本發(fā)明涉及一種植物組培繁殖技術(shù)，具體為一種珙桐高效誘導(dǎo)叢生芽的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

珙桐為落葉喬木?？缮L到15～25米高，葉子廣卵形，邊緣有鋸齒。色花奇美，是1000萬年前新生代第三紀(jì)留下的孑遺植物，在第四紀(jì)冰川時期，大部分地區(qū)的珙桐相繼滅絕，只有在中國南方的一些地區(qū)幸存下來，成為了植物界今天的“活化石”，被譽為“中國的鴿子樹”，又稱“鴿子花樹”、“水梨子”，野生種只生長在中國四川省和湖北省周邊地區(qū)。珙桐已被列為國家一級重點保護野生植物，為中國特有的單屬植物，屬孑遺植物，也是全世界著名的觀賞植物。

目前，珙桐的繁殖技術(shù)主要以播種育苗為主，但此方式存在以下不足：成苗周期長，出苗時間為3-10年；出苗率低、不整齊、易變異，對保存母株的優(yōu)良性狀有一定影響；同時需大量人力、物力及土地資源，生產(chǎn)成本高；綜上所述，尋找出苗快捷，生產(chǎn)成本低的珙桐組培快繁方式，推動產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有必要性。

西南師范大學(xué)鄒麗娟在《植物研究》發(fā)表的《瀕危植物珙桐的組織培養(yǎng)與植株再生》公開了一種采用珙桐側(cè)芽直接誘導(dǎo)叢生芽的快繁方法，但此方法存在外植體采集時間受限、誘導(dǎo)時間長的缺點，并且其增值率和增殖倍數(shù)都有一定的提升空間；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)夏晗發(fā)表的《珙桐初代培養(yǎng)研究》和湖北民族大學(xué)羅世榮發(fā)表的《珙桐芽體組織培養(yǎng)研究》中都提到以珙桐側(cè)芽為外植體進行芽誘導(dǎo)，但是都僅僅只能促使單芽萌發(fā)，不能誘導(dǎo)叢生芽。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種珙桐高效誘導(dǎo)叢生芽的組培快繁方法，其操作簡便，誘導(dǎo)速度快，增殖系數(shù)高。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種珙桐高效誘導(dǎo)叢生芽的組培快繁方法，包括以下步驟：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優(yōu)良、側(cè)芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入GA3溶液中進行浸泡，至珙桐側(cè)芽生長到3cm以上；

2)剪取側(cè)芽，進行消毒，然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養(yǎng)基內(nèi)；培養(yǎng)18-22d后芽點萌發(fā)生長，形成叢生芽。

對珙桐枝條進行采集及處理的時間為當(dāng)年的9月至次年的3月。

優(yōu)選的，對珙桐枝條進行采集及處理的時間為3月份。此時為側(cè)芽即將自然萌動時，萌發(fā)率，芽長生長快。

步驟1)中珙桐枝條是截取當(dāng)年生從上往下至第5個側(cè)芽的枝條。

步驟1)中浸泡時采用100mg/L的GA3溶液，每5天換一次溶液。

步驟2)中剪取的側(cè)芽含有1-2mm木質(zhì)部。

步驟2)中消毒時，先流水沖洗1h，采用質(zhì)量濃度0.4％洗衣粉浸泡4-6min，然后采用體積濃度75％酒精浸泡20s，無菌水沖洗2次，再用質(zhì)量濃度0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，最后無菌水沖洗4次即可。

培養(yǎng)的環(huán)境為溫度25±1℃、濕度75±2％、光照12-14h/d、光強1800-2200lx。

步驟1)中的浸泡過程在室外進行處理，GA3溶液高度4-6cm；浸泡部位為枝條基部。

所述的Wpm為木本植物培養(yǎng)基，其中大量元素10倍為：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍為：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；鐵鹽100倍為：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有機100倍為：鹽酸硫胺素VB1 0.1g/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.05g/L、煙酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

由于珙桐側(cè)芽存在長短枝現(xiàn)象，導(dǎo)致室內(nèi)培養(yǎng)時芽不伸長，不分化，浪費人力物力，也影響研究結(jié)果。本發(fā)明采取室外激素預(yù)處理方法，通過GA3進行浸泡預(yù)處理，能簡單有效甄別長短枝芽問題，還能一定程度上促進短枝芽萌發(fā)伸長，對珙桐側(cè)芽萌發(fā)有明顯促進作用，對芽伸長也有明顯的促進作用。

現(xiàn)行珙桐側(cè)芽誘導(dǎo)時都是采取剝芽后再誘導(dǎo)萌發(fā)伸長，而GA3溶液預(yù)處理，可減少實驗室剝芽環(huán)節(jié)，直接進行叢生芽誘導(dǎo)工序，從而減少了實驗過程中人力和物力的消耗，提高了工作效率，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

接種培養(yǎng)時采用的培養(yǎng)基能直接讓側(cè)芽誘導(dǎo)叢生芽，誘導(dǎo)時間縮短至20天，平均增值倍率為5.2。此培養(yǎng)基中是以KT為主要影響因素，同時降低瓊脂、蔗糖含量至3.5g、20g，并添加少量AC，能明顯促進珙桐側(cè)芽誘導(dǎo)叢生芽。

由于采用GA3預(yù)處理，打破休眠，促進生長；經(jīng)過多次試驗表明，KT對珙桐生長分化具有較強的促進作用；降低瓊脂、蔗糖濃度能加強培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分流動，促進其生長分化；實現(xiàn)直接誘導(dǎo)。采用本發(fā)明提供的珙桐叢生芽誘導(dǎo)技術(shù)，方法簡便，誘導(dǎo)周期短，繁殖系數(shù)高，對此國家一級珍稀瀕危植物保護具有一定的促進作用。

附圖說明

圖1為實施例2中珙桐帶側(cè)芽枝條室外激素浸泡處理的照片。

圖2為實施例2中處理后側(cè)芽接種7d時生長情況。

圖3為實施例2中處理后側(cè)芽接種15d時生長情況。

圖4為實施例2中處理后側(cè)芽接種30d時生長情況。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。

實施例1：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優(yōu)良、側(cè)芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入GA3溶液中進行浸泡，至珙桐側(cè)芽生長到3cm以上；

2)剪取側(cè)芽，進行消毒，然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養(yǎng)基內(nèi)；培養(yǎng)18-22d后芽點萌發(fā)生長，形成叢生芽。

實施例2：

1)選擇生長健壯、無病蟲害、性狀優(yōu)良、側(cè)芽形成且未展葉時的珙桐枝條為母株，加入100mg/L的GA3溶液中進行浸泡，每5天更換浸泡溶液，至珙桐側(cè)芽生長到3cm以上；如圖1所示；

2)剪取側(cè)芽，剪取時基部帶1-2mm木質(zhì)部，進行消毒，具體是先流水沖洗1h，0.4％洗衣粉浸泡4-6min，后在操作臺進行75％酒精浸泡20s，無菌水沖洗2次，0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，無菌水沖洗4次，完成消毒工序；然后接種于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培養(yǎng)基內(nèi)；培養(yǎng)環(huán)境為溫度25±1℃、濕度75±2％、光照12-14h/d、光強1800-2200lx的恒定溫濕度的培養(yǎng)室內(nèi)；培養(yǎng)5-7d后側(cè)芽基部開始膨脹，側(cè)芽繼續(xù)伸長，培養(yǎng)10-14d后側(cè)芽基部產(chǎn)生3-7個芽點，18-22d后芽點芽點萌發(fā)生長，形成叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率達92％，平均增值倍數(shù)為5.2，如圖2-4所示。

所述的Wpm為木本植物培養(yǎng)基，其中大量元素10倍為：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍為：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；鐵鹽100倍為：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有機100倍為：鹽酸硫胺素VB1 0.1g/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.05g/L、煙酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

GA3溶液濃度的優(yōu)化：

選擇生長健壯、無病蟲害等性狀優(yōu)良的珙桐為母株，當(dāng)側(cè)芽形成且未展葉時截取當(dāng)年生從上往下至第5個側(cè)芽的枝條為實驗材料，每10個枝條為一捆用橡皮筋箍緊，用清水、10mg/LGA3、100mg/L GA3、500mg/L GA3四種處理進行浸泡，5d換一次溶液，10d后進行統(tǒng)計萌發(fā)生長情況見表1。

表1

由表一可得GA3對珙桐側(cè)芽萌發(fā)有明顯促進作用，對芽伸長也有明顯的促進作用，最佳處理為100mg/LGA3溶液處理。

對珙桐誘導(dǎo)叢生芽的組培快繁技術(shù)的操作時間的優(yōu)化：

側(cè)芽形成、膨大到展葉的時間周期為當(dāng)年9月至次年3月，為了找出最佳采集時間，在9、10、11、12、1、2、3月的10號分別按上述方法采集珙桐帶側(cè)芽枝條，用100mg/LGA3溶液浸泡處理，5d換一次溶液，10d后對側(cè)芽萌發(fā)生長情況進行統(tǒng)計見表2。

表2

由表2可知在側(cè)芽形成到展葉的7個月中使用GA3室外處理都能有效促使側(cè)芽萌發(fā)及伸長，其中最佳采集和處理時間為3月側(cè)芽即將自然萌動時，萌發(fā)率達100％，平均芽長為3.9cm。

上述的實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，而不應(yīng)視為對于本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以權(quán)利要求記載的技術(shù)方案，包括權(quán)利要求記載的技術(shù)方案中技術(shù)特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。