本發(fā)明屬于植物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種花椰菜，具體來說是一種利用分子標(biāo)記制備富含萊菔子苷的花椰菜新種質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染加劇，近10年來我國癌癥發(fā)病數(shù)在持續(xù)上升，癌癥總死亡水平上升了31%。其中肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌等與生活方式密切相關(guān)的癌癥上升迅速，在城市中尤其明顯。因此關(guān)于蔬菜中的抗癌物質(zhì)與人類常見癌癥關(guān)系的研究越來越受到科學(xué)家們的重視。國內(nèi)外大量醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明，經(jīng)常攝食青花菜等十字花科蔬菜，可有效降低肺癌、直腸癌、乳腺癌及前列腺癌等多種癌癥的發(fā)病率，這種抗癌功效與其含有硫苷有關(guān)，其降解產(chǎn)物異硫氰酸鹽能夠誘導(dǎo)脫毒phaseii酶活性，而這類酶能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進腫瘤細(xì)胞程序化死亡，并且能夠使動物和人體內(nèi)一些致毒物質(zhì)形成極性較強易于排泄的結(jié)合物。

國內(nèi)外大量研究表明，4-甲基亞磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,又稱葡萄糖萊菔子苷，簡稱raa，以下簡稱萊菔子苷)降解產(chǎn)生的異硫氰酸鹽-蘿卜硫素（sulforaphane，簡稱sf，1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋瞧駷橹拱l(fā)現(xiàn)的最強烈的phaseⅱ酶誘導(dǎo)劑，而青花菜是十字花科蔬菜中萊菔子苷含量最豐富的蔬菜，但不同青花菜品種中萊菔子苷及其酶解產(chǎn)物蘿卜硫素含量存在極顯著差異，最高可達(dá)百倍以上。

花椰菜，又稱白花菜、菜花，與青花菜同屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種，原產(chǎn)地中海沿岸，最早在19世紀(jì)中末期從上海地區(qū)和東南沿海傳入中國，現(xiàn)是國內(nèi)老百姓餐桌上的主要蔬菜之一，其營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、食物纖維、維生素、類黃酮及礦物質(zhì)，目前全國栽培面積達(dá)300多萬畝，上海市種植面積10萬畝以上，是國內(nèi)出口創(chuàng)匯，增加農(nóng)民收入的重要蔬菜品種之一。雖然與青花菜親緣關(guān)系很近，但研究表明，花椰菜中萊菔子苷含量很低，青花菜花球中萊菔子苷含量是花椰菜花球的十倍甚至百倍以上，如果能夠選擇具有高萊菔子苷含量的青花菜品種，并利用分子標(biāo)記輔助手段快速將其中控制萊菔子苷合成的基因片段轉(zhuǎn)入花椰菜，使花椰菜表現(xiàn)出較高的萊菔子苷含量，創(chuàng)造具有更高抗癌防癌功能的花椰菜新種質(zhì)，可以讓人們在飲食中就能夠輕松地攝取更多的抗癌物質(zhì)，降低多種癌癥的發(fā)生率，提高人民生活質(zhì)量，同時也可以為培育出萊菔子苷含量高的花椰菜新品種提供豐富的原始材料，加速了具有抗癌保健功能的花椰菜新品種的選育過程，具有極大的社會意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本所述的這種利用分子標(biāo)記制備富含萊菔子苷的花椰菜新種質(zhì)的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的花椰菜中萊菔子苷含量很低，抗癌防癌功能不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種利用分子標(biāo)記制備富含萊菔子苷的花椰菜新種質(zhì)的方法，包括以下步驟：

1)選擇萊菔子苷含量高于5μmol/g干重的青花菜自交系與花椰菜自交系配置雜交f1代種子，f1代植株自交得到f2代種子，播種f2代種子得到f2代植株；

2)在步驟1）所述的f2代植株中選擇花球、株型和葉形均趨向于花椰菜的單株，利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對這些單株進行第一次前景選擇，獲得與青花菜親本標(biāo)記帶型一致的f2代單株，以對應(yīng)的花椰菜親本為輪回親本回交，獲得bc1f2代種子，播種bc1f2代種子得到bc1f2代植株；

3)在苗期，第二次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對步驟2）所述的bc1f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本標(biāo)記帶型一致的bc1f2代單株入選，種植于田間，結(jié)合田間篩選，獲得與父本相似度較高的bc1f2代單株，這些單株再與輪回父本回交，得到bc2f2代種子，播種bc2f2代種子得到bc2f2代植株；

4)在苗期，第三次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對步驟3）所述的bc2f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本標(biāo)記帶型一致的bc2f2代單株入選，種植于田間，結(jié)合田間篩選，獲得與父本相似度較高的bc2f2代單株，這些單株再與輪回父本回交，得到bc3f2代種子，播種bc3f2代種子得到bc3f2代植株；

5)在苗期，第四次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對步驟4）所述的bc3f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本標(biāo)記帶型一致的bc3f2代單株入選，種植于田間，結(jié)合田間篩選，獲得與父本相似度高的bc3f2代單株，同時測定bc3f2代單株花球中的萊菔子苷含量，含量最高者入選，入選單株自交留種，后代穩(wěn)定表現(xiàn)的即為培育制備的高萊菔子苷含量花椰菜新種質(zhì)。

本發(fā)明通過雜交一自交一回交的方法，以分子標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，通過標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)表型選擇相結(jié)合，將高萊菔子苷含量的青花菜自交系中的相關(guān)基因片段轉(zhuǎn)入綜合性狀優(yōu)良花椰菜自交系，獲得同時具有較高萊菔子苷含量和綜合園藝和經(jīng)濟性狀較好的花椰菜新種質(zhì)。本發(fā)明利用分子標(biāo)記可在苗期選擇萊菔子苷含量高的單株，淘汰含量低的單株，用地少，工作量小，且可以避免常規(guī)選育方法中花球中萊菔子苷含量測定方法周期長、工作量大、易受環(huán)境影響等缺點。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進步是顯著的。本發(fā)明可以對不同的花椰菜自交系進行高萊菔子苷含量的制備，使萊菔子苷含量的被動選育轉(zhuǎn)變成主動篩選和制備，可以為萊菔子含量高的花椰菜新品種選育提供豐富的原始材料，加速了具有抗癌保健功能的花椰菜新品種的選育過程，具有極大的社會意義。本發(fā)明的方法可以為高萊菔子苷含量花椰菜新品種選育服務(wù)，滿足目前的市場需求。

附圖說明

圖1是ssr引物fito512在雙親及高低含量池的擴增情況；注：m為marker，泳道1-4分別為高萊菔子苷含量親本lbs、低萊菔子苷含量親本li，高萊菔子苷含量池，低萊菔子苷含量池，泳道5-9為組成低萊菔子苷含量池的五個單株，泳道10-14為組成低萊菔子苷含量的五個品種。

圖2是elong-indel標(biāo)記在青花菜和花椰菜中的擴增；注：m為marker，泳道1-8為高萊菔子苷含量青花菜材料，泳道9-16為花椰菜材料

圖3：alk-indel標(biāo)記在青花菜和花椰菜中的擴增；注：m為marker，泳道1-8為高萊菔子苷含量青花菜材料，泳道9-16為花椰菜材料

具體實施方式

實施例1：與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記和indel標(biāo)記的篩選獲得

1.ssr標(biāo)記的獲得

1.1材料

青花菜高代自交系lbs和li及其雜交f2代群體，lbs萊菔子苷含量高為7.16μmol/g干重，li萊菔子苷含量低為0.24μmol/g干重。

1.2高低萊菔子苷含量基因池的建立

所有f2代單株，于花球商品采收期，對商品花球采用三點法混合取樣（即球頂和邊緣共3點），真空冷凍干燥，用磨樣機粉碎均勻，于-18℃冰箱保存。利用反相高效液相色潽法，對所有f2代單株花球中萊菔子苷含量進行測定。根據(jù)測定結(jié)果選取高含量的5個單株和低含量的5個單株，分別提取基因組dna，dna提取采用修改的ctab法進行，具體步驟為：取適量（0.2--0.5g）新鮮嫩葉于1.5ml離心管中，加入650ul預(yù)熱至65℃的ctab緩沖液，用磨樣機研磨，于65℃水浴60min，每10min上下顛倒混勻，冷卻至室溫后加入650ul氯仿：異戊醇（24：1）混勻，靜置5min后12000rpm離心10min，取上清液至新1.5ml離心管中，并加入等體積預(yù)冷的異丙醇混勻，4℃靜置60min，12000rpm離心10min，棄上清，控干水分后用70％乙醇洗1-2次，吹干，溶于100ul(或適量)te中。dna質(zhì)量用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，dna濃度用紫外分光光度計分析。依檢測結(jié)果，將各樣品的dna濃度調(diào)整到50ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩；赽sa法，按照高低含量混池，分別建成高萊菔子苷含量基因池（h池）與低萊菔子苷含量基因池（l池）。

1.3ssr標(biāo)記分析

1.3.1pcr擴增及產(chǎn)物檢測

pcr反應(yīng)為10μl反應(yīng)體系，其中模板dna1μl（50ng/μl），正反向引物共1μl（10μm），2×taqpcrmastermix5ul，ddh2o3ul。pcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性0.5min，56℃復(fù)性0.5min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存，取2.5μlpcr擴增產(chǎn)物，用9%非變性page膠電泳檢測，銀染法顯帶。

1.3.2ssr引物篩選

用236對ssr引物組合對雙親及高低含量基因池進行多態(tài)性初步篩選。結(jié)果表明，ssr標(biāo)記在親本及兩基因池間表現(xiàn)出較強的多態(tài)性，得到8對多態(tài)性引物。利用8對多態(tài)性引物在構(gòu)成高低池的單株（高池和低池各5株）中進行驗證，最終得到1個ssr多態(tài)性標(biāo)記fito512（上游引物ttatcatcaagttctgaccca，下游引物atttcgccatccactgtt），fito512為顯性標(biāo)記，該標(biāo)記在親本li、低含量池l和低含量的單株中于約220bp位置均擴增出條帶，而在親本lbs、高含量池h和高池的單株的相應(yīng)位置均未擴增出目的條帶(圖1)；

1.3.3多態(tài)性標(biāo)記與萊菔子苷含量相關(guān)基因的相關(guān)性分析

利用獲得的ssr標(biāo)記fito512對166株f2群體進行分析，統(tǒng)計條帶擴增情況并利用sas9.1（http://support.sas.com/techsup/download/）中的corr程序進行多態(tài)性標(biāo)記與萊菔子苷含量相關(guān)基因的相關(guān)性分析，結(jié)果表明標(biāo)記與萊菔子苷含量相關(guān)基因的相關(guān)性達(dá)極顯著水平，表明該標(biāo)記與萊菔子苷含量基因相關(guān)緊密。計算標(biāo)記符合率、交換率，并利用kosambi函數(shù)計算標(biāo)記與青花菜萊菔子苷含量基因的遺傳距離，青花菜中萊菔子苷含量高低的界定標(biāo)準(zhǔn)參見國際上硫苷標(biāo)準(zhǔn)，以2μmol﹒g-1干重為界。結(jié)果表明，該標(biāo)記與青花菜萊菔子苷含量基因的遺傳距離為8cm.

2.與萊菔子苷合成基因有關(guān)的indel標(biāo)記的篩選獲得

2.1材料

青花菜高代自交系lbs，mtl，sl，mtl，ysf3-5，sh-5，zzl，yx，花椰菜高代自交系h80，830，jn120，m100，hc05，lf100，xy80，hcc120。

2.2引物設(shè)計

已有研究表明，青花菜花球中萊菔子苷含量明顯高于花椰菜，測定的青花菜花球中萊菔子苷含量是花椰菜花球含量的100倍以上，這主要是由于花椰菜和青花菜中控制萊菔子苷合成的bogsl-elong和bogsl-alk基因的不同。

利用生物信息學(xué)，在genebank中獲得青花菜和花椰菜中bogsl-elong和bogsl-alk基因序列，利用dnastarv7.10軟件分析比對，根據(jù)基因間序列差異缺失設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1.indel標(biāo)記分析用到的引物及序列

2.3indel標(biāo)記的篩選

2.3.1dna提取

上述16個材料，每個材料選取5個典型單株，每個單株取等量幼嫩葉片，混合提取基因組dna，dna提取采用修改的ctab法進行，具體步驟見1.2，dna質(zhì)量用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，dna濃度用紫外分光光度計分析。依檢測結(jié)果，將各樣品的dna濃度調(diào)整到50ng/μl，-2℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2pcr反應(yīng)體系、反應(yīng)程序

pcr反應(yīng)體系為：1×擴增緩沖液（含有(nh4)2so4)，2mmmgcl2，0.1mmdntp，左右引物各0.2μm，0.5utaq酶，50ng的模版dna，終體積是20ul，不足部分由ddh2o補充。pcr反應(yīng)程序是：94℃3min，1個循環(huán)；94℃1min，引物tm值+5℃45s，以后每個循環(huán)復(fù)性溫度降低0.5℃，72℃1min，10個循環(huán)；94℃1min，引物tm值45s，72℃1min，25個循環(huán)；72℃5min，1個循環(huán)，最后在4℃保存。取2.5μlpcr擴增產(chǎn)物，用6%變性page膠電泳檢測，銀染法顯帶，或用2.5%的瓊脂糖凝膠上檢測。

2.3.3引物篩選

利用表1所示引物，對16個材料進行引物篩選，5對引物均能擴增出產(chǎn)物，產(chǎn)物片段大小與設(shè)計預(yù)期相符，經(jīng)驗證引物對e1f/e1r在8個青花菜和8個花椰菜中擴增出能明顯區(qū)分bogsl-elong基因的條帶（見圖2），引物對a2f/a2r在8個青花菜和8個花椰菜中擴增出能明顯區(qū)分bogsl-alk基因的條帶（見圖3），獲得與兩個基因有關(guān)的indel標(biāo)記（分別命名為elong-indel和alk-indel）。

實施例2：利用分子標(biāo)記制備富含萊菔子苷的花椰菜新種質(zhì)

1)根據(jù)萊菔子苷含量測定結(jié)果，選擇萊菔子苷含量高的青花菜自交系lbs(含量7.16μmol/g干重)與花椰菜自交系830配置雜交f1代種子，f1代植株自交得到f2代種子，播種f2代種子得到f2代植株；

2)在步驟1所述的f2代植株中選擇花球、株型和葉形均趨向于花椰菜的單株，利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對這些單株進行第一次前景選擇，獲得與青花菜親本lbs標(biāo)記帶型一致的f2代單株，以對應(yīng)的花椰菜親本830為輪回親本回交，獲得bc1f2代種子，播種bc1f2代種子得到bc1f2代植株；

3)在苗期，第二次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對步驟2所述的bc1f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本lbs標(biāo)記帶型一致的bc1f2代單株入選，定植于田間，經(jīng)過田間篩選，獲得與父本相似度較高的bc1f2代單株，這些單株再與輪回父本830回交，得到bc2f2代種子，播種bc2f2代種子得到bc2f2代植株；

4)在苗期，第三次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對對步驟3所述的bc2f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本lbs標(biāo)記帶型一致的bc2f2代單株入選，定植于田間，經(jīng)過田間篩選，獲得與父本相似度較高bc2f2代單株，這些單株再與輪回父本830回交，得到bc3f2代種子，播種bc3f2代種子得到bc3f2代植株；

在苗期，第四次利用與萊菔子苷合成基因有關(guān)的ssr標(biāo)記、elong-indel和alk-indel標(biāo)記對對步驟4所述的bc3f2代植株進行前景選擇，與青花菜親本lbs標(biāo)記帶型一致的bc3f2代單株入選，定植于田間，結(jié)合田間考種，獲得綜合經(jīng)濟性狀優(yōu)良與父本相似度最高bc3f2代單株，同時測定bc3f2代單株花球中的萊菔子苷含量，含量最高者入選，入選單株自交留種，后代穩(wěn)定表現(xiàn)的即為培育制備的高萊菔子苷含量花椰菜新種質(zhì)。