本發(fā)明屬于果樹育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及日本栗2n花粉誘導(dǎo)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：品種是一個(gè)產(chǎn)業(yè)得以健康發(fā)展的重要保證，也是永恒的基礎(chǔ)需求。目前，國內(nèi)外培育新品種的方式有很多，主要包括：實(shí)生選種、芽變選種、雜交育種、輻射育種、轉(zhuǎn)基因育種、多倍體育種等，其中多倍體育種一直是應(yīng)用普遍、育種效果突出的新品種培育方式之一。多倍體是指具有三套或者三套以上完整染色體組的所有個(gè)體。染色體組加倍使植物體可用的遺傳物質(zhì)增加，重復(fù)的基因可能會(huì)發(fā)生功能分化，從而使多倍體物種在自然選擇中具有更大環(huán)境適應(yīng)優(yōu)勢，如更強(qiáng)的抗旱能力、抗病蟲害能力、無融合生殖等，使植物可以適應(yīng)更廣泛的自然環(huán)境(Rieseberg等，2003)。目前，多倍體育種的途徑主要包括：從自然界選擇天然多倍體植株；利用不同倍性水平植株雜交；利用天然或人工誘導(dǎo)2n花粉(2n雄配子)授粉；利用天然或者人工誘導(dǎo)2n雌配子雜交以及體細(xì)胞染色體加倍等。業(yè)已證實(shí)，利用2n配子雜交是獲得植物多倍體的一種高效方式。2n配子是指在減數(shù)分裂過程中某些因素導(dǎo)致形成具有體細(xì)胞染色體數(shù)的花粉或卵細(xì)胞，其在植物界普遍發(fā)生，目前至少26個(gè)科的60個(gè)屬中發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生2n配子的植物種(張正海，2008；Nassar，2001)。特別是2n花粉(具有體細(xì)胞染色體數(shù)的花粉)，由于其與正常倍性花粉在形態(tài)及大小方面存在差異，易于識別和鑒定，廣泛應(yīng)用于植物多倍體育種(楊倩等，2015)。國內(nèi)外學(xué)者多年育種實(shí)踐證實(shí)，利用化學(xué)藥劑誘導(dǎo)出2n花粉與二倍體雌株雜交，是迅速獲得三倍體的有效途徑之一，而提高2n花粉產(chǎn)生頻率是利用2n花粉進(jìn)行多倍體育種成敗的關(guān)鍵(向素瓊等，2005；楊倩等，2015)。在植物雌雄配子多倍化誘導(dǎo)過程中，由于各物種間遺傳物質(zhì)、器官構(gòu)成、發(fā)育時(shí)期和方式等因素千差萬別，其達(dá)到好的多倍化誘導(dǎo)效果所需的藥劑、劑量、時(shí)間、材料和方法等因素也各不相同(吳瀟等，2016)。栗屬植物的遺傳背景復(fù)雜，保守性強(qiáng)，其自然花粉中2n花粉的比率不足1‰，由于其比率過低，無法直接利用其自然花粉中2n花粉進(jìn)行多倍體育種實(shí)踐；在目前的相關(guān)研究中，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)成功誘導(dǎo)出栗屬植物大頻率2n花粉的報(bào)道。因此，選擇以日本栗(Castanrecrenata)為材料，篩選其適宜的誘導(dǎo)藥劑、劑量、時(shí)期、部位等因素，創(chuàng)建一套植株2n花粉誘導(dǎo)技術(shù)，獲得大頻率2n花粉，為今后提供一種切實(shí)可行的2n花粉誘導(dǎo)方法，從而為栗屬植物多倍體育種提供方法參考。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服日本栗自然花粉中2n花粉比率過低(無法直接應(yīng)用于育種實(shí)踐)，彌補(bǔ)大頻率日本栗2n花粉人工誘導(dǎo)方法空白，本發(fā)明旨在提供一種日本栗2n花粉誘導(dǎo)方法，該方法可以獲得大頻率2n花粉。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：一種日本栗2n花粉誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：1)選擇誘導(dǎo)材料選擇花序長、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castaneacrenata)的雄花枝上的花序?yàn)檎T導(dǎo)處理材料。2)配制誘導(dǎo)藥劑于采用誘導(dǎo)藥劑處理花序前2天配制好誘導(dǎo)藥劑，又到藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜；配置方法：稱取5g秋水仙素加蒸餾水溶解，之后加入1ml二甲基亞砜，最后用蒸餾水定容至1000ml]，置于4℃冰箱中備用。3)誘導(dǎo)藥劑浸漬花序選擇日本栗健康無病、生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個(gè)花序?yàn)樘幚韺ο?，多余疏除。誘導(dǎo)藥劑處理花序時(shí)期為每年4月25日前后，以日本栗花序基部直徑不超過3mm，長度不超過7cm，花朵未凸起為標(biāo)準(zhǔn)。將選用的雄花枝上的每條花序單獨(dú)用脫脂棉包好，棉層厚度1mm，保留花序著生部位葉片；之后用塑料條將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上封好，留有適當(dāng)透氣縫隙；塑料條厚度0.06mm，寬度3cm；用醫(yī)用一次性注射器將配置好的誘導(dǎo)藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導(dǎo)藥劑至飽和狀態(tài)，如此使日本栗雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態(tài)下保持72h；之后拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理后的花序重新暴露在空氣中。4)花序散粉前套袋在日本栗花朵開放前，大約每年6月5日，將誘導(dǎo)藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。5)花粉收集待硫酸紙袋中花序處于雄花盛花期，此時(shí)花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同采下，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于陰涼干燥處24h，之后收集袋中自然散落的花粉，即獲得大頻率日本栗2n花粉。本發(fā)明所述的一種日本栗2n花粉誘導(dǎo)方法是在日本栗多倍體育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于：日本栗花序采用此方法處理后，可以獲得大比率2n花粉，試驗(yàn)證實(shí)：處理的日本栗花序所產(chǎn)生的花粉中2n花粉比率高達(dá)12.4％。自然界中的日本栗花粉中2n花粉的比率不足1‰，試驗(yàn)證實(shí)：對照日本栗花序花粉中2n花粉的比率為0.03‰，無法直接利用其進(jìn)行多倍體育種實(shí)踐。本發(fā)明日本栗2n花粉誘導(dǎo)方法：第一通過選擇花粉量充足的日本栗‘XY-1’的雄花枝上的花序?yàn)樘幚聿牧?；第二選用以秋水仙素為誘導(dǎo)劑、二甲基亞砜為助滲劑的特定成分、特定濃度和特定配比的2n花粉誘導(dǎo)藥劑，誘導(dǎo)藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜；第三選擇誘導(dǎo)藥劑處理花序特定時(shí)期為每年5月17日前后；第四采用脫脂棉包裹花序并使其在藥劑浸漬狀態(tài)下保持72h。以上述4個(gè)綜合措施來共同達(dá)到誘導(dǎo)日本栗花粉中2n花粉比率提高的目的，獲得大比率日本栗2n花粉。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例及對比例中所用藥劑、脫脂棉、塑料條、醫(yī)用一次性注射器、硫酸紙袋等材料均可市購。對比例1對比例1所用試驗(yàn)材料位于河北省昌黎果樹研究所板栗育種基地。按下述方法進(jìn)行日本栗2n花粉誘導(dǎo)試驗(yàn)。試驗(yàn)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單株小區(qū)，3次重復(fù)，以未處理‘XY-1’花序?yàn)閷φ?。該試?yàn)以誘導(dǎo)藥劑(4個(gè)水平)、誘導(dǎo)藥劑處理花序時(shí)期(5個(gè)水平)和藥劑浸漬花序時(shí)長(3個(gè)水平)為因素，進(jìn)行完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共60個(gè)處理(見表1)。按照下述步驟進(jìn)行日本栗2n花粉誘導(dǎo)操作：1)選擇誘導(dǎo)材料選擇花序長、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castaneacrenata)的雄花枝上的花序?yàn)樘幚聿牧稀?)配制誘導(dǎo)藥劑于采用誘導(dǎo)藥劑處理花序前2天配制好各處理所需誘導(dǎo)藥劑(見表1)，置于4℃冰箱中備用。3)誘導(dǎo)藥劑浸漬花序選擇日本栗‘XY-1’健康無病，生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個(gè)花序?yàn)樘幚韺ο?，多余疏除。各處理的誘導(dǎo)藥劑處理花序時(shí)期按照表1所列執(zhí)行。將選用的雄花枝上的每條花序單獨(dú)用脫脂棉包好，棉層厚度1mm，保留花序著生部位葉片；之后用塑料條(厚度0.06mm，寬度3cm)將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上纏好，留有適當(dāng)透氣縫隙；用醫(yī)用一次性注射器將配置好的誘導(dǎo)藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導(dǎo)藥劑至飽和狀態(tài)，如此使日本栗雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態(tài)下保持24—72h(各處理所用時(shí)長見表1)；之后拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理后的花序重新暴露在空氣中。4)花序散粉前套袋在日本栗花朵開放前(6月5日)，將誘導(dǎo)藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。5)花粉收集待硫酸紙袋中花序處于雄花盛花期，此時(shí)花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同采下，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于陰涼干燥處24h，之后收集袋中自然散落的花粉。6)2n花粉檢測隨機(jī)選取收集的部分花粉，經(jīng)卡諾固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24—48h。將固定好的花粉制成臨時(shí)涂片，45％醋酸洋紅染液染色20min，置于顯微鏡上觀察。根據(jù)花粉的直徑判斷是否為2n花粉，并計(jì)算比例。每個(gè)處理單次隨機(jī)檢測500個(gè)花粉，重復(fù)3次。SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有花粉檢測均在OlympusBX-51光學(xué)顯微鏡下觀察，OlympusDP70照相系統(tǒng)數(shù)碼攝相。表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)各處理的相關(guān)因素7)實(shí)施效果由表2可見，不同處理誘導(dǎo)出的日本栗2n花粉比率不盡相同，處理ch-1～60誘導(dǎo)出的日本栗2n花粉比率均高于自然日本栗花粉(CK)，所有處理中誘導(dǎo)產(chǎn)生2n花粉比率最高的為ch-12，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的日本栗2n花粉比率為12.4％，顯著高于對照(日本栗自然花粉中2n花粉比率為0.067％)，亦顯著高于其它處理產(chǎn)生的2n花粉。由此可見，以誘導(dǎo)產(chǎn)生的2n花粉比率為評價(jià)指標(biāo)，ch-12處理中各因素組合為最佳，誘導(dǎo)產(chǎn)生的2n花粉比率是所有處理中最高的(可獲得高達(dá)12.4％的日本栗2n花粉)。換言之，在以獲得大頻率2n花粉為目的的前提下，選用誘導(dǎo)藥劑，誘導(dǎo)藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜，于4月25日處理花序，并保持藥劑浸漬花序72h的處理，可以取得理想的試驗(yàn)結(jié)果。表2日本栗2n花粉誘導(dǎo)效果處理代號2n花粉比率(％)處理代號2n花粉比率(％)ch-10.33uvch-321.13mnopqch-20.4tuvch-332.86ghich-31.26mnoch-340.66qrstuch-40.6rstuvch-351.93klch-51.53lmch-365cdch-64.8dech-370.33uvch-70.33uvch-380.46tuvch-81nopqrsch-391.33mnoch-92.86ghich-400.33uvch-100.73pqrstuch-411.13mnopqch-112.66hijch-423ghch-1212.4ach-430.26uvch-130.26uvch-440.66qrstuch-140.86opqrstch-453.26fgch-153.53fch-460.73pqrstuch-160.6rstuvch-471.33mnoch-172.2jkch-484.53ech-185.4cch-490.26uvch-190.73pqrstuch-500.4tuvch-202.26jkch-511.4mnch-214.6dech-520.33uvch-221.06mnopqrch-530.53stuvch-232.86ghich-542.2jkch-247.6bch-550.26uvch-250.13vch-560.66qrstuch-260.73pqrstuch-572.46jkch-271.93klch-580.86opqrstch-280.33uvch-591.2mnopch-291nopqrsch-602.8ghich-302.26jkck0.067wch-310.46tuv注:表中數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(α＝0.05)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及實(shí)例，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對本方法的判別模型作出一定的補(bǔ)充和優(yōu)化。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3