本發(fā)明涉及的是利用茶樹內(nèi)生草螺菌促進(jìn)茶葉中有機硒富集技術(shù)，特別是一種應(yīng)用茶樹內(nèi)生草螺菌轉(zhuǎn)化植物從土壤中吸收的有毒硒酸鹽/亞硒酸鹽并促進(jìn)茶葉中有機硒富集的方法。

背景技術(shù)：

硒是人和動物必需的微量元素之一，與機體的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有著十分密切的關(guān)系。土壤中的硒主要是以seo4^2-和seo3^2-的形式存在并溶于水，可通過根部吸收直接進(jìn)入植物體內(nèi)并轉(zhuǎn)化為有機硒。有機硒才能被人體或動物有效利用。但是，高濃度的硒酸鹽對動、植物有明顯的毒性。鑒于硒具有高效抗氧化、抗癌、中和重金屬毒性、高吸收利用率等獨特的生物學(xué)效應(yīng)，在家養(yǎng)動物生產(chǎn)、醫(yī)藥、保健品方面具有廣泛的應(yīng)用前景。在這種背景下，硒茶作為保健飲料越來越受到人們的青睞?？墒?，我國74%的地區(qū)缺硒或低硒，只有少數(shù)地區(qū)為富硒區(qū)，如湖北恩施、貴州開陽、陜西紫陽、湖南桃源和新田、廣西永福、青海平安等。除了上述地區(qū)種植的茶葉可能含硒外，其它地區(qū)的茶葉中都不含硒。既使在富硒地區(qū)，周邊含硒量低的區(qū)域種植的茶葉含硒量仍極低。為了提高茶葉中硒的含量，人們通常使用硒肥料或葉面噴灑亞硒酸鈉。長期使用硒肥或葉面噴灑亞硒酸鈉可能導(dǎo)致土壤、水體的硒污染。葉面噴灑亞硒酸鈉還可能導(dǎo)致亞硒酸鈉直接進(jìn)入茶葉內(nèi)，未還原的se⁴⁺仍具有較強的生物毒性。為了減少環(huán)境污染、加快茶樹對土壤或硒肥中硒酸鹽的轉(zhuǎn)化利用和促進(jìn)茶葉中硒的富集，我們通過扦插苗繁殖，將茶樹內(nèi)生草螺菌引入茶樹體內(nèi)并與之共生以促進(jìn)茶葉中有機硒富集，并建立了一種應(yīng)用茶樹內(nèi)生草螺菌轉(zhuǎn)化植物從土壤中吸收的硒酸鹽以促進(jìn)茶葉中有機硒富集的新技術(shù)。

茶樹內(nèi)生草螺菌是一種茶樹共生專一性強的內(nèi)生細(xì)菌，無致病性。文獻(xiàn)“兩株茶樹內(nèi)生草螺菌的微生物學(xué)特性”（王婷等，微生物學(xué)報2014第4期，2014.04.04，p424-432）詳細(xì)敘述了茶樹內(nèi)生草螺菌的微生物學(xué)特性，但未涉及茶樹內(nèi)生草螺菌的應(yīng)用。近期我們發(fā)現(xiàn)茶樹內(nèi)生草螺菌擁有完整的硒代謝途徑，具有強的硒還原能力。在硒酸鹽的刺激下，細(xì)菌能高效表達(dá)硒酶、硒醚水二瀲酶、硫氧還原蛋白還原酶、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶。這些酶能有效地催化硒酸鹽/亞硒酸鹽的還原，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物如硒化氫、硒磷酸、l-硒代半胱氨酸、r-s-谷光甘肽、乃至終產(chǎn)物硒蛋白可供茶樹直接利用，促進(jìn)茶葉中有機硒的富集。由于茶樹內(nèi)生草螺菌具有強的硒還原能力，定殖后的茶樹內(nèi)生草螺菌還能有效降低根部吸收的硒酸鹽對茶樹的生理毒害，有利于茶樹體內(nèi)硒的富集和向上轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

目前，生產(chǎn)中為了提高茶葉中硒的含量，通常使用硒肥料或葉面噴灑亞硒酸鈉，長期使用硒肥或葉面噴灑亞硒酸鈉可能導(dǎo)致土壤、水體的硒污染；葉面噴灑亞硒酸鈉還可能導(dǎo)致亞硒酸鈉直接進(jìn)入茶葉內(nèi)，未還原的se⁴⁺仍具有較強的生物毒性。針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，發(fā)明人提出一種利用茶樹內(nèi)生草螺菌與茶樹共生促進(jìn)茶葉中有機硒富集的方法，使用茶樹內(nèi)生草螺菌與茶樹的扦插桿共培養(yǎng)，使草螺菌通過切口進(jìn)入扦插桿內(nèi)并定殖，茶樹扦插苗成活后移栽在含硒土壤或施用硒肥的土壤里，定殖的茶樹內(nèi)生草螺菌有效地促進(jìn)茶樹對吸收進(jìn)入體內(nèi)的硒酸鹽的轉(zhuǎn)化利用，提高茶葉中有機硒的含量。

一種利用茶樹內(nèi)生草螺菌促進(jìn)茶葉富硒的應(yīng)用技術(shù)，其特征在于：通過茶樹扦插條在草螺菌培養(yǎng)液中的浸泡，將草螺菌定殖于茶苗體內(nèi)，使茶樹從土壤中吸收的硒酸鹽或亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化成無毒的零價單質(zhì)硒、有機硒或硒蛋白，實現(xiàn)茶葉中有機硒的富集；所述的該應(yīng)用技術(shù)包括如下的步驟：

（1）茶樹內(nèi)生草螺菌的活化與培養(yǎng)

按文獻(xiàn)“兩株茶樹內(nèi)生草螺菌的微生物學(xué)特性”（王婷等，微生物學(xué)報2014第4期，2014.04.04，p424-432）的方法活化與培養(yǎng)細(xì)菌。取-80°c保存的茶樹內(nèi)生草螺菌菌種，接種5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5gnacl，10μg/ml壯觀霉素，5μg/ml氨芐青霉素，加水至1000ml)，每分鐘150轉(zhuǎn)搖動，28°c培養(yǎng)過夜。將活化后的菌液以1:100的體積比接入新鮮的lb液體培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，10μg/ml壯觀霉素，5μg/ml氨芐青霉素，加水至1000ml，ph7.2-7.4)中，搖床轉(zhuǎn)速每分鐘250轉(zhuǎn)，溫度為37°c培養(yǎng)至od600=0.8-1.0，并加入1%甘油備用。

（2）茶樹內(nèi)生草螺菌處理與扦插苗繁殖

按常規(guī)方法選擇生長健壯的茶樹當(dāng)年生枝條作扦插條，扦插條長7-15厘米，頂部在側(cè)芽上方平切，保留頂部1-2片葉，基部在側(cè)芽下方平切。然后用水將上述細(xì)菌培養(yǎng)液按1:1體積比稀釋，放入浸泡盆內(nèi)，再放入扦插條。扦插條頂部朝上，不讓浸泡液淹沒扦插條頂部。常溫浸泡扦插條1-3小時，讓草螺菌充分接觸扦插條下端切口處，并通過虹吸作用促進(jìn)草螺菌進(jìn)入扦插條內(nèi)。浸泡后在苗床進(jìn)行扦插，扦插后按常規(guī)苗莆田間管理方法進(jìn)行管理。

（3）扦插苗移栽

待上述處理過的扦插苗成活后，移栽至含硒或施有硒肥的花缸或大田茶園土壤里，移栽后的茶苗管理按常規(guī)田間管理方法進(jìn)行管理。

（4）茶樹硒含量的檢測

首先將土樣或收集的茶樹樣本編號并放置在干凈臺面上，去除石塊等雜物，用流動的自來水洗凈植株，再用去離子水清洗3次。茶樹樣本則按根、莖、葉3部分分割，置于干凈的玻璃容器內(nèi)并放入70°c恒溫烘箱中烘干。各類樣品經(jīng)研缽研磨粉碎，過100目篩后裝袋備用。

準(zhǔn)確稱取1克樣品,置于玻璃消化管中，沿壁準(zhǔn)確緩慢加入10ml硝酸-高氯酸(hno3:hclo4=4:1)混合液，并輕輕搖晃分散樣品。對照則取1ml超純水于消化管內(nèi)，同樣加入10ml硝酸-高氯酸混合液，輕輕搖晃均勻。管口蓋上彎頸小漏斗，放置過夜。然后將消化管置于鐵絲籠中，放入溫度為180℃的油鍋中。待消化管中棕紅色氣體放出后，不時晃動鐵絲籠和消化管，保持受熱均勻。消煮60min左右后移出消化管。當(dāng)消化管的溫度完全降至室溫后，打開彎頸小漏斗，準(zhǔn)確加入10ml鹽酸溶液(hcl:超純水=1:1)，輕輕搖晃混合均勻。將消化管內(nèi)的消化物倒入50ml容量瓶中，并用超純水少量多次洗凈消化管內(nèi)部及小漏斗,收集洗滌液并合并至容量瓶中,最后用超純水定容至50ml，靜置過夜。

從50ml容量瓶中取5.0ml澄清上層液體至干凈的25ml容量瓶中，準(zhǔn)確加入2.5ml鹽酸溶液(hcl:超純水=1:1)和1.0ml10%鐵氰化鉀溶液，用超純水定容至25ml，并混合均勻。此為待測溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制:先取1.0ml0.1mg/l硒標(biāo)準(zhǔn)液，用超純水定容至100ml。再按比例取不同體積的硒溶液于25ml比色管中并用超純定容至10ml，硒的終濃度分別為0.0μg/l、4.0μg/l、8.0μg/l、12.0μg/l、16.0μg/l、20.0μg/l。再分別加2.5ml鹽酸溶液(hcl:超純水=1:1)和1.0ml鐵氰化鉀溶液，混合均勻即為標(biāo)準(zhǔn)曲線待測液。所有處理后的樣品均在帶硒空心陰極燈的原子熒光光譜儀上測定,獲得數(shù)據(jù)并匯制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)待測樣品的讀數(shù)減去對照的讀數(shù)的差值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測樣品的含硒值,再乘以稀釋倍數(shù)即為待測樣品中硒含量。每個樣品測量重復(fù)三次。

相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有獨特的優(yōu)點：

1、茶樹內(nèi)生草螺菌是茶樹專一性強的內(nèi)生細(xì)菌，與茶樹互惠共生無致病性。它具有強的還原能力,能有效地將硒酸鹽還原成亞硒酸鹽，并進(jìn)一步還原成零價單質(zhì)硒（se⁰）或合成有機硒。本發(fā)明充分利用了茶樹內(nèi)生草螺菌這一生物學(xué)特性，將茶樹內(nèi)生草螺菌導(dǎo)入茶苗體內(nèi)定殖,在茶樹體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化硒酸鹽或亞硒酸鹽,一方面降低根部吸收的硒酸鹽對茶樹的生理毒害,另一方面向茶樹提供硒代謝產(chǎn)物供茶樹直接利用，促進(jìn)茶葉中有機硒的富集，利用這一技術(shù),無論在低硒、高硒土壤或使用硒肥種植的茶樹，茶葉中硒含量可提高2-3倍。

2、本發(fā)明結(jié)合茶樹栽培技術(shù),通過簡單的浸泡方法將茶樹內(nèi)生草螺菌導(dǎo)入茶苗后,草螺菌在茶苗內(nèi)定殖且與茶樹共生,隨著茶樹的生長一直保留在植株體內(nèi),無需反復(fù)接種，極大的節(jié)省勞動力。

3、整個技術(shù)流程是根據(jù)目前大田茶樹栽培設(shè)計的,易于放大生產(chǎn)規(guī)模，操作簡單易學(xué)，無需特殊管理，茶葉中硒富集效果顯著。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中含硒土壤(硒含量為0.622mg/kg)種植茶苗的實驗結(jié)果。圖1-a為直接注射接種茶樹內(nèi)生草螺菌后茶樹根、莖、葉中的硒含量；圖1-b為茶樹內(nèi)生草螺菌處理扦插苗后茶樹根、莖、葉中的硒含量，與對照比較，茶葉中硒含量提高2-3倍。

圖2為本發(fā)明實施例2中含硒土壤(硒含量為1.5mg/kg)種植茶苗的實驗結(jié)果。圖2-a直接注射接種茶樹內(nèi)生草螺菌后茶樹根、莖、葉中的硒含量；圖2-b茶樹內(nèi)生草螺菌處理扦插苗后茶樹根、莖、葉中的硒含量，與對照比較，茶葉中硒含量提高2倍以上。

圖3為本發(fā)明實施例3中含硒土壤(硒含量為3.5mg/kg)種植茶苗的實驗結(jié)果。圖3-a直接注射接種茶樹內(nèi)生草螺菌后茶樹根、莖、葉中的硒含量；圖3-b茶樹內(nèi)生草螺菌處理扦插苗后茶樹根、莖、葉中的硒含量，與對照比較，茶葉中硒含量提高2倍以上。

具體實施方式

以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例1

取5公斤恩施含硒土壤，硒含量為0.622mg/kg，裝入花盆（盆口直徑28cm,盆底直徑25cm，高27cm）并栽入二年生櫧葉齊茶苗,每盆5株,置于自然環(huán)境條件下生長。待成活后長出3片新生葉,在莖的中下端(距土面3-5cm處)注射接種培養(yǎng)好的茶樹內(nèi)生草螺菌，接種量為200μl，細(xì)菌含量為1.02×10⁸cfu/ml。對照組則注射等體積的pbs（磷酸緩沖液ph7.2）。注射后傷口用無菌棉球封住。實驗組和對照組各為20盆，每組共計100株。接種后讓其繼續(xù)生長。在30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖1-a。

使用無硒咸寧土壤5公斤，研細(xì)后與含3.11mg硒酸鹽的水溶液混合拌勻并裝盆,停放一周后檢測土壤硒含量為0.622mg/kg。移栽茶樹內(nèi)生草螺菌處理后成活的一年生扦插苗，并置于自然環(huán)境條件下生長。對照組則移栽未經(jīng)茶樹內(nèi)生草螺菌處理的同齡茶樹扦插苗。在成活長出新葉后30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖1-b。

實施例2

在5公斤恩施含硒土壤(硒含量為0.622mg/kg)中加入4.39mg硒酸鹽使土壤硒含量為1.5mg/kg。裝盆后栽入二年生櫧葉齊茶苗,每盆5株,置于自然環(huán)境條件下生長。待成活后長出3片新生葉,在莖的中下端(距土面3-5cm處)注射接種培養(yǎng)好的茶樹內(nèi)生草螺菌，接種量為200μl，細(xì)菌含量為1.02×10⁸cfu/ml。對照組則注射等體積的pbs（磷酸緩沖液ph7.2）。注射后傷口用無菌棉球封住。實驗組和對照組各為20盆，每組共計100株。接種后讓其繼續(xù)生長。在30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖2-a。

使用無硒咸寧土壤5公斤，研細(xì)后加入7.5mg硒酸鹽,使土壤硒含量為1.5mg/kg。裝盆后移栽茶樹內(nèi)生草螺菌處理后成活的一年生扦插苗，并置于自然環(huán)境條件下生長。對照組則移栽未經(jīng)茶樹內(nèi)生草螺菌處理的同齡茶樹扦插苗。在成活長出新葉后30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖2-b。

實施例3

在5公斤恩施含硒土壤(硒含量為0.622mg/kg)中加入14.39mg硒酸鹽使土壤硒含量為3.5mg/kg。裝盆后栽入二年生櫧葉齊茶苗,每盆5株,置于自然環(huán)境條件下生長。待成活后長出3片新生葉,在莖的中下端(距土面3-5cm處)注射接種培養(yǎng)好的茶樹內(nèi)生草螺菌，接種量為200μl，細(xì)菌含量為1.02×10⁸cfu/ml。對照組則注射等體積的pbs（磷酸緩沖液ph7.2）。注射后傷口用無菌棉球封住。實驗組和對照組各為20盆，每組共計100株。接種后讓其繼續(xù)生長。在30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖3-a。

使用無硒咸寧土壤5公斤，研細(xì)后加入17.5mg硒酸鹽,使土壤硒含量為3.5mg/kg。裝盆后移栽茶樹內(nèi)生草螺菌處理后成活的一年生扦插苗，并置于自然環(huán)境條件下生長。對照組則移栽未經(jīng)茶樹內(nèi)生草螺菌處理的同齡茶樹扦插苗。在成活長出新葉后30、60、90和150天分別取樣，每組每次隨機取出25株，分根、莖、葉三部分收集樣本并檢測硒含量，結(jié)果見圖3-b。