本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種細胞保存液，尤其涉及一種宮頸細胞保存液。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的HPV(人乳頭瘤病毒)分型檢測中，樣本處理是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接決定最終結(jié)果的準確性。目前的宮頸細胞保存液為生理鹽水，該細胞保存液的樣本處理存在如下所述的干擾因素：1、血樣標本，進行HPV檢測的樣本中約有三分之一的樣本為血性，紅細胞在提取DNA的過程中破裂后的主要成分為血紅蛋白等，血紅蛋白無法徹底去除，直接影響后續(xù)的PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))過程，對此過程產(chǎn)生抑制作用，造成結(jié)果假陰性。2、粘液樣本，進行HPV檢測的樣本中約有一半的樣本含有粘液。粘液的存在影響樣本的吸取過程，造成吸樣不足，造成假陰性。為此，現(xiàn)有的宮頸細胞保存液需要先進行洗脫處理后才能進行HPV檢測，使得處理過程變得繁瑣，一旦跳過洗脫處理，容易產(chǎn)生誤判從而對患者健康產(chǎn)生不利影響。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的PBS緩沖液細胞保存液需要先進行洗脫處理后才能進行HPV檢測的不足，提供一種宮頸細胞保存液。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種宮頸細胞保存液，其特征在于：包括PBS緩沖液、十二烷基三甲基氯化銨和蛋白酶K，所述十二烷基三甲基氯化銨先混入PBS緩沖液中形成初次保存液，所述十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比濃度為5-15％；所述蛋白酶K后混入所述初次保存液形成成品保存液，所述蛋白酶K與所述初次保存液的質(zhì)量體積比濃度為4-6mg/ml。所述PBS緩沖液為含0.05％吐溫-20的pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS-T).采用上述宮頸細胞保存液具有如下優(yōu)點：1、本發(fā)明的宮頸細胞保存液中的十二烷基三甲基組分可以破壞紅細胞起到溶血作用,蛋白酶K可以有效分解粘液,PBS緩沖劑可以起到保存宮頸細胞的作用。2、本發(fā)明的宮頸細胞保存液無需進行洗脫處理就可以直接進行檢測，并且檢測精度與現(xiàn)有宮頸細胞保存液洗脫后的檢測精度相當(dāng)，簡化了操作步驟，提高了HPV病毒的檢測效率。3、本發(fā)明的宮頸細胞保存液原料便宜易得,易于制備。附圖說明圖1為HPV.16+PCR擴增標準曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖2為分別使用廠家細胞保存液及本發(fā)明細胞保存液對HPV16+進行保存提取擴增得到的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖3為分別使用廠家細胞保存液及本發(fā)明細胞保存液對HPV18+進行保存提取擴增得到的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖4為分別使用廠家細胞保存液及本發(fā)明細胞保存液對HPV31+進行保存提取擴增得到的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖5為分別使用廠家細胞保存液及本發(fā)明細胞保存液對HPV58+進行保存提取擴增得到的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖6為分別使用廠家細胞保存液及本發(fā)明細胞保存液對HPVCP8304進行保存提取擴增得到的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)。圖7顯示了通過導(dǎo)流雜交法驗證型別鑒定試驗來驗證本發(fā)明所起到的作用。具體實施方式實驗例1實驗了宮頸細胞保存液中十二烷基三甲基氯化銨的質(zhì)量分數(shù)對紅細胞破碎效果和對HPV檢測結(jié)果的影響：實驗過程如下：由十二烷基三甲基氯化銨混入PBS緩沖液中形成初次保存液；PBS緩沖液為含0.05％吐溫-20的pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液。將含有不同質(zhì)量百分比的十二烷基三甲基氯化銨的初次保存液分別置于不同反應(yīng)容器中且清晰標記，從同一宮頸細胞樣本中分別取樣放入各自的反應(yīng)容器中，在相同條件下反應(yīng)后記錄反應(yīng)結(jié)果如下表；表1：反應(yīng)結(jié)果如表1所示：當(dāng)十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比為5％時溶血效果較好，并且對HPV的檢測結(jié)果無抑制現(xiàn)象，當(dāng)十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比為10％、15％時可以做到完全溶血并且對HPV的檢測結(jié)果無抑制現(xiàn)象，當(dāng)十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比為20％、25％時可以做到完全溶血，但對HPV的檢測結(jié)果有部分抑制現(xiàn)象，當(dāng)保存液中不含十二烷基三甲基時，完全沒有溶血并且對HPV的檢測結(jié)果完全抑制，綜上，優(yōu)選的十二烷基三甲基氯化銨的質(zhì)量百分比為5％-15％，最優(yōu)選的十二烷基三甲基氯化銨的質(zhì)量百分比為10％。實驗例2實驗了相同體積的含有質(zhì)量百分比為10％十二烷基三甲基氯化銨的初次保存液中，分別加入不同質(zhì)量的蛋白酶K，形成不同質(zhì)量體積比濃度的成品保存液對對粘液的處理效果和對HPV檢測結(jié)果的影響。實驗過程如下：在相同體積的含有質(zhì)量百分比為10％十二烷基三甲基氯化銨的初次保存液中，分別加入不同質(zhì)量的蛋白酶K，形成蛋白酶K與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度不同的多個成品保存液，置于不同反應(yīng)容器中標記清晰，從同一樣本中分別取樣放入各自的反應(yīng)容器中，在相同條件下進行反應(yīng)后，記錄反應(yīng)結(jié)果如表2；表2：蛋白酶K的質(zhì)量體積比濃度處理粘液的效果對HPV結(jié)果的影響(質(zhì)控IC點)1mg/mL不完全部分抑制2mg/mL不完全部分抑制3mg/mL完全部分抑制4mg/mL完全無抑制現(xiàn)象5mg/mL完全無抑制現(xiàn)象6mg/mL完全無抑制現(xiàn)象7mg/mL完全部分抑制8mg/mL完全部分抑制9mg/mL完全部分抑制反應(yīng)結(jié)果如表2所示：當(dāng)?shù)鞍酌窴與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度分別為4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml時，可以完全處理粘液并對HPV的檢測結(jié)果無抑制現(xiàn)象；當(dāng)?shù)鞍酌窴與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度分別為3mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml時可以完全處理粘液并對HPV的檢測結(jié)果有部分抑制現(xiàn)象；當(dāng)?shù)鞍酌窴與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度分別為1mg/ml、2mg/ml時，處理粘液并不完全并且對HPV的檢測結(jié)果有部分抑制；綜上所述，優(yōu)選的蛋白酶K與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度為4-6mg/ml，最優(yōu)選的蛋白酶K與初次保存液的質(zhì)量體積濃度比為5mg/ml。實驗例4實驗了本發(fā)明的宮頸細胞保存液(十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比為10％，蛋白酶K與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度為5mg/ml)在不洗脫的情況下對比現(xiàn)有技術(shù)的廠家宮頸細胞保存液(潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)的細胞保存液，主要成分：PBS)在洗脫的情況下熒光定量PCR技術(shù)驗證實驗中所產(chǎn)生的曲線及CT值是否有差別；實驗之前，需進行HPV.16+PCR擴增，得到標準曲線，如圖1所示。實驗時，用5例宮頸細胞血性樣本，分別采用本發(fā)明不洗脫、廠家細胞保存液洗脫操作，通過熒光定量PCR技術(shù)驗證使用本發(fā)明不洗脫與廠家細胞保存液洗脫兩種操作所產(chǎn)生的曲線及CT值有無差別，實驗結(jié)果如圖2-6所示，其中：橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為拷貝數(shù)；實驗結(jié)果表明，所示五例實驗中所產(chǎn)生的曲線與現(xiàn)有技術(shù)的基本重疊，說明本發(fā)明有效且不會抑制PCR過程。實驗例5實驗了本發(fā)明(十二烷基三甲基氯化銨在初次保存液中的質(zhì)量百分比為10％，蛋白酶K與初次保存液的質(zhì)量體積比濃度為5mg/ml)在不洗脫的情況下對比現(xiàn)有技術(shù)的廠家宮頸細胞保存液(潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)的細胞保存液，主要成分：PBS)在洗脫和不洗脫的情況下進行導(dǎo)流雜交法驗證型別鑒定試驗來驗證本發(fā)明所起到的作用，如圖7所示，該實驗結(jié)果由HPV探針薄膜分型示意圖表示，分型示意圖由四排六列的表格組成，表格的左上角為用于檢測膜條是否有效的Biotin點，Biotin點正下方的一個格子為檢測PCR過程中是否存在抑制物，擴增效率及DNA濃度的質(zhì)控IC點，其余每個格子各代表一種HPV病毒亞型。實驗結(jié)果將記載于探針膜條上，探針膜條上設(shè)有與分型示意圖相對應(yīng)的表格，Biotin點1與IC點2分別與HPV薄膜分型示意圖的表格位置相對應(yīng)，檢驗到的HPV病毒亞型所處的格子也與HPV探針薄膜分型示意圖相對應(yīng)。實驗后的探針膜條如圖7所示，一排共有五組實驗樣本1001-1005，其從左到右，第一至第四為樣本1001-1004，是含血樣本，第五為樣本1005，是不含血樣本，圖7中的三排分型示意圖分別對應(yīng)三種實驗情況，第一排為本發(fā)明的細胞保存液組不洗脫的實驗情況，第二排為現(xiàn)有技術(shù)的細胞保存液組洗脫后的實驗情況，第三排現(xiàn)有技術(shù)的細胞保存液組不洗脫的實驗情況，實驗結(jié)果的具體說明如下表3所示：實驗結(jié)果表明：本發(fā)明的細胞保存液的實驗情況和現(xiàn)有技術(shù)的細胞保存液洗脫后的實驗情況一致，而現(xiàn)有技術(shù)的細胞保存液組在不洗脫的情況下HPV檢測結(jié)果會被抑制。實驗結(jié)果表明了本發(fā)明的細胞保存液在免去洗脫步驟的條件下也能夠擁有和現(xiàn)有技術(shù)中的細胞保存液經(jīng)過洗脫處理后的HPV檢測精度。總結(jié)上述實驗例，本宮頸細胞保存液具有操作簡便，制備容易，對血性樣本和粘液樣本的處理效果較好且不會發(fā)生抑制現(xiàn)象的優(yōu)點。當(dāng)前第1頁1 2 3