本發(fā)明涉漁業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說是利用人工雜交的方法產(chǎn)生不育黃姑魚的方法,尤其是涉及一種雜交不育黃姑魚的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

性腺不育的魚類在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較高的科研和應(yīng)用價值。首先，性腺不育的魚類往往表現(xiàn)出生長快、出肉率高等優(yōu)勢；其次，性腺不育的魚類能夠降低因魚類逃逸到自然界帶來的生態(tài)風(fēng)險；再者，性腺不育的魚類在科研中具有特別的應(yīng)用，如在魚類人工“代孕”研究中，性腺不育的魚類作為受體產(chǎn)生其他魚種的精子或卵子。因此，探索產(chǎn)生性腺不育魚類的方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要意義。

通常，可以通過人工雜交、三倍體誘導(dǎo)、基因敲除（降）等方法產(chǎn)生性腺不育的魚類。其中，人工雜交作為經(jīng)典的育種方法之一，由于操作簡便而受到研究者的普遍重視。人工雜交是利用不同種間、屬間或科間的魚種進行雜交產(chǎn)生后代。人工雜交成功與否、后代是否能夠成活或不育，取決于用于雜交的父母本遺傳物質(zhì)的相容性，雜交的結(jié)果往往很難預(yù)測。因此，獲得完全不育的雜交后代需要大量的試驗篩選、驗證。我們通過箕作黃姑魚(Nibea mitsukurii)、黃姑魚(Nibea albiflora)、銀姑魚 (Pennahia argentata)、日本黃姑魚(Argyrosomus japonicus)、大黃魚(Larimichthys crocea)、小黃魚(Larimichthys polyactis)等進行多個組合的雜交試驗，篩選出箕作黃姑魚和銀姑魚的雜交組合，雜交后代能夠完全不育，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景，而且能夠作為人工“代孕”的受體，具有較高的科研應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有便于現(xiàn)場操作、安全可靠、簡單易行，成活率高、抗逆性強、完全不育的利用人工雜交的方法產(chǎn)生性腺不育黃姑魚的方法。

本發(fā)明實現(xiàn)其發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是：一種雜交不育黃姑魚的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟：

（1）親魚的培育

選擇箕作黃姑魚雌魚和銀姑魚雄魚作為親魚，分別對箕作黃姑魚和銀姑魚進行營養(yǎng)強化和光溫調(diào)控，促進其性腺同步成熟；培育時采用升溫培育，水溫由18℃逐漸升到24℃；在親魚培育池中挑選性腺發(fā)育較好的親本，挑選后的親本置于黑布遮住桶中，保持培育水溫為22—24℃；

（2）雌性箕作黃姑魚的人工催產(chǎn)

對雌性箕作黃姑魚進行催產(chǎn)，選用注射用促黃體素釋放激素A2作為催產(chǎn)劑，注射劑量為1kg親本注射1.5—2μg催產(chǎn)素，親本的培育溫度為24℃時催產(chǎn)效應(yīng)時間為28—32h；對箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采卵；

（3）人工采集銀姑魚精液

采用人工擠壓腹部法采集銀姑魚精液，用經(jīng)消毒的干燥玻璃滴管吸取干凈精液，用經(jīng)消毒的干燥玻璃滴管吸取干凈精液，保存于1.5 mL離心管中，置于冰上；

（4）箕作黃姑魚♀×銀姑魚♂人工雜交

將箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采集的魚卵，放入干燥燒杯中；將采集的銀姑魚的新鮮精液滴入未受精的魚卵中，干法受精，用適量海水激活后攪動使其充分混勻，然后加入2—5倍于卵量體積的海水完成受精過程；

（5）受精卵孵化

將受精卵放入500L玻璃水槽中孵化，水溫為24℃，鹽度28～32‰，pH8.0～8.2，靜水微充氣；

（6）雜交苗的培育

受精卵孵化后進行雜交苗的培育，培育分為仔魚期、稚魚期、幼魚期，培育水溫為20～24℃，鹽度28～32‰，pH8.0～8.2，換水量和充氣量隨魚苗生長而逐漸增大；苗種培育采用的餌料依次為輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體、配合飼料；

（7）檢驗雜交苗不育的成功率

待雜交苗培育至3月齡時，解剖取性腺，利用波恩式液固定，采用組織切片觀察不育情況。

本發(fā)明采用雜交的方法培育不育的黃姑魚，培育出的黃姑魚具有成活率高、抗逆性強、完全不育等特點，該方法具有簡單易行的優(yōu)點，培育出的不育黃姑魚在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較好的推廣應(yīng)用前景，而且可以作為人工“代孕”的受體，具有非常重要的應(yīng)用價值。

作為優(yōu)選，步驟（1）親魚的培育中，箕作黃姑魚和銀姑魚分別養(yǎng)殖于1噸水槽內(nèi)，每個水槽養(yǎng)殖30—40尾，采用沙濾海水持續(xù)微流水，每天投喂1次；水槽覆蓋塑料棚保溫，水溫保持在18℃以上，當(dāng)水溫低于18℃時，采用加熱棒加熱維持水溫在18℃以上；在水槽上方1m處安裝1只60W的日光燈，使燈光在培育池的水面分布均勻，光照強度為50～100Lx；親魚催產(chǎn)前4周，水溫每隔5天升高1℃，逐漸將水溫由18℃升至24℃；光強每隔5天增加1小時。

作為優(yōu)選，步驟（2）雌性箕作黃姑魚的人工催產(chǎn)中，具體操作為：在雌性箕作黃姑魚進行催產(chǎn)28h后，對箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采卵，雙手在魚腹部兩側(cè)同時均勻用力，自后而前徐徐擠壓腹部，使卵子流出，使用500mL 玻璃燒杯接取卵子，將卵放入干燥的燒杯中。

作為優(yōu)選，步驟（6）雜交苗的培育：仔魚期的培育，1～15日齡，采用加水培育，每天加水為池水的10%～20%，培育密度2～3萬尾/m³，微弱充氣，水溫保持在24℃；

稚魚期的培育，15～25日齡，每天加水兩次，每次換水量為池水的50%～100%，培育密度0.5～1萬尾/m³，每兩天吸污1次，培育池水溫24℃；

幼魚期的培育，25日齡后，每天換水一次，換水量100%，培育密度視魚體大小而定，培育溫度為自然海水溫度。

作為優(yōu)選，步驟（4）雜交苗的培育中，魚苗培育采用的餌料依次為輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體、配合飼料；投喂方法為：魚苗1～2日齡不投餌，3～14日齡投喂輪蟲，初孵仔魚3日齡開口攝食，開口餌料為褶皺臂尾輪蟲，投喂前用高濃度小球藻強化12小時以上；15～20日齡投喂輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體，20～25日齡投喂鹵蟲無節(jié)幼體和配合飼料，所述輪蟲的投喂密度為20～40個/mL，所述鹵蟲無節(jié)幼體的投喂密度為5～15個/mL；26日齡即開始馴化投喂配合飼料，31日齡完全投喂配合飼料，馴化期采用少量多次的投喂方法，馴化成功后配合飼料的投喂量視魚苗的消化道飽滿程度和觀察池底殘餌情況決定。

作為優(yōu)選，步驟（7）檢驗雜交苗不育的成功率中，雜交苗培育至3月齡時，隨機抽取30尾，解剖后取性腺，性腺均呈現(xiàn)細(xì)線狀；將性腺采用波恩式液固定12h后換采用70%酒精保存；將性腺樣品脫水、石蠟包埋后進行組織切片，切片后的性腺形態(tài)無精小葉或卵巢結(jié)構(gòu)，故鑒定為性腺不育。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明在反復(fù)試驗的基礎(chǔ)上，篩選出箕作黃姑魚和銀姑魚的雜交組合，雜交后代能夠完全不育，從而建立一種大規(guī)模培育不育黃姑魚的方法，該方法具有便于現(xiàn)場操作、安全可靠、簡單易行等優(yōu)點。培育出的不育黃姑魚在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較好的推廣應(yīng)用前景，而且可以作為人工“代孕”的受體，具有非常重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中三月齡雜交黃姑魚的一種結(jié)構(gòu)示意圖;

圖2是本發(fā)明中三月齡雜交黃姑魚性腺的一種結(jié)構(gòu)示意圖;

圖3是本發(fā)明中雜交黃姑魚性腺組織切片。

具體實施方式

下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細(xì)說明。

實施例1：

一種性腺不育黃姑魚的培育方法，該方法包括以下步驟：

（1）親魚的培育

選擇箕作黃姑魚雌魚和銀姑魚雄魚作為親魚，分別對箕作黃姑魚和銀姑魚進行營養(yǎng)強化和光溫調(diào)控，促進其性腺同步成熟；培育時采用升溫培育，水溫由18℃逐漸升到24℃；在親魚培育池中挑選性腺發(fā)育較好的親本，挑選后的親本置于黑布遮住桶中，保持培育水溫為22—24℃；

（2）雌性箕作黃姑魚的人工催產(chǎn)

對雌性箕作黃姑魚進行催產(chǎn)，選用注射用促黃體素釋放激素A2作為催產(chǎn)劑，注射劑量為1kg親本注射1.5—2μg催產(chǎn)素，親本的培育溫度為24℃時催產(chǎn)效應(yīng)時間為28—32h；對箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采卵；

（3）人工采集銀姑魚精液

采用人工擠壓腹部法采集銀姑魚精液，用經(jīng)消毒的干燥玻璃滴管吸取干凈精液，用經(jīng)消毒的干燥玻璃滴管吸取干凈精液，保存于1.5 mL離心管中，置于冰上；

（4）箕作黃姑魚♀×銀姑魚♂人工雜交

將箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采集的魚卵，放入干燥燒杯中；將采集的銀姑魚的新鮮精液滴入未受精的魚卵中，干法受精，用適量海水激活后攪動使其充分混勻，然后加入5倍于卵量體積的海水完成受精過程；

（5）受精卵孵化

將受精卵放入100L玻璃水槽中孵化，水溫為24℃，鹽度28～32‰，pH 8.0～8.2，靜水微充氣；

（6）雜交苗的培育

受精卵孵化后進行雜交苗的培育，培育分為仔魚期、稚魚期、幼魚期，培育水溫為20～24℃，鹽度28～32‰，pH8.0～8.2，換水量和充氣量隨魚苗生長而逐漸增大；苗種培育采用的餌料依次為輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體、配合飼料；

（7）檢驗雜交苗不育的成功率

待雜交苗培育至3月齡時，解剖取性腺，利用波恩式液固定，采用組織切片觀察不育情況。

具體操作如下：

（1）箕作黃姑魚和銀姑魚分別養(yǎng)殖于1噸水槽內(nèi)，每個水槽養(yǎng)殖30—40尾，采用沙濾海水持續(xù)微流水，每天投喂1次。水槽覆蓋塑料棚保溫，水溫保持在18℃以上，當(dāng)水溫低于18℃時，采用加熱棒加熱維持水溫在18℃以上。在水槽上方1m處安裝1只60W的日光燈，盡量使燈光在培育池的水面分布均勻，光照強度為50～100Lx。親魚催產(chǎn)前4周，水溫每隔5d升高1℃，逐漸將水溫由18℃升至24℃；光強每隔5d增加1h。

（2）在親魚培育池中挑選性腺發(fā)育較好的親本進行人工催產(chǎn)，挑選后的親本置于黑布遮住的水槽中。選取10尾雌性箕作黃姑魚進行催產(chǎn)，催產(chǎn)劑選用的是寧波第二激素廠生產(chǎn)的注射用促黃體素釋放激素A2，稀釋液用復(fù)方氨基酸溶液配制，注射劑量為1kg親本注射1.5-2μg催產(chǎn)素。

（3）催產(chǎn)28h后，對箕作黃姑魚采用人工擠壓腹部法采卵，具體操作為：用海水浸濕的毛巾包裹魚體，露出腹部生殖孔位置并用脫脂棉將生殖孔及周圍擦拭干凈，固定好親魚后，雙手在魚腹部兩側(cè)同時均勻用力，自后而前徐徐擠壓腹部，即有卵子流出，使用500mL 玻璃燒杯接取卵子，將卵放入干燥的燒杯中。10尾箕作黃姑魚有8條獲得卵子，催產(chǎn)成功率80%。采用同樣的人工擠壓腹部法采集銀姑魚精液，用經(jīng)消毒的干燥玻璃滴管吸取干凈精液，保存于1.5 mL離心管中并置于冰上，將精液加入未受精卵中（精液約0.5～1mL），干法受精，輕輕將兩者搖動混勻，然后加入5倍于卵量體積的海水完成受精過程。

（4）受精卵孵化

將受精卵放入500L玻璃水槽中孵化，水溫為24℃，鹽度28～32‰，pH8.0～8.2，靜水微充氣。

（5）雜交苗的培育

雜交苗的培育過程分為仔魚期(1～15日齡)、稚魚期(15～25日齡)和幼魚期（25日齡以后）。仔魚期采用加水培育，每天加水為池水的10%~20%，培育密度2~3萬尾/m³，微弱充氣，水溫保持在24℃。

稚魚期（15～25日齡），每天加是兩次，每次換水量為池水的50%~100%，培育密度0.5~1萬尾/m3，每兩天吸污1次，培育池水溫24℃。

幼魚期（25日齡后），每天換水一次，換水量100%，培育密度視魚體大小而定，培育溫度為自然海水溫度。

仔魚期和稚魚期培育的鹽度均為28～32‰，pH8.0～8.2。

魚苗培育采用的餌料依次為輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體、配合飼料。投喂方法為：魚苗1~2日齡不投餌，3~14日齡投喂輪蟲，初孵仔魚3日齡開口攝食，開口餌料為褶皺臂尾輪蟲，投喂前用高濃度小球藻強化12小時以上；15~20日齡投喂輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體，20~25日齡投喂鹵蟲無節(jié)幼體和配合飼料，所述輪蟲的投喂密度為20~40個/mL，所述鹵蟲無節(jié)幼體的投喂密度為5~15個/mL；26日齡即開始馴化投喂配合飼料，31日齡完全投喂配合飼料，馴化期采用少量多次的投喂方法，馴化成功后配合飼料的投喂量視魚苗的消化道飽滿程度和觀察池底殘餌情況決定。

（6）雜交苗培育至3月齡時，隨機抽取30尾，解剖后取性腺，性腺均呈現(xiàn)細(xì)線狀（見圖1、圖2）。將性腺采用波恩式液固定12h后換采用70%酒精保存。將性腺樣品脫水、石蠟包埋后進行組織切片，切片后的性腺形態(tài)無精小葉或卵巢結(jié)構(gòu)，故鑒定為性腺不育（見圖2）。

該雜交不育黃姑魚的生產(chǎn)方法，分別以箕作黃姑魚為母本，銀姑魚為父本，促進其性腺同步成熟；挑選性腺發(fā)育良好的箕作黃姑魚和銀姑魚親魚，注射用促黃體素釋放激素A2對箕作黃姑魚進行人工催產(chǎn)；采集箕作黃姑魚卵子和銀姑魚精子，進行干法受精；雜交仔、稚、幼魚培育和性腺觀察。采用雜交的方法培育性腺不育的黃姑魚，培育出的黃姑魚具有成活率高、抗逆性強、完全不育等特點，該方法具有簡單易行的優(yōu)點，培育出的性腺不育的在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較好的推廣應(yīng)用前景，而且可以作為人工“代孕”的受體，具有非常重要的應(yīng)用價值。