本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及苗藥黑骨藤的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

苗藥黑骨藤(Periploca forrestil Schltr)，又名黑龍骨、滇杠柳等，為蘿藦科杠柳屬藤狀灌木，為苗族民間廣泛應(yīng)用于治療閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病的民族藥，其富含C21甾類、強(qiáng)心苷類、萜類等物質(zhì)。黑骨藤作為一種苗藥，其歷史悠久，早在西漢劉向的《世說新語說苑辨物》中便有：“吾聞古之為醫(yī)者，曰苗父，醫(yī)道精純，方劑獨(dú)特，為世人稱道”的記載，清代《馬關(guān)縣志風(fēng)俗篇》中就有“苗人良藥接骨祛風(fēng)，其效如神”的描述。由于苗族人經(jīng)常性含服黑骨藤，因此苗族人不易患風(fēng)濕類疾病。目前已開發(fā)出黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊、黑骨藤伸筋透骨液等治療風(fēng)濕類疾病中成藥。

鑒于目前國內(nèi)對(duì)黑骨藤的組織培養(yǎng)相關(guān)研究未見有報(bào)道，本發(fā)明選擇黑骨藤帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了苗藥黑骨藤的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。本發(fā)明具有技術(shù)性強(qiáng)、成本低廉、成苗快等特點(diǎn)，可直接用于黑骨藤種苗的工廠化生產(chǎn)，對(duì)于促進(jìn)苗藥黑骨藤的資源開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國內(nèi)外尚未有黑骨藤組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道，也未有黑骨藤組培快繁專利的申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種苗藥黑骨藤的組培快繁方法，本發(fā)明選擇黑骨藤帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了苗藥黑骨藤的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種苗藥黑骨藤的組培快繁方法，包括依次進(jìn)行的如下步驟：獲取黑骨藤的外植體、外植體誘導(dǎo)、不定芽的增殖培養(yǎng)、不定芽的生根培養(yǎng)、試管苗移栽；

所述的外植體誘導(dǎo)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基、3.0～5.0mg/L KT、1.5～2.0mg/L6-BA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的外植體誘導(dǎo)的方法為：將黑骨藤外植體經(jīng)清洗消毒處理后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25～28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)30～35天即可誘導(dǎo)形成不定芽。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，不定芽的增殖培養(yǎng)所用的增殖培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基、2.0～3.0mg/L KT、0.5～1.0mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的不定芽的增殖培養(yǎng)的方法具體為：將經(jīng)過外植體誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，不定芽的生根培養(yǎng)所用的生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、1.0～2.0mg/L GGR、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L瓊脂、0.1～0.3g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的不定芽的生根培養(yǎng)的方法為：從經(jīng)過增殖培養(yǎng)得到的不定芽的基部切取長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的試管苗移栽的方法具體為：將經(jīng)過生根培養(yǎng)得到的生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，所述的外植體誘導(dǎo)、不定芽的增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天。

在上述的苗藥黑骨藤的組培快繁方法中，獲取獲取黑骨藤的外植體的具體方法為：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理。

有益效果：

本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立了苗藥黑骨藤的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，本發(fā)明具有技術(shù)性強(qiáng)、成本低廉、成苗快等特點(diǎn)，其成活率達(dá)到95％以上，可直接用于黑骨藤種苗的工廠化生產(chǎn)，對(duì)于促進(jìn)苗藥黑骨藤的資源開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒15秒鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)30天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為93.1％，污染率低于10％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+5.0mg/L KT+2.0mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.4。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到6倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到93％以上。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+2.0mg/L GGR(生根粉)+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達(dá)到95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為10小時(shí)/天。

實(shí)施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒17秒鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒18分鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于27℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)33天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為90％，污染率低于8％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+4.0mg/L KT+1.7mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.8g/L活性炭，pH為5.6。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到5.3倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+2.5mg/L KT+0.8mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.6。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)27天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率為91.5％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.7mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.2g/L活性炭，pH為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為96.7％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為2300lx，光照時(shí)間為11小時(shí)/天。

實(shí)施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的黑骨藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒20秒鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)35天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率87.3％，污染率低于3％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+3.0mg/L KT+1.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.8。

(3)不定芽增殖：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到4倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+2.0mg/L KT+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到90％以上。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、椰子糠混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達(dá)到95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。