4℃，10000rpm離心10min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)測(cè)定方法同上。
結(jié)果分析：隨著HA濃度的升高，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)。在HA濃度為10mg.L-1時(shí)，與0mg.L-1相比，差異不顯著(P>0.5)，是由于HA濃度較低，HA還未對(duì)細(xì)胞膜的通透性造成顯著影響，細(xì)胞在低濃度HA刺激下，細(xì)胞生產(chǎn)更多蛋白質(zhì)以抵御外界不良環(huán)境。在HA濃度為20mg.L-1、40mg.L-1、60mg.L-1、80mg.L-1、100mg.L-1時(shí)，與0mg.L-1相比，差異顯著(P<0.5)。在HA濃度為100mg.L-1時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最低，與0mg.L-1相比，降低了81.0％。這表明胞內(nèi)蛋白質(zhì)明顯泄漏，HA破壞了細(xì)胞膜，使通透性發(fā)生變化，造成胞內(nèi)的蛋白質(zhì)滲漏到胞外，HA濃度越高，菌絲胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降越明顯。
實(shí)施例6
HA對(duì)番茄灰霉病菌SOD活性的影響：稱取1g菌絲，放入150mL的錐形瓶中，每瓶錐形瓶加30mL 40mg.L-1的HA溶液，以30mL含5％的乙醇PBS緩沖液替代HA溶液作為對(duì)照組，設(shè)置處理時(shí)間為0h、3h、6h、12h、24h、36h。每組時(shí)間梯度設(shè)3組重復(fù)。
結(jié)果分析：未經(jīng)HA處理的番茄灰霉病菌SOD活性各處理時(shí)間之間差異不顯著。用40mg.L-1的HA處理番茄灰霉病菌，隨著處理時(shí)間的延長，SOD活性呈下降趨勢(shì)。在處理24h后，SOD活性較低，與0h、3h、6h、12h相比，差異均為顯著(P<0.5)。在36h時(shí)，SOD活性下降到最低，比對(duì)照組降低了27.7％。這表明HA抑制了SOD活性，使SOD活性降低，不能及時(shí)清除細(xì)胞中超氧陰離子，導(dǎo)致超氧陰離子在細(xì)胞中積累，對(duì)細(xì)胞造成毒性，從而對(duì)番茄灰霉病菌產(chǎn)生一定影響，在0～36h，HA處理時(shí)間越長，對(duì)菌絲SOD抑制作用越明顯。
本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。