本發(fā)明涉及到虎杖植物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術(shù)。

背景技術(shù)：

虎杖為蓼科植物，虎杖（PoLygonum cuspidatum Sieb.et zuce）干燥根莖及根。主產(chǎn)江蘇、浙江、廣東、廣西、四川、貴州。春秋季采挖，除去殘莖及須根，洗凈泥土，切段成切片，曬干。根莖或根呈圓粒形段塊片，有分支，稍彎曲，長短不一。外表面棕褐色，有明顯縱皺紋，須根和總狀須根痕。質(zhì)堅(jiān)硬，折斷面棕黃色，纖維性。斷面皮部薄，棕褐色。主要成份：含蒽西昆類衍生物，并以游離型為主，其中有大黃素，大黃素甲醚，大黃酚等。還含有大黃素-8-葡萄糖苷，大黃素甲醚-8-葡萄糖苷，還含有茂三酚、茂三酚苷、多聚糖、縮合鞣質(zhì)等。功用主治：活血去瘀，利濕退黃，清熱解毒，止咳化痰。用于瘀血閉經(jīng)，痛經(jīng)，關(guān)節(jié)腫痛，跌打損傷，濕熱黃疸，帶下，毒蛇咬傷，外用的制成油膏等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，超低溫保存植物愈傷組織技術(shù)已日趨完善，愈傷組織用液氮超低溫保存后，其生理代謝、分化能力下降和基因特異性喪失等問題可得到控制，可以作為一種長期穩(wěn)定保存種質(zhì)資源和工業(yè)化，免去了不必要的人力、物力、財(cái)物浪費(fèi)。以超低溫冷凍方法保存的愈傷組織可在其后很長時(shí)間里根據(jù)人們的需要將其取出并用于生產(chǎn)，從而有效地保護(hù)了珍稀植物的種質(zhì)資源。至今為止，尚未見有關(guān)虎杖愈傷組織超低溫保的報(bào)道，這嚴(yán)重制約了虎杖種質(zhì)資源的保存。因此，非常有必要建立虎杖離體超低溫保存技術(shù)體系，為科學(xué)研究提供了極大幫助。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術(shù)，本發(fā)明經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養(yǎng)及再生等過程實(shí)現(xiàn)了虎杖愈傷組織超低溫保存，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是這樣的，一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術(shù)，其特征在于包括以下工藝步驟：

（1）外植體的處理：選取當(dāng)年收飽滿的虎杖種子，以洗潔精水刷洗，置于自來水中沖洗32min后置于清水中浸泡13h，再轉(zhuǎn)入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超凈工作臺(tái)中以75%乙醇溶液浸泡32s，無菌水沖洗6次，再用含有0.06%吐溫-20的0.6%升汞溶液消毒11min，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用；

（2）愈傷組織誘導(dǎo)：用無菌解剖刀在經(jīng)步驟（1）處理后的種子上割刀造成傷口后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后在26℃條件下進(jìn)行全暗培養(yǎng)直至形成愈傷組織；

（3）預(yù)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，接種后在6℃條件下培養(yǎng)6天后檢測細(xì)胞存活率；

（4）裝載處理：將經(jīng)步驟（3）處理后存活的愈傷組織切成2cm左右大小，放入12mL冷凍管后加62%玻璃化保護(hù)劑PVS2在室溫下裝載處理42min；

（5）脫水及冷凍：將經(jīng)步驟（4）處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù)冷至1℃的100%的玻璃化保護(hù)劑PVS2中在6℃處理62min后將冷凍管投入液氮中冷凍處理；

（6）化凍及洗滌：愈傷組織在液氮中保存26h后，取出冷凍管，在42℃水浴中化凍，化凍過程中不斷振蕩冷凍管，使管內(nèi)愈傷組織和保護(hù)劑受熱均勻,然后用含1.2mol/L的MS培養(yǎng)液在室溫下洗滌6次，每次12min；

（7）再培養(yǎng)：將經(jīng)化凍后的愈傷組織用無菌水沖洗9次后立即轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)22天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)；

（8）芽誘導(dǎo)：將步驟（7）培養(yǎng)至22天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)6天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為1800lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽；

（9）生根培養(yǎng)：當(dāng)叢生芽長至3.6cm高時(shí)，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)5天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為1800lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)直至長出根；

（10）試管苗移栽：當(dāng)小苗長出的新根系長達(dá)3.6cm，并且長出側(cè)根，苗高6cm以上時(shí)，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗8天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥（1：1）混合成的基質(zhì)并定植于大田中。

步驟（2）所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+ 6mg/L 2,4-D+ 2.5mg/L 6-BA+ 1.5mg/L KT+3.8%蔗糖+0.6%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

步驟（3）所述的預(yù)培養(yǎng)基為：MS+3.5mg/L6-BA+3.2mg/L NAA+5.5%DMSO+3.6%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

步驟（4）所述的玻璃化保護(hù)劑PVS2為：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。

步驟（5）所述的繼代培養(yǎng)基為：MS+3.2mg/L6-BA+1.2mg/LNAA+3.6%蔗糖+0.6%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

步驟（8）所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.6mg/LNAA+2.5mg/L6-BA+3.6%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

步驟（9）所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.6mg/L6-BA+1.2mg/L NAA+2.6%蔗糖+0.65%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:以虎杖種子誘導(dǎo)得到的愈傷組織為材料建立了虎杖離體低溫保存技術(shù)體系，從而有效地保護(hù)了虎杖優(yōu)良種質(zhì)資源。本發(fā)明經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養(yǎng)及再生等過程實(shí)現(xiàn)了虎杖愈傷組織超低溫保存，可作為一種長期穩(wěn)定保存種質(zhì)資源的方法，降低保存經(jīng)濟(jì)成本，有效地保護(hù)了珍稀的種質(zhì)資源。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明。

實(shí)施例：

（1）外植體的處理：選取當(dāng)年收飽滿的虎杖種子，以洗潔精水輕輕刷洗，自來水沖洗12min后清水中浸泡9h，再轉(zhuǎn)入52mg/mL的赤霉素溶液中浸泡12h，然后在超凈工作臺(tái)中以75%乙醇溶液浸泡12s，無菌水沖洗5次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。

（2）愈傷組織誘導(dǎo)：用無菌解剖刀在經(jīng)步驟（1）處理后的種子上割刀造成傷口后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后在26℃條件下進(jìn)行全暗培養(yǎng)直至形成愈傷組織。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+ 5mg/L 2,4-D+ 2mg/L 6-BA+ 0.6mg/L KT+3.0%蔗糖+0.6%瓊脂+0.06%活性炭，pH值為5.9。

（3）預(yù)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的4周齡的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，接種后在1℃條件下培養(yǎng)2天后檢測細(xì)胞存活率。所述的預(yù)培養(yǎng)基為：MS+1.2mg/L 6-BA+1.2mg/L NAA+1.2%DMSO+2.25%蔗糖+0.35%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

（4）裝載處理：將經(jīng)步驟（3）處理后存活的愈傷組織切成2cm左右大小，放入12mL冷凍管后加55%玻璃化保護(hù)劑PVS2在室溫下裝載處理22min。所述的玻璃化保護(hù)劑PVS2為：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。

（5）脫水及冷凍：將經(jīng)步驟（4）處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù)冷至1℃的100%的玻璃化保護(hù)劑PVS2中在2℃處理20min后將冷凍管投入液氮中冷凍處理。

（6）化凍及洗滌：愈傷組織在液氮中保存26h后，取出冷凍管，在39℃水浴中化凍，化凍過程中不斷振蕩冷凍管，使管內(nèi)愈傷組織和保護(hù)劑受熱均勻。然后用含0.6mol/L的MS培養(yǎng)液在室溫下洗滌4次，每次12min。

（7）再培養(yǎng)：將經(jīng)化凍后的愈傷組織用無菌水沖洗6次后立即轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)22天，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)。所述的繼代培養(yǎng)基為：MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3.3%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

（8）芽誘導(dǎo)：將步驟（7）培養(yǎng)至15天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)3天，然后每天光照18小時(shí)，光照強(qiáng)度為1800lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.6mg/L NAA+2.2mg/L 6-BA+3.35%蔗糖+0.35%瓊脂+0.06%活性炭，pH值為5.9。

（9）生根培養(yǎng)：當(dāng)叢生芽長至3.8cm高時(shí)，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)3天，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)直至長出根。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+2.6%蔗糖+0.8%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。

（10）試管苗移栽：當(dāng)小苗長出的新根系長達(dá)4cm，并且長出側(cè)根，苗高6cm以上時(shí)，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開自然光照下煉苗6天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥（1：1）混合成的基質(zhì)并定植于大田中。