本發(fā)明屬魚類生物工程與細胞工程遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及選育純系黃顙魚全雌魚及超雄魚大規(guī)模生產(chǎn)全雄魚的方法。
背景技術(shù)：
黃顙魚從純屬野生轉(zhuǎn)為全人工繁養(yǎng)，至今已有20年歷史。期間，凡長速快、個體大的成魚多數(shù)被人們吃掉了，唯有魚篩底下長速慢、個體小的級外魚（“毛毛魚”）留下來繼續(xù)養(yǎng)殖一年而供給黃顙魚孵化場作繁殖用的母魚，用以生產(chǎn)黃顙魚普通苗或全雄苗，加上近親繁殖，年復(fù)一年，種質(zhì)一代不如一代；另外，普通黃顙魚雌雄各半，雄魚個體與生長速度是雌魚的2—3倍。雖然近五年來國內(nèi)開始興起全雄魚養(yǎng)殖，但生產(chǎn)全雄苗所用的超雄魚YY♂供應(yīng)緊張，價格昂貴，甚至不予外供，社會上種質(zhì)混雜，不少人以假亂真，而檢測技術(shù)僅掌握在少數(shù)人之手，普通苗場及廣大養(yǎng)戶很難對親本YY♂及全雄苗XY♂進行檢測鑒定。如此種種，均成為黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。因此，有必要對黃顙魚種質(zhì)進行提純復(fù)壯生產(chǎn)純系黃顙魚全雌魚、超雄魚供應(yīng)各孵化場作繁殖純系全雄苗親本；大規(guī)模生產(chǎn)純系全雄苗供應(yīng)廣大養(yǎng)戶大面積養(yǎng)殖商品魚。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要提供選育純系黃顙魚全雌魚及超雄魚大規(guī)模生產(chǎn)全雄魚的方法。包括以下步驟：
（1）建立純系黃顙魚種質(zhì)庫：在長江水系篩選個體大、性狀優(yōu)良的野生黃顙魚成熟親魚，通過人工雌核發(fā)育，生產(chǎn)純系全雌子代XX♀，開口四天后，提取部分子代苗獨立投喂17α—甲基睪酮藥餌或藥蟲，將其轉(zhuǎn)性為生理雄魚XX♂，與全雌魚XX♀分別獨立培育至性成熟，XX♀與XX♂交配，規(guī)模擴繁純系全雌魚種群；
（2）應(yīng)用GMT技術(shù)和測交技術(shù)研制黃顙魚超雄魚YY♂和超雄生理雌魚YY♀：純系全雌魚XX♀與野生原系雄魚XY雜交，獲得雜交子代XY♂和XX♀，其中XY♂和XX♀各占50%，雜交苗開口五天后，取500尾獨立培育至性成熟，另外取500尾用EE2雌二醇藥餌或藥蟲轉(zhuǎn)性為生理雌魚XY♀，獨立培養(yǎng)至性成熟；雜交子代XY分別與10—20尾生理雌魚交配，開口五天后，各組均抽出500尾獨立培育成熟，另抽500尾用EE2雌二醇轉(zhuǎn)性為生理雌魚，分別獨立培育至性成熟；若母本為生理雌魚，其后代超雄魚占25%，普通雄魚占50%，雌魚占25%；若母本為正常雌魚，則子代雌雄各半；測交選出超雄魚YY♂和超雄生理雌魚YY♀。
（3）建立純系超雄魚種質(zhì)庫：生理雌魚YY♀與超雄魚YY♂雜交，子代為100%的超雄魚，開口五天后，抽取部分投喂EE2雌二醇藥餌或藥蟲45天，將其轉(zhuǎn)性為生理雌魚YY♀，并與未轉(zhuǎn)性的超雄魚YY♂分池培育至性成熟，二者雜交，批量繁殖超雄魚種群，儲備于超雄魚種質(zhì)庫；
（4）建立純系全雄魚生產(chǎn)體系：黃顙魚超雄魚YY♂與全雌魚雜交，大規(guī)模全人工繁殖純系全雄魚XY♂，供各地養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖商品魚。
進一步，所述EE2雌二醇藥餌的配制方法為：將EE2雌二醇激素溶于95%酒精中，配成原液，再用酒精稀釋拌入鰻料或長吻鮠料中，晾干后即可獲得EE2雌二醇藥餌，其含EE2雌二醇激素量為40—60mg/kg。
進一步，所述藥蟲為采用含EE2雌二醇激素量為130—180μg/L的藥液浸泡1小時后濾去藥液的活豐年蟲。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
本發(fā)明針對近年來黃顙魚種質(zhì)逐代退化的現(xiàn)狀，選用長江水系野生原系黃顙魚中性狀特優(yōu)的成熟親魚，進行雌核發(fā)育，獲得純度較高的純系黃顙魚全雌魚XX♀，使黃顙魚種質(zhì)得以提純復(fù)壯，并應(yīng)用激素性逆轉(zhuǎn)技術(shù)獲得生理雄魚XX♂，與全雌魚XX♀雜交擴群，規(guī)模生產(chǎn)純系全雌魚取代社會上的“毛毛魚”作為生產(chǎn)全雄苗的母本；同時，以純系黃顙魚全雌魚作為選育基礎(chǔ)，通過GMT技術(shù)，以及激素性逆轉(zhuǎn)與測交方法，選育出純度較高的優(yōu)質(zhì)超雄魚YY♂,與純系全雌魚XX♀交配而生產(chǎn)出的純系全雄苗XY♂種質(zhì)純正、長速快、個體大而均勻、抗病力強，具有極強的生長優(yōu)勢及抗逆性能，提高了商品魚養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。本發(fā)明為可持續(xù)發(fā)展的黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)提供了切實可行的技術(shù)路線與優(yōu)質(zhì)的健康養(yǎng)殖新品系。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
具體實施方式
參照圖1，下面介紹申請人七年來關(guān)于本發(fā)明在研究與生產(chǎn)實踐中的具體操作方法。但所舉操作方法不作為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以因地、因人、因時制宜，對本發(fā)明作相應(yīng)改動。
具體操作方法，有如下步驟：
1.建立純系全雌黃顙魚種質(zhì)庫
針對多年來各地生產(chǎn)黃顙魚普通苗及全雄苗存在的問題，將黃顙魚種質(zhì)提純復(fù)壯，按傳統(tǒng)方法即通過選擇育種與雜交育種來構(gòu)建純系，需要經(jīng)過8—10代同胞兄弟妹交配選育，而人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育，只需經(jīng)過一次抑制第一次卵裂，就可以使基因座位全部純合，由于黃顙魚性別決定機制為雌性配子同型，所以生產(chǎn)的子代為純系全雌苗。具體操作步驟如下：
（1）魚卵采集：在長江水系挑選個體粗大、性狀優(yōu)良的野生原系黃顙魚雌、雄魚親本回來進行強化培育，野生原系雌魚注射催產(chǎn)激素后，達到效應(yīng)時間時人工擠出卵子；
（2）精子滅活：選取成熟的異源精子（如：南方大口鯰、長吻鮠等精子），置于精子保存液稀釋，用波長2537埃的紫外線燈照射25分鐘，使精子的遺傳物質(zhì)失活即可保存?zhèn)溆茫?/p>
（3）人工授精：滅活精子與卵子混合均勻，加入4‰鹽水激活精子，刺激魚卵“受精”發(fā)育；
（4）冷休克處理：受精后1—2分鐘內(nèi)，將受精卵放進4℃水中冷休克處理15—20分鐘，阻斷卵子減數(shù)分裂第二極體排出而恢復(fù)雌核二倍體；
（5）人工孵化：冷休克處理完畢后將魚卵取出放入25—30℃水中按正常方法人工孵化出純系全雌子代XX♀；
（6）生理雄魚制種：在全雌苗開口五天后，取出部分苗獨立培育，投喂40天17α—甲基睪酮藥餌或藥蟲將其轉(zhuǎn)性為生理雄魚XX♂，與未轉(zhuǎn)性的全雌苗分別獨立培育至性成熟；
（7）雜交擴群：純系全雌魚XX♀與生理雄魚XX♂雜交擴群，規(guī)模生產(chǎn)純系全雌苗，專塘培育成熟后，置于純系全雌魚種質(zhì)庫保種。
2選育優(yōu)質(zhì)黃顙魚超雄魚YY♂和生理雌魚YY♀
本發(fā)明在選育出純系全雌魚的基礎(chǔ)上，用GMT技術(shù)和性逆轉(zhuǎn)與測交方法研制出優(yōu)質(zhì)黃顙魚超雄魚和生理雌魚，具體方法如下：
（1）優(yōu)質(zhì)雄魚的選育：用純系黃顙魚全雌魚XX♀與野生原系黃顙魚雄魚雜交，獲得優(yōu)質(zhì)子代XY♂及XX♀；
（2）優(yōu)質(zhì)生理雌魚XY♀的制備：上述優(yōu)質(zhì)雜交子代保留500尾用豐年蟲投喂五天后，提取250尾獨立培育，改投EE2雌二醇藥餌：將豐年蟲放入劑量為150μg/L的EE2藥液中浸1小時后，濾取活蟲投喂，日喂三次，連喂45天，將其轉(zhuǎn)性為生理雌魚XY♀，然后用普通黃顙魚飼料培育至性成熟；其余250尾未轉(zhuǎn)性的雜交苗繼續(xù)獨立培育至性成熟（當(dāng)雌雄可辨別清楚時，將其中的雌魚淘汰掉，僅保留雄魚XY♂）
（3）全雄黃顙魚YY♂與生理雌魚YY♀的制種
取兩尾發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)雄魚的精囊剪碎，用精子保存液稀釋，置于5—7℃冰箱保存；
取10—20尾發(fā)育良好的純系“生理雌魚”，注射催產(chǎn)激素，將卵子擠出，分開暫放，一尾一尾獨立與上述（XY♂）精子人工授精，受精卵獨立孵化，獨立培育，開口五天后，每尾雌魚產(chǎn)出的魚苗各保留500尾，其中50%即250尾按上述方法人工雌性化后獨立培育，余下50%按常規(guī)培苗方法獨立培育。
將以上各組魚苗用小網(wǎng)箱獨立培育至可分清雌雄后，檢查不轉(zhuǎn)性的各組魚中的雌雄比例。若雌雄各50%左右，則該母本為XX♀，其母本及子代（含已雌性化的子代）全部淘汰；若雌雄比例為1:3，則該母本為XY♀，子代中存在25%超雄魚YY，應(yīng)將這尾雌魚產(chǎn)出的子代（含已轉(zhuǎn)性和未轉(zhuǎn)性兩部分）獨立培育成熟。
（4）測交選出純系黃顙魚超雄魚YY♂和生理雌魚YY♀
候選雄魚YY♂，與普通雌魚XX♀1:1配對繁殖，親本及子代均獨立培育至子代可分清雌雄，若子代為全雄魚，則該尾雄魚為超雄魚YY♂，否則淘汰；
候選生理雌魚YY♀與普通雄魚XY♂人工繁殖出子代獨立培育，若子代全部為雄魚，則該尾雌魚為超雄生理雌魚YY♀，否則淘汰。
3.建立純系超雄黃顙魚YY♂和YY♀種質(zhì)庫
將選出的超雄魚YY♂和超雄生理雌魚YY♀人工繁殖，所產(chǎn)子代全部為超雄魚，按上述方法將部分YY♂人工雌性化變?yōu)槌凵泶启~YY♀，培育成熟后就可以批量擴群，儲存于超雄黃顙魚種質(zhì)庫。
4.大規(guī)模生產(chǎn)純系全雄黃顙魚魚苗
當(dāng)種質(zhì)庫儲備有足夠的黃顙魚超雄魚YY♂和全雌XX♀成熟親魚后，就可以在繁殖季節(jié)大規(guī)模全人工繁殖純系全雄黃顙魚魚苗供應(yīng)各地養(yǎng)戶。一尾超雄魚YY♂可與100—350萬粒純系全雌魚魚卵交配授精，若親魚培育良好，受精率與孵化率均在95%以上。
上述方法中，EE2雌二醇藥餌的配制方法為：將EE2雌二醇激素溶于95%酒精中，配成原液，再用酒精稀釋拌入鰻料或長吻鮠料中，晾干后即可獲得EE2雌二醇藥餌，其含EE2雌二醇激素量為40—60mg/kg。
上述方法中，所述藥蟲為采用含EE2雌二醇激素量為130—180μg/L g/L的藥液浸泡1小時后濾去藥液的活豐年蟲。
經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，以豐年蟲為激素載體比投喂藥餌效果更佳。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，只要以基本相同手段實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案都屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。