本發(fā)明涉及一種青蒿繁殖方法，更具體的說涉及一種青蒿可持續(xù)定向雜交育種制種方法及應用。

技術背景

青蒿(artemisia annuaL.)，又名黃花蒿，為菊科艾屬一年生草本植物，傳統(tǒng)中藥，具有清熱解暑、除蒸、截瘧的作用，其葉片及花蕾提取青蒿素，為青蒿素類藥物的唯一商用原料來源。青蒿株高100-400厘米，全株具有較強的揮發(fā)油氣味。莖直立，具縱條紋，多分枝，光滑無毛?；~平鋪地面，開花時凋萎；莖生葉互生，幼時綠色，老時變?yōu)辄S褐色，無毛，有短柄，向上漸無柄；葉片通常為一回羽狀全裂，裂葉短細，有極小粉末狀短柔毛，上面深綠色，下面淡綠色，具細小的毛或粉末狀腺狀斑點；葉軸兩側具窄翅；莖上部的葉向上逐漸細小呈條形。中、晚秋開小黃花，頭狀花序，細小(直徑2-3mm)，球形，具細軟短梗，由大約30朵小花聚合組成圓錐狀；小花為管狀花，黃色，外圍為雌花，中間為兩性花；瘦果，橢圓形。

青蒿廣泛分布于世界及我國各地，但品質地域屬性極強，世界上絕大多數地方的青蒿因品質低而無利用價值。我國是黃花蒿資源大國，尤其武陵山區(qū)的重慶、湖南、廣西等地區(qū)，品質含量高、資源豐富而獨特。為此，在這些地區(qū)，青蒿種植規(guī)模已超10萬畝，為世界抗瘧做出了不可替代的貢獻，也為“中國中藥”樹立了良好形象。

青蒿栽培以種子繁殖為主。以重慶和廣西為例，從10月下旬至l1月上旬種子采收至次年5月中旬前都可播種。種子發(fā)芽正常，說明無休眠期。但以2月中旬至3月中旬播種為最佳。該時期發(fā)芽率高，出苗整齊，4月上旬以后種子發(fā)芽力迅速遞減。18～25℃是種子發(fā)芽的適宜溫度。8月中旬至9月上旬為花蕾期。頭狀花序黃綠色，極多數，球形，長及寬約1.5mm，有短梗，排列成復總狀或總狀，常有條形苞葉，總苞片2～3層，外層狹矩圓形，內層橢圓形，花托長圓形，花筒狀，外層雌性，內層兩性。10月上旬左右形成果實，瘦果矩圓形，長不超過1mm，無毛。10月中、下旬，種子成熟，每克種子超過3萬粒。商品葉采收生育期210-240天。

青蒿栽培歷史尚短，育種研究、種質資源和品種積累等各方面都十分薄弱，遠落后于一般農作物。青蒿為典型的異化授粉，自花(包括無性系的植株個體之間)不結實，種子為異質雜交而得。青蒿花器官極小，肉眼不能操作，因而人工育種困難。目前青蒿栽培用種，多直接采自于野生種質，或大田群體篩選。野生或大田篩選都為群體自然雜交，授粉混亂，子代品質(青蒿素含量)性狀變異極大，農藝性狀不穩(wěn)定，這導致育種和品種資源保存的困難，優(yōu)良性狀因繁育制種過程而易迅速退化。同時，自然雜交要求親本花期必須完全相同，而具有不同優(yōu)良性狀或來源于不同生態(tài)地域的種質的生長期往往差異較多，加之傳粉空間距離的限制，優(yōu)良性狀聚結的機率小，選育種的工作效率低。種源現狀，成為青蒿產業(yè)瓶頸。

青蒿是嚴格的短日照植物，通過短日照處理，可以誘導開花；而在長日照條件下，能夠保持營養(yǎng)生長狀態(tài)而長時間存活。所謂短日照植物，是指給與比臨界暗期(critical dark period)長的連續(xù)黑暗下的光周期時，花芽才能形成或促進花芽形成的植物；在自然界中，在日照比較短的季節(jié)里，花芽才能分化，例如菊花、水稻、牽?；ā⑸n耳、大豆等，都是屬于短日照植物。即使日照較短，假如隨后的暗期短于臨界暗期，花芽仍不能形成，或即使給與足夠的暗期，但在中途適當的時間進行短時間的光照(光中斷)時，花芽也不能分化。光周期敏感的青蒿種質，當光周期約小于13.5h時，半月之內就會開花。

技術實現要素：

長期以來青蒿育種制種都是采用群體自然雜交。群體自然雜交，不僅要求親本花期相同，而且授粉混亂不可控而子代遺傳性狀不一致；同時，青蒿為一年生草本，株體存活僅一年，育種制種利用也僅一次(一年開花結實僅一次)，優(yōu)質種質材料在育種制種后因衰老枯亡而難再留存。為克服這些問題，本發(fā)明可定向選擇具有目標性狀的青蒿植株作為親本，基于青蒿短日照植物的特性，調控光周期控制青蒿開花，延續(xù)青蒿存活期，提供了一種可反復進行多次的全新的青蒿雜交育種制種方法。具體為：

1)親本植株的選擇、培育和保存。定向選擇親本材料(如高含量、高產能)，或實生苗或扦插苗，父本母本至少各培育一株。為避免自花不育，親本材料要求具有一定異質性，即互不為同一無性系的個體。在青蒿植株第二次分枝前，全株置于強度500-5000Lx每天15-24h的光照環(huán)境中，抑制花芽分化，使其持久保持在營養(yǎng)生長狀態(tài)。

2)誘導開花。在第二次分枝后任意時間(最好三級分枝后)，選生長健康的親本各一株，將兩植株整體或各自任一健康枝條，置于同一個封閉空間內，每天光照8-11h(保持黑暗16-13h)，誘導開花。誘導開花一般采用枝條而非整株，這是因為其余枝條仍可繼續(xù)保持在原光照條件下維持營養(yǎng)生長狀態(tài)，使親本資源得以續(xù)存保持并可持續(xù)利用；同時，為確保錯花期的種質材料間成功雜交，可多選枝條分別按時間序列(每隔2d)依次進行誘導開花。

3)授粉雜交。開花后，繼續(xù)在封閉空間內(避免外來花粉)，將兩個親本花枝相互交叉、抖動，使彼此互相授粉，結實。

4)收獲全同胞種子。待籽粒成熟后，按及時剪除枝條，收集種子。同一枝條的種子，屬全同胞家系，記錄下其父本母本。

一種專應用于青蒿枝條間雜交育種制種的專用裝置，調控光照周期，并隔絕外來花粉。所述裝置由暗室支撐架組成，支撐架由支撐座、支撐柱和支撐桿組成；支撐柱為垂直的柱體結構，下端固定連接在支撐座的上部，支撐桿的一端與支撐柱上下滑動連接，并可通過螺絲固定，另外一端固定在暗室的后部或底部；暗室由完全避光的材料制成，由室體、遮光蓋)、枝條孔和遮光布組成；室體、遮光蓋和遮光布密封后構成一個封閉的閉光空間。所述室體與遮光蓋通過鉸鏈轉動連接，室體的兩側設置有用于青蒿枝條穿過的枝條孔，枝條孔的外側設置用于封閉枝條孔的遮光布。

上述任一項所述的青蒿雜交育種制種方法在青蒿良種選育中的應用。

與青蒿傳統(tǒng)育種、制種相比，本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明提供的方法，①選擇青蒿植株的枝條，通過控制光周期誘導開花，讓育種制種可多次、反復進行，不受一年僅一次及季節(jié)約束。②選擇(控制)親本，人為定向育種，使不同優(yōu)良性狀可以定向集結于子代，尤其高品質、高產能和耐逆性等性狀的結合；同時，控制光周期誘導開花，擴大了雜交親本選擇范圍，使自然條件下原本花期不同的種質之間的也可雜交，創(chuàng)新種質材料，提高育種效率，大大增加高品質且兼具多優(yōu)良農藝性狀的超級品種育成的可能性。③獲得遺傳性狀一致的青蒿全同胞家系子代種子(材料)，制種環(huán)節(jié)則可提高生產用種純度，減少青蒿原料中品質變異幅度，降低青蒿素加工環(huán)節(jié)生產成本。④讓青蒿植株的枝條選擇性開花雜交，其余株體(枝條)繼續(xù)存活，單一植株能被持續(xù)育種利用，優(yōu)質資源在利用的同時也得以保存。

說明書附圖

圖1青蒿可持續(xù)定向雜交育種制種的專用裝置結構示意圖1；

圖2青蒿可持續(xù)定向雜交育種制種的專用裝置結構示意圖2；

圖3青蒿定向雜交示意圖；

1-1支撐座、1-2支撐柱，1-3支撐桿，2暗室，2-1室體，2-2遮光蓋，2-3枝條孔，2-4遮光布。

具體實施方式

實施例1光周期對青蒿開花和生育進程的影響

青蒿試驗材料：兩種青蒿種質材料，晚熟的紫桿青蒿，早熟的綠桿青蒿。紫色莖桿種子采自重慶酉陽大田群體；綠色莖桿初采自廣西陽朔野生群體，經西南大學試驗農場2年馴化栽培。

1長日照對青蒿花芽分化抑制作用

長日照試驗處理：試驗在西南大學試驗網室進行。用遮光材料在網室圍建A、B兩個分隔的光周期處理區(qū)，阻隔干擾光源。A區(qū)為對照，自然日照，每日光照時長大致11～13h；B區(qū)為長日照處理，除自然日照外，另加2000Lx人工光源，于每日15:00～24:00期間補照7h，使日照時長超16h。

分別取紫桿、綠桿種子，同時(1月20日)分別在A、B區(qū)播種育苗若干。青蒿幼苗在第一次分枝前(3月15日)，移植盆栽。每盆裝土10kg,拌土基施15-15-15復合肥15g和150有機質，定植1株。A區(qū)、B區(qū)各分別放置紫桿、綠桿青蒿植株100盆。青蒿生長期間溫度大致在15℃～30℃，相對濕度60％～90％，自然降雨并輔以灌溉。觀察記錄生育進程，結果見表1。

在青蒿植株出現第一級分枝(3月25日)、第二級分枝(5月1日)、第三級分枝(6月5日)時期，分別將A(B)區(qū)植株各取5盆(株)轉移到B(A)區(qū)。觀察記錄轉移植株生育進程，結果見表2。

表1光周期對青蒿生育進程的影響

在對照(A)區(qū)處于自然光照周期條件下的兩種質青蒿雖花期相錯，但都先后開花、結實、衰老枯死；而B區(qū)處于長日照(16h)處理的兩種質青蒿不僅當年未開花，第二年依然未開花，青蒿持續(xù)維持營養(yǎng)生長狀態(tài)，直到試驗結束為止，歷經600多天，生育期由一年生轉為多年生。表明長日照抑制花芽分化，青蒿一直在長日照下，持久營養(yǎng)生長狀態(tài)，這為青蒿種質、優(yōu)良性狀和品種的保存和利用提供了思路。

表2反映青蒿對光周期敏感有生育期限制。由A區(qū)轉移到B接受長日照的植株中，轉移時期不同而結果不同，第一級分枝期轉移的植株不開花、不衰老枯死，第二級分枝期則部分枝條開花、枯死，而另一部分未開花、不衰老；第三級分枝期，則長日照已不再具有作用效果。說明長日照須在第二級分枝時期以前開始進行方能有效抑制花芽分化。由長日照轉移到短日照(B轉移到A)，各分枝時期都一致，青蒿現蕾、開花、結實與自然日照處理狀態(tài)完全一致。

試驗中還觀察到，15℃-30℃、濕度60-90％是青蒿適宜的生長條件。在15℃-30℃溫度范圍內，偏高的溫度利于青蒿生物量的增長，但偏低的溫度有利于青蒿緩慢生長而維持持久的營養(yǎng)狀態(tài)，即偏低溫度更利于種質材料保存。

表2青蒿光周期的效應期

2短日照誘導花芽分化

選試驗組1中B區(qū)(長日照下未花芽分化)的青蒿植株的枝條為材料，進行短日照誘導開花試驗。10月開始分次用專用裝置(見附圖)遮光處理，同一株青蒿每次2-3枝，平行處理3-5株，遮光時間為17:00～8:00(黑暗15h，光照9h)。以同株未遮光枝條和未作處理植株為對照，觀察枝條生育進程。結果見表3。試驗表明，短日照(光照時長9h)能有效誘導花芽分化，遮光后，枝條15-25天后即出現花蕾，全部開花，完成生命周期并按期衰老枯死；但是，遮光枝條以外的同株體其余未遮光枝條以及主莖和根，與未處理植株一樣，未見花蕾和花，持續(xù)處于營養(yǎng)生長狀態(tài)(不衰敗)。溫度對花芽分化有一定影響，偏低的溫度(第3次遮光)比偏高的溫度(第1次遮光)蕾和花出現明顯慢一些。不同種質對遮光(短日照)敏感性不同，響應速度也存差異。

表3枝條遮光(短日照)誘導開花試驗結果

3臨界光周期及光照強度的考察

選取試驗組1中B區(qū)的部分青蒿植株(未開花、營養(yǎng)生長狀態(tài)良好)，于10月3日(自然光照下綠桿青蒿花期已過而紫色青蒿進入始花期)，轉移至溫室。溫室基礎光照2000Lx 12h，溫度20℃～27℃，相對濕度大致60％～90％。

設置光照時長和強度2因素試驗方案：溫室分隔3個獨立盆栽區(qū)，在2000Lx 12h基礎上，分別采用人工點光源，增加光照時長0h、1h、2h，即光周期分別為12h、13h、14h；調節(jié)植株與點光源距離設置點光源的光照強度：5000Lx、2000Lx、500Lx、250Lx。觀察植物花蕾、開花等生育進程，結果見表3。

結果表明這兩青蒿種質的臨界光周期大致都為13h。12h日照使青蒿重新開花，而≥14h日照則抑制青蒿花芽分化。抑制開花的長日照必須滿足一定強度(500Lx～5000Lx)，但過強的光也會引起青蒿植株的老化和枯敗。

表3臨界光周期與光照強度的效果

實施例2種質材料保持方法對青蒿花粉活力及柱頭可授性的影響

在實施例1研究基礎上，利用青蒿植株為短作物光周期的生理特性，針對特定青蒿植株，選擇同一品種的6株長勢相近的植株，取任意植3株作為對照組，另外3植作為實驗組。實驗組采用在環(huán)境溫度20-30℃,環(huán)境濕度60-80％，光照強度1000Lx,光照時長17h。青蒿植株保持種質材料，選擇任意一株青蒿植株，在植株不開花保持100d、200d、300d、400d、500d、600d時，分別選擇不同的枝條檢測該植株花的花粉活力和柱頭可授性，并在檢測完成后，立即剪除該枝條，該植株的其他部分繼續(xù)在原環(huán)境中生長。對照組在正常條件下種植，在正常花期檢測花粉活力和柱頭可授性。

花粉活力的檢測為：將一個分支枝條置于同一封閉透明環(huán)境封閉中；每天光照兩株青蒿枝條每天光照8-11h，保持黑暗16-13h，誘導枝條開花；本植株的其他部分繼續(xù)在原保持環(huán)境中生長。于盛花期采集己完全開放的花序，然后將各自的半數花序放置于含有硅膠的干燥器中干燥2h后，再用毛筆將花粉刷落至白板紙上。將從新鮮花序上采集的鮮花粉和干燥花序上采集的干燥花粉分別分成9等份，采用聯苯胺-甲萘酚染色法快速測定花粉的活力。

柱頭可授性的測定為：在該枝條的盛花期，將開花后不同天數的青篙用解剖針將外輪小花和中央小花分類，然后將其完全浸泡在含聯苯胺-過氧化氫反應液(1％聯苯胺，3％過氧化氫，水的體積比例為4:11:22)的凹而載玻片中的部位.若柱頭具有可授性，凹面載玻片周圍的反應液則呈現藍色并伴有氣泡出現，如無氣泡產生且未見藍色，則柱頭無可授花)，可通過比較其氣泡量的多少和大小來衡量其可授性的強。本實驗分別對青篙的邊花(單性雌花)和中央小花(兩性花)的柱頭可授性進行了觀察，每次3朵小花，重復3次，先測定出青篙小花從開花到謝花期間柱頭可授性的變化，確定出小花開花后柱頭可授性的高峰期；再在高峰期檢測其柱頭1d之內的可授性變化。

測定完花粉活力和柱頭可授粉性后，立即切除該枝條。其他枝條任保持在原保持環(huán)境中繼續(xù)生長。以便進行下一次檢測。不同保持時間對花粉活力的影響見表4，柱頭可授性結果見表5所示。

表4不同保持時間對花粉活力的影響

表5不同保持天數對柱頭可授性的影響

注：+表示柱頭具有可授粉性，++；表示柱頭具有較強可授粉性；+++表示柱頭具有強可授粉性。

表4、5顯示，同一種質青蒿，在不同保存時間點上對選定枝條進行黑暗誘導的花，其有性繁殖特性，沒有受到保存時間和誘導的影響。

實施例3青蒿雜交考察

如圖1、2所示，本發(fā)明提供的應用于青蒿雜交授粉的專用裝置，由暗室2支撐架組成，支撐架由支撐座1-1、支撐柱1-2和支撐桿1-3組成；支撐柱1-2為垂直的柱體結構，下端固定連接在支撐座1-1的上部，支撐桿1-3的一端與支撐柱1-2上下滑動連接，并可通過螺絲固定，另外一端固定在暗室2的后部或底部。暗室2由完全避光的材料制成，由室體2-1、遮光蓋2-2、枝條孔2-3和遮光布2-4組成；室體2-1、遮光蓋2-2和遮光布2-4密封后構成一個封閉的閉光空間。室體2-1與遮光蓋2-2通過鉸鏈轉動連接，室體2-1的兩側設置有用于青蒿枝條穿過的枝條孔2-3，枝條孔2-3的外側設置用于封閉枝條孔2-3的遮光布2-4。

在使用時，分別將兩株將需要進行雜交的從兩個枝條孔2-3插入暗室2中，并用遮光布2-4密封枝條孔2-3。將整株青蒿至于原環(huán)境中，根據光照和避光的需要開關遮光蓋2-2，控制對青蒿枝條的光照，促使該特定枝條花枝分化，開花雜交。

將實施例1保持在長日照B區(qū)的青蒿取兩株，分別在保存300d和500d時選定生長狀態(tài)良好的枝條進行誘導開花和雜交，采用本專利提供的特定裝置控制光照，暗室2內的枝條每日光照時長10h,光照強度2000Lx。暗室內的青蒿在兩周出現花蕾，再兩周后開花，經授粉，在花凋謝1個月后鏡檢確定結籽。將上述兩株青蒿植株制備的兩組青蒿種子進行播種試驗，證明在300d和500d條件下制作的種子發(fā)芽率與普通青蒿種子無差別。