本發(fā)明屬于綿羊冷凍精液
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種通過(guò)添加谷胱甘肽(GSH)和過(guò)氧化氫酶(CAT)，有效保護(hù)綿羊精子在冷凍、解凍過(guò)程中受到氧化損傷，提高精子解凍后活力與延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，從而達(dá)到受精受胎的目的的一種含谷胱甘肽和過(guò)氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法。
背景技術(shù)：
：在過(guò)去的50年中冷凍精液技術(shù)迅猛發(fā)展，不同動(dòng)物的精液冷凍都獲得了較快的進(jìn)展，牛的冷凍精液已經(jīng)進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化。綿羊的精子與其他家畜相比具有一定生理特性，冷凍后活力低、受胎率低，且不穩(wěn)定，成為制約綿羊冷凍精子發(fā)展的桎梏。為了提高綿羊冷凍精液解凍后活力以及存活時(shí)間，提升綿羊冷凍精液品質(zhì)，研究開(kāi)發(fā)了添加抗氧化劑GSH和CAT的綿羊冷凍精液的制備方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種含谷胱甘肽和過(guò)氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，該技術(shù)原理是利用抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)和過(guò)氧化氫酶(CAT)能夠抵抗攜帶有自由基的活性氧族(ROS)特點(diǎn)，在綿羊精子冷凍的過(guò)程中添加GSH和CAT，降低活性氧族對(duì)綿羊精子造成的過(guò)氧化損傷的作用，從而提高解凍后精子活力和延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，達(dá)到受精受胎的目的。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種含谷胱甘肽和過(guò)氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，其特征在于：它包括以下步驟：(1)、谷胱甘肽GSH液和過(guò)氧化氫酶CAT液的配置：稱取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；稱取4.2mg的過(guò)氧化氫酶CAT加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；(2)、谷胱甘肽GSH液和過(guò)氧化氫酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一月；過(guò)氧化氫酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一周；(3)、花生凝集素FITC-PNA染液的配置：將1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS緩沖液中，然后分裝避光保存在-20℃；(4)、PVP液的配置：3gPVP溶于100mlPBS緩沖液中；(5)、PBS緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超純水溶解，定容到1L，將溶液的酸堿度調(diào)到pH＝7.4；0.22μm濾器過(guò)濾分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?6)、Tris-A、Tris-B的配置：超純水超純水(7)、精液檢查：①外觀評(píng)定1)射精量：采精后，將綿羊精液倒入有刻度的離心管中觀察即可；2)云霧運(yùn)動(dòng)：用肉眼觀察新采的公綿羊精液，可以看到由精子活動(dòng)所引起的翻騰滾動(dòng)極似云霧狀；精子的密度越大，活力越強(qiáng)者，其云霧狀越明顯；3)色澤：綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；②活力檢測(cè)用移液器從1)的離心管中取適量綿羊精液滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，活力≥0.6進(jìn)行冷凍；(8)、綿羊精液的抗生素添加與濃度測(cè)定①綿羊精液經(jīng)過(guò)上述步驟(7)檢查完后，1ml綿羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg慶大霉素；②將添加好抗生素的綿羊精液用50μm精液過(guò)濾器過(guò)濾至新的離心管中，過(guò)濾后使用密度儀檢測(cè)原精實(shí)際濃度；(9)、添加抗氧化劑冷凍精液的制備：①在TrisA、TrisB中添加抗氧化劑，添加比例為：1mlTrisA分別添加10μlGSH、5μlCAT，1mlTrisB分別添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化劑后，將TrisA、TrisB各自混合均勻，放在4℃平衡90分鐘；②取步驟(8)測(cè)完濃度的綿羊精液，按照精子終濃度計(jì)算所需總體積的一半加入等溫的TrisA進(jìn)行稀釋，然后用8-10層紗布包裹放到4℃平衡；③精子4℃平衡，2h后，加入與Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次間隔15分鐘等量加入離心管中，每次添加后顛倒輕輕搖勻；④裝管和冷凍保存：精子搖勻，按每支250μl，500萬(wàn)精子裝管，將冷凍精液擺放到冷凍搓板上，然后放入冷凍儀中，按照冷凍儀操作規(guī)程進(jìn)行凍精操作，最后將凍精投入液氮保存；(10)、冷凍精液各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)：①凍后活力檢測(cè)：取一支上述步驟(9)制備的綿羊凍精，在35℃溫水浴中解凍后進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管取15μl樣品滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域，一個(gè)壓片取5個(gè)視野，中間1個(gè)，四周各取1個(gè)，分別計(jì)數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計(jì)算活力；活力＝活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和②凍后存活時(shí)間：取一支性控凍精上述步驟(9)制備的綿羊凍精，解凍方法同上，解凍后的樣品在37℃環(huán)境下避光保存，4小時(shí)后將細(xì)管中精液轉(zhuǎn)置于1.5ml離心管，用移液器從離心管取15μl樣品滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，在顯微鏡自然下光觀察精子存活情況，計(jì)數(shù)方法同上；③凍后精子頂體完整性檢測(cè)：取一支上述步驟(9)制備的綿羊凍精，解凍方法同上，放到含3％等溫PVP液的離心管內(nèi)，800×g離心6min，棄上清液；沉淀精子用37℃按照步驟(5)配置的PBS緩沖液重懸，調(diào)整精子密度為1～2×106/mL，移液槍吸取30μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮濕環(huán)境下孵育30min，之后再用PBS緩沖液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，無(wú)色指甲油封片后，用400×熒光顯微鏡觀察。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：利用GSH和CAT能夠抵抗攜帶有自由基的活性氧族(ROS)特點(diǎn)，在綿羊精子冷凍、解凍的過(guò)程中添加GSH和CAT，降低活性氧族對(duì)綿羊精子造成的過(guò)氧化損傷的作用，有效保護(hù)綿羊精子冷凍、解凍過(guò)程中精子生理機(jī)能，從而提高解凍后綿羊精子活力和延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，達(dá)到提高受胎率的目的。具體實(shí)施方式實(shí)施例：一種含谷胱甘肽和過(guò)氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，以綿羊冷凍精液為例，它包括以下步驟：1、谷胱甘肽GSH液和過(guò)氧化氫酶CAT液的配置：稱取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；稱取4.2mg的過(guò)氧化氫酶CAT加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；2、谷胱甘肽GSH液和過(guò)氧化氫酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一月；過(guò)氧化氫酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一周；3、花生凝集素FITC-PNA染液的配置將1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS緩沖液中，然后分裝避光保存在-20℃；4、PVP液的配置3gPVP溶于100mlPBS緩沖液中；5、PBS緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超純水溶解，定容到1L，將溶液的酸堿度調(diào)到pH＝7.4；0.22μm濾器過(guò)濾分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?、Tris-A、Tris-B的配置超純水超純水7、精液檢查(1)外觀評(píng)定1)射精量：采精后，將綿羊精液倒入有刻度的離心管中觀察即可；2)云霧運(yùn)動(dòng)：用肉眼觀察新采的公綿羊精液，可以看到由精子活動(dòng)所引起的翻騰滾動(dòng)極似云霧狀；精子的密度越大，活力越強(qiáng)者，其云霧狀越明顯；3)色澤：綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；(2)活力檢測(cè)用移液器從上述步驟(1)的離心管中取綿羊精液滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，活力≥0.6進(jìn)行冷凍；8、綿羊精液的抗生素添加與濃度測(cè)定①綿羊精液經(jīng)過(guò)上述步驟(7)檢查完后，1ml綿羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg慶大霉素；②將添加好抗生素的綿羊精液用50μm精液過(guò)濾器過(guò)濾至新的離心管中，過(guò)濾后使用密度儀檢測(cè)原精實(shí)際濃度，羊1濃度為7.2億/ml，羊2濃度為10.95億/ml；9、添加抗氧化劑冷凍精液的制備(1)在TrisA、TrisB中添加抗氧化劑，添加比例為：1mlTrisA分別添加10μlGSH、5μlCAT,1mlTrisB分別添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化劑后，將TrisA，TrisB各自混合均勻，放在4℃平衡90分鐘；(2)取步驟8測(cè)完濃度的羊1、羊2鮮精各1ml，按照精子終濃度2千萬(wàn)/ml計(jì)算所需總體積，羊1體積為7.2÷0.2＝36ml，羊2體積為10.95÷0.2＝54.75ml，羊1加入(36ml-1ml)÷2＝17.5ml，羊2(54.75ml-1ml)÷0.2＝26.875ml等溫的TrisA進(jìn)行稀釋，然后用8-10層紗布包裹放到4℃平衡；(3)精子4℃平衡2h后，加入與Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次加入，羊1每次加入17.5÷2＝8.75ml，羊2每次加入26.875÷0.2＝13.437ml，兩次間隔15分鐘等量加入離心管中，每次添加后顛倒輕輕搖勻；(4)裝管和冷凍保存：精子搖勻，按每支250μl，500萬(wàn)精子裝管，將冷凍精液擺放到冷凍搓板上，然后放入冷凍儀中，按照冷凍儀操作規(guī)程進(jìn)行凍精操作，最后將凍精投入液氮保存；10、冷凍精液各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)：取1支按照上述方法添加抗氧化劑GSH和CAT生產(chǎn)的綿羊冷凍精液，解凍后進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)，與此同時(shí)，取同一羊號(hào)按照常規(guī)方法不添加抗氧化劑GSH和CAT生產(chǎn)的綿羊冷凍精液作為質(zhì)量指標(biāo)對(duì)照，綿羊凍精的產(chǎn)品規(guī)格均為0.25ml；鏡檢：各質(zhì)檢指標(biāo)計(jì)算方法如下：(1)凍后活力檢測(cè)：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，在35℃溫水浴中解凍后進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管取10μl樣品滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域，一個(gè)壓片取5個(gè)視野，中間1個(gè)，四周各取1個(gè)，分別計(jì)數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計(jì)算活力；活力＝活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和(2)凍后存活時(shí)間：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，解凍方法同上，解凍后的樣品在37℃環(huán)境下避光保存，4小時(shí)后將細(xì)管中精液轉(zhuǎn)置于1.5ml離心管，用移液器從離心管取10μl樣品滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，在顯微鏡自然下光觀察精子存活情況，計(jì)數(shù)方法同上；綿羊1精子活力與存活時(shí)間分組0h6h12h對(duì)照組40.7％(665/1633)17.2％(163/950)0(0/1022))添加組41％(734/1786)28.8％(262/978)9.5％(144/1515)綿羊2精子活力與存活時(shí)間分組0h6h12h對(duì)照組54％(713/1318)32％(290/899)4.7％(36/760)添加組55％(756/1373)46％(354/765)17.7％(214/1205)(3)凍后精子頂體完整性檢測(cè)：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，解凍后精液放到含3％等溫PVP液的離心管內(nèi)，800×g離心6min，棄上清液；沉淀精子用37℃的PBS緩沖液重懸，調(diào)整精子密度為1～2×106/mL；移液槍吸取30μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮濕環(huán)境下孵育30min；之后再用PBS緩沖液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，無(wú)色指甲油封片后，用400×熒光顯微鏡觀察。羊1、羊2精子解凍后0h的精子頂體完整率分組羊1頂體完整率羊1頂體完整率對(duì)照組64％77％添加組66％73％當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3