技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及大蒜組織培養(yǎng)與快繁的方法，更具體的說是構(gòu)建一種用大蒜花序軸進(jìn)行脫毒快繁的新方法。

背景技術(shù)：

大蒜(Allium sativum L.)是百合科蔥屬一年生植物，大蒜栽培品種多不能形成種子，通常采用無性繁殖。這就使大蒜的生物多樣性和遺傳特性受到限制，造成嚴(yán)重的種性退化，嚴(yán)重影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)。長期無性繁殖還導(dǎo)致大蒜病毒的不斷積累，嚴(yán)重影響大蒜植株的生長及鱗莖的商品價(jià)值。當(dāng)前，植物組織培養(yǎng)、人工誘變、基因工程以及大蒜多倍體育種等技術(shù)的應(yīng)用，很大程度上提升了大蒜優(yōu)良品種的選育工作。其中植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種有效的脫毒快繁技術(shù)，已成大蒜育種研究熱點(diǎn)。

在大蒜的植物組織培養(yǎng)研究中，大蒜的不同外植體如，莖尖、根尖、幼嫩的葉子、貯藏葉、葉原基 、未成熟的花序軸、鱗莖以及氣生鱗莖等都已被應(yīng)用于組織培養(yǎng)中用于誘導(dǎo)與再生。不定芽增殖途徑是直接誘導(dǎo)外植體內(nèi)潛伏的不定芽萌發(fā)，具有遺傳性狀穩(wěn)定，突變率低，再生時(shí)間較短等優(yōu)勢(shì)。目前，大蒜不定芽增殖方式多選用莖尖和莖盤（等為外植體，其繁殖系數(shù)平均在3到7 之間?；ㄐ蜉S是大蒜的生殖器官，處在生長頂端，病毒含量較低，其自然脫毒效果可以達(dá)到77.6%；花苞基部花盤有很高的誘導(dǎo)不定芽的潛力，王秀芝等以大蒜花序軸為外植體，誘導(dǎo)不定芽，每個(gè)花序軸不定芽總數(shù)可以達(dá)到19.2個(gè)?？梢姶笏饣ㄐ蜉S可以作為大蒜脫毒快繁的重要外植體。

然而，許多研究者雖然獲得了較多的不定芽，但脫毒種蒜高效培養(yǎng)成功的相關(guān)報(bào)道較為少見。因?yàn)楦哳l率試管苗的誘導(dǎo)僅僅是脫毒種蒜生產(chǎn)的限速條件之一，如何保證這些試管苗生根、移栽成活進(jìn)而獲得脫毒種蒜是另一個(gè)重要條件。許多研究者采用離體培養(yǎng)技術(shù)從愈傷組織中獲得了大量再生植株，但在誘導(dǎo)生根和移栽環(huán)節(jié)上損失大量植株，降低了繁殖效率，并且耗時(shí)耗力，在應(yīng)用方面受到限制。有研究者通過優(yōu)化大蒜再生植株的移植條件，提高其存活率，但植株馴化困難，效果不甚理想。熊正琴等將試管苗誘導(dǎo)形成試管鱗莖，其移栽成活率能明顯提高。此外，試管鱗莖便于儲(chǔ)存、方便運(yùn)輸、具有更強(qiáng)抗逆性以及無需馴化的優(yōu)點(diǎn)，誘導(dǎo)成試管鱗莖的方式更加適用于大蒜組織培養(yǎng)。而且有研究表明，試管鱗莖與普通大蒜蒜瓣種植相似，經(jīng)過其休眠期，便可以直接種植并正常生長。

本發(fā)明以寶坻大蒜“六瓣紅”的花序軸作為外植體，通過優(yōu)化激素種類及濃度配比，獲得高效誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，結(jié)合誘導(dǎo)試管鱗莖、改進(jìn)栽培途徑，構(gòu)建了從外植體到脫毒種蒜生產(chǎn)的完整方法，該體系為大蒜脫毒、快繁、保持優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性、提高鱗莖產(chǎn)量及品質(zhì)等提供了重要的技術(shù)依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開了一種用大蒜花序軸進(jìn)行脫毒快繁的方法，它是按如下的步驟進(jìn)行:

（1）花序軸誘導(dǎo)不定芽：選擇寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進(jìn)入生殖生長期時(shí)，其花莖：假莖=1-1.2時(shí)，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲(chǔ)存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3-4次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3-4次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接入2個(gè)花序軸。誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基為: MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2。每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的不定芽數(shù)可以達(dá)到11個(gè)；不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖的誘導(dǎo)率均在90%以上，最高可達(dá)到98.78%，而每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的試管鱗莖數(shù)最高可達(dá)到10.64個(gè)，其繁殖系數(shù)相對(duì)于鱗莖直接種植高了2倍多；

（2）不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達(dá)到3-5cm時(shí)，將其接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)試管鱗莖，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基指的是試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5，其詳細(xì)的方法是：當(dāng)花序軸誘導(dǎo)的不定芽生長六周后，形成的不定芽高度達(dá)到3-5cm時(shí)，將其接入另試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)試管鱗莖；

（3）試管鱗莖的收獲與儲(chǔ)藏：不定芽在誘導(dǎo)試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

（4）再生植株和再生鱗莖的獲得：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進(jìn)行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，組培大蒜成熟并收獲；

（5）組培大蒜病毒檢測(cè)和染色體檢測(cè)： 利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和根尖細(xì)胞染色體制片技術(shù)分別檢測(cè)組培大蒜脫毒效果和染色體變異情況，組培大蒜達(dá)到部分脫毒效果，未觀察到染色體異常現(xiàn)象。

本發(fā)明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），簡(jiǎn)稱NAA ； KT是激動(dòng)素（Kinetin）,簡(jiǎn)稱KT；所述的MS基本培養(yǎng)基配方：

每1L基本培養(yǎng)基中含有：KNO₃ 1900mg,NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄?7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂?2H₂O 440 mg, MnSO₄?4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄?7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃?2H₂O 0.25 mg, CuSO₄?5H₂O 0.025 mg, CoCl₂?6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄?7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 鹽酸硫胺素0.4 mg, 鹽酸吡哆素0.5 mg, 煙酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了用大蒜花序軸進(jìn)行脫毒快繁方法在提高大蒜脫毒快繁效率方面的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明的方法是有效的，能夠縮短大蒜制種時(shí)間，增大繁殖系數(shù)，由于不經(jīng)過脫分化和再分化過程，可以最大限度保證了優(yōu)良大蒜品種的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明以大蒜花序軸為外植體，構(gòu)建了從外植體選擇、花序軸不定芽誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖、試管鱗莖打破休眠、大田栽培種植、脫毒效果檢測(cè)、遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)、直到脫毒種蒜獲得的完整的方法。

下面本發(fā)明以典型的天津市寶坻大蒜快繁為代表，更加具體的說明實(shí)施方案：

1、花序軸誘導(dǎo)不定芽最佳培養(yǎng)基篩選：本發(fā)明所用的大蒜為寶坻大蒜“六瓣紅”，材料來自于天津師范大學(xué)生物科技園中。選擇于第一年10月底種植的寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進(jìn)入生殖生長期時(shí)，其花莖：假莖=1-1.2時(shí)，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲(chǔ)存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3-4次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3-4次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入篩選培養(yǎng)基中，每瓶接入2個(gè)花序軸。篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類（KT，6-BA以及NAA）及濃度的激素，附加蔗糖30g·L^-1，瓊脂7.5g·L^-1，pH=6.2，121 ℃ (1.03×10⁵ Pa)滅菌20 min后使用。以下為花序軸誘導(dǎo)不定芽的篩選培養(yǎng)基：

表1 培養(yǎng)基激素配比

2、不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達(dá)到3-5cm時(shí)，將其接入另一種固體培養(yǎng)基中（MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5）誘導(dǎo)試管鱗莖，觀察并記錄試管鱗莖生長狀況。

3、試管鱗莖的收獲與儲(chǔ)藏：不定芽在誘導(dǎo)試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

4、再生植株和鱗莖的形態(tài)學(xué)觀察：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，并覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進(jìn)行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，大蒜成熟并收獲。測(cè)量鱗莖直徑，將大蒜鱗莖按照大中小的標(biāo)準(zhǔn)分為三組，每一組測(cè)量十個(gè)數(shù)據(jù)，將得到的三十個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到試管鱗莖的平均直徑大小。

5、病毒檢測(cè)：酶聯(lián)免疫試劑OYDV、LYSV和GMV的DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國Agdia公司。所用檢測(cè)抗體、酶標(biāo)抗體、對(duì)硝基苯磷酸二鈉（PNP）底物、陽性對(duì)照、GEB樣品提取緩沖液、聚乙烯微孔板均購自Agdia公司，酶結(jié)合物為堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的OYDV、LYSV、GMV3種病毒抗體，陰性對(duì)照為GEB提取緩沖液，具體檢測(cè)方法參照Agdia公司說明書。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大蒜的脫毒效果，方法參照試劑盒說明書，每個(gè)樣品重復(fù)三次。

6、再生植株染色體檢測(cè)：選取大蒜花序軸試管鱗莖再生植株根尖，用固定液固定24h后，用蒸餾水沖洗3-4次，放入70%的乙醇中進(jìn)行保存。選取保存的根尖，用蒸餾水沖洗3-5次，加入1M HCl在60℃水浴中水解8 min，蒸餾水沖洗3-5次，將根尖分生組織區(qū)置于載玻片中央，滴加2-3滴卡寶品紅溶液，染色8min，用濾紙吸去多余染液，在顯微鏡下觀察根尖分生組織區(qū)染色體形態(tài)。

本發(fā)明公開的用大蒜花序軸進(jìn)行脫毒快繁的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）該方法的核心是通過高頻誘導(dǎo)試管鱗莖、試管鱗莖低溫春化、設(shè)施栽培進(jìn)而在實(shí)現(xiàn)脫毒種蒜生產(chǎn)。傳統(tǒng)利用莖尖脫毒快繁，需要經(jīng)過脫分化、再分化、誘導(dǎo)試管苗、試管苗生根、煉苗移栽等繁瑣過程，歷時(shí)兩年才能獲得脫毒種蒜。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的方法，大大提高了大蒜脫毒快繁效率，節(jié)省培育時(shí)間，降低生產(chǎn)成本。

（2）大蒜花序軸處于大蒜植株生長頂端，其本身帶毒量少，且通過花序軸直接誘導(dǎo)不定芽，沒有經(jīng)過脫分化和再分化過程，植株遺傳穩(wěn)定性得到保障。

（3）4℃下處理兩周，打破花序軸休眠期，更加有利于不定芽誘導(dǎo)。

（4）本發(fā)明優(yōu)化了各個(gè)環(huán)節(jié)，構(gòu)建了從外植體到脫毒種蒜以及組培蒜脫毒效果和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)的完整的方法，該方法在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

附圖說明

圖1為大蒜花序軸不定芽誘導(dǎo)，其中a.花序軸剛接入培養(yǎng)基，b-f.花序軸生長約1周、2周、3周、4周和6周時(shí)的生長狀況；

圖2為大蒜花絮軸不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖，其中a.不定芽接入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基中，b-f. 不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖1周、2周、3周、4周和6周的生長狀況；

圖3為形成的不定芽總數(shù)與形成的試管鱗莖數(shù)總數(shù)相關(guān)性分析；

圖4為試管鱗莖的外觀、大小與解剖圖，其中a-b.從培養(yǎng)瓶中收獲的成簇的試管鱗莖 c.收獲的所有試管鱗莖，d.比較寶坻蒜瓣與試管鱗莖大小 e-f. 在解剖鏡下觀察試管鱗莖的生長點(diǎn)（箭頭所指）（圖中比例尺為1.9cm）；

圖5為大蒜試管鱗莖所得再生植株與鱗莖的形態(tài)，其中a.再生植株在地里的生長情況，b.收獲鱗莖時(shí)再生植株的形態(tài)，c.獨(dú)頭鱗莖 d.分瓣鱗莖e.二次生長鱗莖（圖中比例尺為1.9cm）；

圖6為大蒜花絮軸試管鱗莖再生植株根尖分生組織區(qū)的染色體檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中本發(fā)明所用到的NAA，KT， 蔗糖，10%安替福民、瓊脂均有市售。

實(shí)施例1

（1）花序軸誘導(dǎo)不定芽：選擇寶坻大蒜“六瓣紅”，大蒜進(jìn)入生殖生長期時(shí)，其花莖：假莖=1-1.2時(shí)，采摘大蒜的花序軸并于4℃中保存兩周。將經(jīng)低溫儲(chǔ)存兩周后的花序軸置于自來水下沖洗30 min，0.1% HgCl₂ 消毒20 min，蒸餾水沖洗3次，再用75%的酒精消毒10 min，蒸餾水沖洗3次。剝下外層苞葉及表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，并去除花莖部分，將花序軸接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接入2個(gè)花序軸。誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基為: MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2。每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的不定芽數(shù)可以達(dá)到11個(gè)；不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖的誘導(dǎo)率均在90%以上，最高可達(dá)到98.78%，而每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的試管鱗莖數(shù)最高可達(dá)到10.64個(gè)，其繁殖系數(shù)相對(duì)于鱗莖直接種植高了2倍多；

（2）不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖：花序軸生長六周后，形成的不定芽高度達(dá)到3-5cm時(shí)，將其接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)試管鱗莖，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基指的是試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+120 g· L^-1綿白糖+6.8 g· L^-1瓊脂，pH=7.5，其詳細(xì)的方法是：當(dāng)花序軸誘導(dǎo)的不定芽生長六周后，形成的不定芽高度達(dá)到3-5cm時(shí)，將其接入另試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)試管鱗莖。

（3）試管鱗莖的收獲與儲(chǔ)藏：不定芽在誘導(dǎo)試管鱗莖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)六周后，試管鱗莖成熟，將其取出并洗去培養(yǎng)基，在避光處晾干，晾干后，在4℃下保存3周后種植。

（4）再生植株和再生鱗莖的獲得：試管鱗莖度過休眠期后，于10月底種植，覆膜。第二年5月份，揭開薄膜，并進(jìn)行除草，澆水以及松土工作。在6月下旬，組培大蒜成熟并收獲；

（5）組培大蒜病毒檢測(cè)和染色體檢測(cè)： 利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和根尖細(xì)胞染色體制片技術(shù)分別檢測(cè)組培大蒜脫毒效果和染色體變異情況，組培大蒜達(dá)到部分脫毒效果，未觀察到染色體異?，F(xiàn)象。

本發(fā)明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），簡(jiǎn)稱NAA ； KT是激動(dòng)素（Kinetin）,簡(jiǎn)稱KT；所述的MS基本培養(yǎng)基配方：

每1L基本培養(yǎng)基中含有：KNO₃ 1900mg,NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄?7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂?2H₂O 440 mg, MnSO₄?4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄?7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃?2H₂O 0.25 mg, CuSO₄?5H₂O 0.025 mg, CoCl₂?6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄?7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 鹽酸硫胺素0.4 mg, 鹽酸吡哆素0.5 mg, 煙酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

實(shí)施例2

1、大蒜花序軸誘導(dǎo)不定芽誘導(dǎo)

由于不同激素種類（KT、6-BA及NAA）及濃度對(duì)不定芽再生效率有一定的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了12種篩選培養(yǎng)基，將低溫保存兩周后的大蒜花絮軸接入上述篩選培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，其結(jié)果如下表所示：

表2 不同激素配比對(duì)寶坻大蒜花序軸不定芽增殖的影響

從表2中可以看出，在培養(yǎng)基1到6中，培養(yǎng)基2的誘導(dǎo)率較高，每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的不定芽數(shù)達(dá)到6.12個(gè)。在6- BA濃度相同時(shí)，不添加NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較高，說明誘導(dǎo)不定芽時(shí)6-BA比NAA的影響大。培養(yǎng)基7到12中，11的誘導(dǎo)率較高，每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的不定芽數(shù)達(dá)到11.00個(gè)，在KT濃度相同時(shí)，添加NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較高，表明KT與NAA共同作用花序軸不定芽的誘導(dǎo)。而從表中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基7到12均比培養(yǎng)基1到6的誘導(dǎo)率高，說明KT比6-BA更適合大蒜花絮軸不定芽的誘導(dǎo)，因此，大蒜花絮軸誘導(dǎo)不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為：培養(yǎng)基11，即MS+2.0 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 NAA+ 30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=6.2，其誘導(dǎo)率達(dá)到11個(gè)。

圖1是在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽各環(huán)節(jié)：剛接入培養(yǎng)基時(shí)未見明顯膨大（圖1-a）。經(jīng)過一個(gè)星期左右，其表面出現(xiàn)凸起，花序軸明顯膨大，切塊表面增厚，形成半透明的叢生芽，大多數(shù)生長于中部和下部，并且密集生長（圖1-b）。不定芽持續(xù)生長，大約兩周后，半透明的不定芽變成嫩綠色，達(dá)到2厘米的長度（圖1-c）。4周后，形成密集的不定芽叢（圖1-e）。大約6周后，不定芽可以移植到誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基中（圖1-f）。

2、大蒜花序軸不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖

由于眾多的不定芽叢生于同一個(gè)花絮軸基部，難以保證每一顆苗能夠誘導(dǎo)出實(shí)生根進(jìn)行移栽，本研究通過誘導(dǎo)試管鱗莖途徑以提高繁殖效率。誘導(dǎo)試管鱗莖的培養(yǎng)基為：MS+ 120.0 g· L^-1 綿白糖+6.8 g ·L^-1 瓊脂，pH=7.5 。從圖2中可以看到，誘導(dǎo)大約1周后，不定芽根部開始膨大（圖2-b）；2周后，試管苗出現(xiàn)枯萎（圖2-c）；3周時(shí)，鱗莖外表皮逐漸變?yōu)樽仙▓D2-d）；4周時(shí)，誘導(dǎo)形成的試管鱗莖大部分外表皮變?yōu)樽仙嚬苊缈菸F(xiàn)象嚴(yán)重（圖2-e）；6周后，試管苗枯萎，試管鱗莖基本成熟（圖2-f）。此時(shí)，將試管鱗莖從培養(yǎng)瓶中取出，洗去表面培養(yǎng)基，于陰涼處晾干。

從表3中可以看到，不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖的誘導(dǎo)率均在90%以上，最高可達(dá)到98.78%，而每個(gè)花序軸誘導(dǎo)的試管鱗莖數(shù)最高可達(dá)到10.64個(gè)，其繁殖系數(shù)相對(duì)于鱗莖直接種植（繁殖系數(shù)為5）高了2倍多。從圖3中可以看出，大蒜花序軸形成的不定芽總數(shù)與形成試管鱗莖總數(shù)呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。因此，在需要獲得高誘導(dǎo)率的試管鱗莖時(shí)，誘導(dǎo)不定芽則需要在誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基上生長。

表3大蒜花絮軸不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖

注：小寫字母在0.05水平上差異顯著，大寫字母在0.01水平上差異顯著。

3 試管鱗莖的收獲與貯藏

大蒜花序軸誘導(dǎo)形成試管鱗莖總計(jì)1260個(gè)。較大的試管鱗莖的直徑為6.65mm，中等大小的直徑為4.23mm，而相對(duì)較小的直徑為1.68mm。從培養(yǎng)瓶中收獲的試管鱗莖成簇狀排列，每簇最多可達(dá)到25個(gè)（見圖4-a-b）。晾干后的試管鱗莖外表皮呈紫色（見圖4-c），與寶坻大蒜鱗莖外表皮一致。在解剖鏡下觀察，試管鱗莖都具有生長點(diǎn)（見圖4-e-f），因此，在渡過休眠期后，移栽至地里，試管鱗莖均可以正常生長。

4 大蒜試管鱗莖所得再生植株與鱗莖的形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

大蒜試管鱗莖的再生植株數(shù)量為539株，收獲的鱗莖中，獨(dú)頭蒜有530株，分成兩瓣的有8株，四瓣的1株。鱗莖的最大直徑為22.14mm，最小直徑為3.16mm，二次生長的1株。

5病毒檢測(cè)

對(duì)通過試管鱗莖種植大田所得再生植株葉片分別用OYDV、LYSV和GMV試劑盒進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，用酶標(biāo)儀讀取405nm吸光度值，并與陰性對(duì)照、陽性對(duì)照吸光度值進(jìn)行比較。結(jié)果表明，未脫毒寶坻大蒜病毒感染比較嚴(yán)重，且為復(fù)合型感染（見表4）。

從表4中可以看出，在未脫毒寶坻大蒜中均檢測(cè)出感染上述三種病毒，但病毒對(duì)植株侵染程度不同，這是一種復(fù)合侵染的方式。未脫毒大蒜樣品OYDV、LYSV和GMV檢測(cè)結(jié)果分別為陰性對(duì)照的3.10、6.11和3.11倍，感染情況相當(dāng)嚴(yán)重。這種可能是導(dǎo)致大蒜品質(zhì)下降，繁殖系數(shù)降低的原因之一。經(jīng)過花序軸脫毒快繁途徑后再生植株樣品OYDV、LYSV和GMV檢測(cè)結(jié)果分別為陰性對(duì)照的2.9、4.3和1.2倍，達(dá)到一定脫毒效果。

表4再生植株葉片ELISA病毒檢測(cè)結(jié)果

6細(xì)胞學(xué)觀察

大蒜是真核細(xì)胞生物，染色體的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)保證了基因遺傳的穩(wěn)定性，觀察大蒜花序軸試管鱗莖再生植株根尖分生組織區(qū)的染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中有16條染色體，并且形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)染色體異?，F(xiàn)象，因此保證了大蒜種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明構(gòu)建的大蒜脫毒快繁方法與常規(guī)方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果如下：

對(duì)比試驗(yàn)：

結(jié)論：與常規(guī)方法相比，本發(fā)明以大蒜花序軸為外植體，構(gòu)建了從外植體選擇、花序軸不定芽誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)試管鱗莖、試管鱗莖打破休眠、大田栽培種植、脫毒效果檢測(cè)、遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)、直到脫毒種蒜獲得的完整的方法，省去試管苗生根和移栽，解決了試管苗成活率低的問題。該體系為大蒜脫毒、快繁、保持優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性、提高鱗莖產(chǎn)量及品質(zhì)等提供了重要的技術(shù)依據(jù)。